白細胞介素-10過表達巨噬細胞的極化和靶向成像研究

摘要：目的 "通過轉錄組測序和離體組織成像技術探討過表達白細胞介素（IL）-10對巨噬細胞極化和動脈粥樣硬化（AS）斑塊靶向能力的潛在影響。方法 "通過慢病毒感染構建過表達IL-10的巨噬細胞（IL-10M），進行轉錄組測序與差異基因分析，通過RT-qPCR和流式細胞術驗證巨噬細胞極化標志物的表達變化。通過尾靜脈注射，將IL-10M和ConM注入西方飲食造模后的ApoE-/-小鼠，利用主動脈大體和病理熒光成像觀察細胞對主動脈斑塊的靶向能力。結果 "轉錄組分析顯示，IL-10M與對照組（ConM）有1271個差異表達基因，其中與巨噬細胞極化相關的多個關鍵基因差異顯著。IL-10M中，M1型標志物Cd86、腫瘤壞死因子（Tnf）表達下調，Il-1beta表達上調；M2型標志物甘露糖受體1（Mrc1）表達上調，精氨酸酶2（Arg2）表達下調。RT-qPCR驗證發現IL-10M Mrc1、Tnf-alpha和Il-1beta表達與測序結果一致。流式分析結果顯示，與ConM相比，IL-10M組中CD86表達水平較低（Plt;0.05）。尾靜脈注射后，小鼠主動脈斑塊處可分別觀察到IL-10M和ConM 的熒光信號。結論 "過表達IL-10可調節巨噬細胞極化相關標志物的表達，并且可以不改變巨噬細胞對斑塊的靶向能力。

關鍵詞：白細胞介素-10；巨噬細胞；極化；靶向；動脈粥樣硬化

Investigation on the polarization and targeting imaging of macrophages overexpressing interleukin-10

WANG Mingyi1， 2， CHENG Yang2， 4， CAI Xingxuan2， 4， CHEN Jie1， 2， ZHOU Shanshan2， 3， ZHANG Luo1， 5， CHEN Yundai2， 3

1Medical School of Chinese PLA， Beijing 100853， China; 2Senior Department of Cardiology， the Sixth Medical Center of PLA General Hospital， Beijing 100048， China; 3Department of Cardiology， First Medical Center of PLA General Hospital， Beijing 100853， China; 4The Second Medical School of Southern Medical University， Guangzhou 510515， China; 5The Medical Innovation Research Division of PLA General Hospital， Beijing 100853， China

Abstract： Objective To comprehensively investigate the potential impact of interleukin?10 （IL?10） overexpression on macrophage polarization and their targeting capabilities towards atherosclerotic plaques through transcriptome sequencing and ex vivo tissue imaging techniques. Methods Transcriptome sequencing and differential gene analysis were performed after infecting macrophages with a lentivirus to induce overexpression of IL?10 （IL?10M）. The changes in expression levels of macrophage polarization markers were validated using RT?qPCR and flow cytometry. Subsequently， ApoE-/- mice were intravenously administered IL?10M and ConM via the tail vein after being fed a Western diet， and the targeting efficiency of cells towards aortic plaques was assessed through ex vivo and histological fluorescence imaging. Results Transcriptomic analysis revealed that there were 1271 differentially expressed genes in IL-10M compared to the control group （ConM）. The IL-10M group exhibited significant expression changes in several key genes associated with macrophage polarization. M1 phenotype markers Cd86 and tumor necrosis factor （Tnf） exhibited downregulation， while Il-1beta demonstrated upregulation in IL?10M; M2 phenotype marker mannose receptor 1 （Mrc1） displayed upregulation， whereas arginase?2 （Arg2） showed downregulation. RT-qPCR confirmed the expression of Mrc1， Tnf-alpha， and Il?1beta in IL?10M， consistent with the sequencing results. Furthermore， flow cytometry revealed a reduction in CD86 expression levels in IL?10M compared to ConM. After intravenous injection， fluorescence signals of IL?10M and ConM can be respectively observed at the site of atherosclerotic plaque in mice aorta. Conclusion The overexpression of IL?10 modulated the expression of markers associated with macrophage polarization while preserving their targeting ability towards plaques. This discovery establishes a scientific foundation for further investigation into the potential role of IL?10 in preventing and treating atherosclerosis， thereby supporting the development of novel anti-inflammatory therapeutic strategies.

Keywords： interleukin-10; macrophage; polarization; targeting; atherosclerosis

心血管病是我國居民死亡的主要原因之一［1］ ，其中動脈粥樣硬化（AS）是心血管病發病的關鍵病理基礎［2］。炎癥在AS的形成機制中扮演著重要角色，已有臨床試驗證明了抗炎藥物秋水仙堿［3］和抗白細胞介素（IL）-1β 單克隆抗體卡那奴單抗［4］可以通過降低炎癥水平為冠心病患者帶來益處。IL-10是一種主要由巨噬細胞和調節性T細胞等免疫細胞產生的抗炎細胞因子，能夠有效抑制活化的巨噬細胞和樹突狀細胞產生炎癥介質［5］，與冠心病患者的預后相關［6］。既往研究顯示，利用重組腺相關病毒或納米顆粒包裹IL-10的基因或蛋白，再將其導入ApoE-/-或Ldlr-/-小鼠中，可影響斑塊內炎癥從而抑制斑塊的進展［7， 8］。巨噬細胞是AS病變中最為豐富的免疫細胞，其功能狀態決定了斑塊炎性微環境的穩定，如何調控斑塊內巨噬細胞的功能狀態使其有利于斑塊消退是目前的研究熱點［9］。已知巨噬細胞受到Th2細胞產生的細胞因子IL-4和IL-13刺激，可以極化為抗炎的M2表型，分泌抗炎因子IL-10［10］，但是人為地從基因層面將巨噬細胞修飾為高表達IL-10的狀態是否有利于巨噬細胞更高效地發揮抗炎作用目前尚不完全清楚。有研究發現利用慢病毒將IL-10基因導入預先極化為促炎的M1型巨噬細胞后，腫瘤壞死因子（TNF）-α的分泌減少了1.5倍，而將IL-10導入未經處理的巨噬細胞后再進行炎性刺激，TNF-α的分泌減少了2.5倍［11］。為進一步明確這種修飾方法對巨噬細胞的影響，本研究擬采用轉錄組測序技術，利用其測序通量高、深度廣的特點，充分檢測過表達IL-10后巨噬細胞轉錄水平的變化特點，并在動物模型中導入過表達IL-10的巨噬細胞后進行成像分析，初步探索其對斑塊的靶向作用。

1 "材料與方法

1.1 "細胞培養

RAW264.7和HEK293T細胞在RPMI 1640培養基（Gibco）中培養，培養基中添加10%的胎牛血清（Gibco）、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2 "構建過表達IL-10的巨噬細胞

分別將搭載和未搭載小鼠IL-10基因的慢病毒載體與質粒混合后轉染HEK293T細胞。收集病毒顆粒，感染RAW264.7細胞。用含有5 μg/mL嘌呤霉素的培養基中篩選成功感染慢病毒的RAW264.7細胞。將感染攜帶IL-10基因的慢病毒的細胞標記為IL-10M，將感染空白病毒的細胞標記為ConM。

1.3 "轉錄組測序

IL-10M和ConM分別設置3個生物學重復。使用 TRIzol（Magen）裂解細胞，提取總 RNA。通過生物分析儀（Agilent）測定RNA完整值，RNA完整值gt;7的RNA樣本可用于構建文庫。按照文庫制備試劑盒（武漢ABclonal）說明制備雙端測序文庫。以mRNA片段作為模板，使用隨機引物和核糖核酸內切酶合成cDNA的第一鏈，使用DNA聚合酶 I、核糖核酸內切酶、緩沖液和dNTPs合成cDNA的第二鏈。連接接頭序列和合成的cDNA雙鏈，以便進行PCR擴增。PCR產物純化后使用生物分析儀評估其質量，使用 NovaSeq 6000測序平臺（Illumina）進行雙端150 bp測序。

1.4 "測序結果分析

1.4.1 "差異表達分析及富集分析 " 原始數據去除接頭序列后過濾掉低質量（整個reads中，堿基質量值≤25的堿基數量占比超過60%）和N（無法確定堿基信息）比例大于5%的reads，獲得適用于進一步分析的Clean reads。使用HISAT2.0工具將Clean reads與小鼠參考基因組數據進行比對，得到Mapped reads，以便進行后續分析。根據基因的長度計算每個基因的FPKM值，使用DESeq2工具進行差異表達基因的組間比較，篩選差異表達基因的閾值為：|Log2FoldChange|gt;1和Padjlt;0.05。依據篩選結果對差異表達基因繪制熱圖。使用R4.2進行KEGG通路富集分析，繪制氣泡圖。

1.4.2 "巨噬細胞極化關鍵基因的篩選 " 結合既往文獻［12， 13］，篩選出與巨噬細胞極化相關的關鍵信號分子和表型標志物，比較組間差異并繪制熱圖實現可視化。

1.5 "RT-qPCR檢測巨噬細胞極化標志物

使用RNAsimple Total RNA Kit（TOYOBO）提取mRNA。按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒（TOYOBO）使用說明進行反轉錄。將反轉錄得到的cDNA與SYBR Green Real-Time PCR RT Master Mix試劑盒（TOYOBO）混合，根據說明進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）。實驗至少重復3次，Beta-actin作為內參。使用2-??Ct法計算樣品的相對表達量。

設計的引物如下：

Mrc1： forward 5'-CTCTGTTCAGCTATTGGACGC-3'，

reverse 5'-TGGCACTCCCAAACATAATTTGA-3';

Arg1： forward 5'-CTGGGGATTGGCAAGGTGAT-3'，

reverse 5'-CAGCCCGTCGACATCAAAG-3';

Tnf?alpha： forward 5'-AGCCGATGGGTTGTACCTTG

-3'，

reverse 5'-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3';

Il-1beta： forward 5'-CTGCAGCTGGAGAGTGTGG-3'

reverse 5'-GGGGAACTCTGCAGACTCAA-3'，

Beta-actin： forward 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，

reverse 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.

1.6 "流式細胞術檢測巨噬細胞極化標志物

IL-10M和ConM采用PBS洗滌并懸浮于含0.5%胎牛血清的PBS溶液中。根據制造商的說明，采用抗甘露糖受體1（MRC1）、CD86、F4/80和CD11b的稀釋抗體孵育細胞。孵育好的細胞用流式細胞儀（BD）進行檢測，使用FACSDiva8.0.2進一步分析檢測結果。

1.7 "AS模型小鼠的構建

選擇8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，喂食含21%脂肪、50%碳水化合物、20%蛋白質和0.21%膽固醇的西方飲食飼料3月，以誘導AS。本研究所有動物實驗均經中國人民解放軍總醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號：2022-X18-109）。

1.8 "IL-10M對斑塊的靶向能力驗證

ApoE-/-小鼠造模完成后，經尾靜脈注射IL-10M和ConM。根據既往文獻報道，選擇1×107個細胞/針作為注射劑量。注射后6 h取主動脈進行離體熒光成像和病理切片熒光成像檢測IL-10M中綠色熒光蛋白的熒光信號，驗證IL-10M和ConM對斑塊的靶向性。

1.9 "統計學分析

采用GraphPad Prism9.0軟件及R studio4.2.1進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "差異基因分析

IL-10M和ConM有1271個差異基因，其中615個基因表達上調（圖1A）。KEGG富集分析結果顯示，顯著性排名前5的通路分別是：“造血細胞系”、“破骨細胞分化”、“細胞因子與細胞因子受體相互作用”、“系統性紅斑狼瘡”、“補體與凝血級聯反應”（圖1B）。

2.2 "巨噬細胞極化相關差異基因分析

Nfkbie、Ppargc1a、Lamtor2、Klf4、Klf1、Ccl5在IL-10M中表達上調，Irf4、Irf7、Tlr8、Ccl2、Cxcl16、Cxcl10、Pf4在IL-10M中下調。IL-10M中M1表型標志物Cd86、Tnf表達下調，而Il-1beta表達上調；M2表型標志物Mrc1表達上調，而精氨酸酶2（Arg2）表達下調（圖2、表1）。

2.3 巨噬細胞極化相關差異基因的實驗驗證

RT-qPCR結果顯示，IL-10M Mrc1表達上調，Tnf-alpha表達下調，Il-1beta表達上調（Plt;0.05），與測序結果一致；Arg1表達上調（Plt;0.05，圖3A～D）。流式分析結果顯示，IL-10M與ConM中，MRC1陽性細胞的比例相近（圖3E），而在IL-10M中，CD86陽性細胞的比例較低（Plt;0.05，圖3F）。

2.4 "基因編輯巨噬細胞對斑塊的靶向性驗證

注射1×107個IL-10M和ConM后6 h，小鼠心、肝、脾、肺、腎的離體成像結果顯示IL?10M和ConM的熒光信號主要集中在肝臟，其次是肺和脾，小鼠主動脈離體熒光成像結果顯示主動脈上也出現了強烈的熒光信號（圖4），對小鼠動脈的斑塊區域進行病理切片，同樣觀察到來自IL-10M和ConM的綠色熒光（圖5）。

3 "討論

本研究發現，轉錄組分析結果表明IL-10顯著影響巨噬細胞的基因表達模式，差異基因主要富集在巨噬細胞極化相關的信號通路上；IL-10M中，與巨噬細胞極化相關的關鍵基因變化顯著，其中M2型標志物Mrc1的基因表達顯著上調；細胞實驗進一步佐證了過表達IL-10可影響巨噬細胞極化標志物的表達。初步證明了IL-10M可經循環系統靶向到主動脈斑塊。

基于轉錄組測序結果的生物信息學分析是探索基因層面差異的常用方法。本研究對IL-10M和ConM的轉錄組數據進行分析，結果顯示兩者有1271個差異基因，KEGG富集分析結果顯示差異基因顯著富集的前5條通路均與免疫調節有關，這為后續分析提供了方向。巨噬細胞是AS病變中最為豐富的免疫細胞，具有高度異質性和可塑性，能對微環境信號作出快速反應［14］。既往研究根據巨噬細胞在病變中功能轉化的特點對其進行分類，M1型巨噬細胞為炎性巨噬細胞，在AS病變中會釋放促AS的細胞因子（如IL-6和IL?12）以及活性氧和氮物質，從而加劇斑塊中的氧化應激，通常在進展性斑塊中積聚，而M2型巨噬細胞為抗炎性巨噬細胞，在退行性斑塊中促進組織修復和重塑［15］。本研究篩選出轉錄組差異基因中與巨噬細胞極化有關的調控分子和標志物，并對標志物進行細胞學實驗驗證，結果顯示，與轉錄組分析結果一致，IL-10M中Mrc1的表達顯著上調。Mrc1是巨噬細胞M2型極化的標志物之一，與清道夫受體CD163共同屬于甘露糖受體，它們有助于清除斑塊內出血區域含甘露糖的血清糖蛋白和血紅蛋白-觸珠蛋白復合物［16， 17］。人頸動脈斑塊的免疫組織化學分析證實了斑塊中M1和M2巨噬細胞標記物的存在，有癥狀冠心病患者（n=34）的頸動脈斑塊中富含M1型巨噬細胞，而無癥狀患者（n=46）的斑塊中富含M2型巨噬細胞，其中甘露糖受體陽性巨噬細胞在遠離壞死核心的斑塊穩定區更為豐富［18， 19］。本研究中，IL?10M Mrc1的表達顯著升高，這一特點可能是IL?10M具有抗斑塊作用的理論依據。此外細胞實驗和轉錄組分析結果均顯示IL-10M中M1極化標志物Cd86和Tnf的表達下調，進一步證明了IL-10M可能具有M2表型巨噬細胞的特點。然而，轉錄組分析和細胞實驗結果均顯示IL-10M中M1極化標志物Il-1beta表達上調。IL-1β是炎癥反應的關鍵介質，對于宿主的防御反應和抵抗病原體至關重要［20］。IL-10M是采用慢病毒感染的方式構建的，雖然慢病毒作為基因編輯工具理論上不具備致病活性，但無法排除其作為外界刺激物引起細胞防御反應的可能，后續研究中可以通過控制慢病毒的劑量與感染時長來減少潛在的免疫防御反應。ARG1和ARG2是哺乳動物ARG的異構體，催化相同的反應，前者定位在胞質，后者定位在線粒體［21］，既往文獻報道IL-10可誘導巨噬細胞ARG1和ARG2的表達［22-24］，而本研究分析結果顯示IL-10M的Arg2表達下調、Arg1表達上調。目前關于巨噬細胞過表達IL-10對Arg2影響的報道仍然較少，這一現象值得在后續研究中進一步探索。

炎癥反應是AS相關疾病的潛在致病機制，IL-10作為一種抗炎的細胞因子，在炎性相關疾病中發揮保護作用［25］。有研究報道，血清中IL-10水平升高與C反應蛋白水平升高的急性冠脈綜合征患者預后良好相關［26］。臨床前研究提供了更多的證據，IL-10敲除（IL10-/-）的C57BL/6J小鼠相比野生型（IL10+/+）小鼠更容易形成斑塊［27］；敲除ApoE-/-小鼠髓系細胞的IL-10基因導致小鼠斑塊面積增大［28］。對IL-10-/-小鼠肌肉注射編碼IL-10的質粒DNA可顯著提高其IL-10水平，并抑制60%的斑塊形成［27］；利用重組腺相關病毒在ApoE-/-或Ldlr-/-小鼠中導入IL-10基因可以有效地抑制斑塊形成［7， 29］，利用納米顆粒或外泌體包裹IL-10蛋白或mRNA，再導入ApoE-/-或Ldlr -/-小鼠也可有效抑制斑塊進展和穩定斑塊［8， 30-32］。綜上，IL-10作為一種天然存在于體內且結構功能明確的抗炎因子，在AS干預中有廣泛的應用前景。本研究通過慢病毒感染的方法構建了能夠過表達IL-10的基因修飾巨噬細胞，利用同樣在體內天然存在的巨噬細胞作為IL-10發揮抗炎作用的載體。

鑒于IL-10M的極化特點可能有助于延緩斑塊進展，本研究隨后檢測了IL-10M對AS斑塊的主動靶向能力，結果顯示，IL-10M的綠色熒光出現在主動脈斑塊中，初步證明了IL-10M可以保有生理狀態下巨噬細胞受到斑塊局部炎癥信號招募的功能。在注射細胞后肝臟中顯示出更高的熒光信號強度，可見IL-10M進入體內后主要被肝臟的免疫網絡清除，因此為了使IL-10M能夠更多地靶向到斑塊，需要合適的注射劑量與頻次。目前已有諸多臨床前研究探索了巨噬細胞作為藥物載體在疾病模型中的干預效果。有研究同樣通過慢病毒感染的方式使RAW264.7細胞過表達IL-10、TGFRcFc、CD147等抗肺纖維化蛋白，隨后以小鼠體質量1×105細胞/g的劑量，每隔1周經鼻腔吸入1種修飾后細胞，模型小鼠的肺纖維化程度明顯減少［33］。另有研究對帕金森病模型小鼠靜脈注射搭載了神經營養因子質粒DNA的RAW264.7巨噬細胞（5×106個細胞/針）后21 d在小鼠腦半球中發現了注射的細胞，并表現出神經保護效果［34］。將表達兔羧酸酯酶的RAW264.7細胞經腹腔注射（2×106/針）注入Pan02小鼠胰腺癌模型，結果顯示，只有腫瘤內出現了RAW264.7的熒光信號，且小鼠的存活時間至少延長了10%［35］。RAW264.7細胞對巨噬細胞相關病變具有靶向能力，而IL-10可使巨噬細胞具備抗炎能力，因此IL-10M在AS的靶向治療中有潛在的應用前景。

綜上，過表達IL-10可調節巨噬細胞的極化表型，促進M2型標志物Mrc1的上調，這一特點可能是IL-10抗AS的潛在機制，結合IL-10M對斑塊的靶向能力，可以推測IL-10M有望成為治療AS的新型干預藥物，為AS的抗炎治療提供新的思路。

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（編輯：林 "萍）