CDKN2B基因多態性與2型糖尿病人群心肌梗死發病風險的關系

摘要" 目的：探討細胞周期依賴性激酶抑制基因（CDKN2B）單核苷酸多態性（SNP）與2型糖尿病（T2DM）人群心肌梗死發病風險的關系，以早期篩查T2DM病人中的心肌梗死高危人群。方法：選取山西醫科大學第一醫院收治的461例T2DM病人，其中114例合并心肌梗死病人作為觀察組，347例T2DM不合并冠心病及其他心臟病的病人作為對照組，以CDKN2B 基因rs3217992位點為遺傳標記，檢測研究對象的基因型，使用MassARRAY遺傳分析系統進行SNP分型。采用多因素Logistic 回歸分析基因多態性與心肌梗死的關系。結果：觀察組CDKN2B單核苷酸多態性rs3217992 A等位基因頻率較對照組增高（χ2＝9.36，P＝ 0.002）；多因素Logistic 回歸分析顯示，CDKN2B基因 rs3217992位點AG/AA基因型是T2DM人群心肌梗死發病的獨立危險因素。結論：CDKN2B 基因多態性與糖尿病人群心肌梗死風險相關，rs3217992位點可作為T2DM人群心肌梗死風險預測的有效遺傳因子。

關鍵詞" 2型糖尿病；心肌梗死；細胞周期依賴性激酶抑制基因2B；單核苷酸多態性

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.19.021

糖尿病（diabetes mellitus，DM）目前已經成為最常見的慢性疾病之一，其特征為胰島素產生不足或胰島素抵抗引起的高血糖，是一種代謝性疾病。國際糖尿病聯合會（IDF）估計我國糖尿病病人2021年超過1.4億人，2045年將達到1.74億人以上［1］。糖尿病導致死亡的主要原因為糖尿病的大血管并發癥，包括冠心病、心肌病、心律失常、猝死、腦血管疾病和外周動脈疾病［2］。因此，致力于防治糖尿病病人的心血管并發癥和降低其死亡率是非常必要的。

傳統的心血管疾病風險因素不能完全解釋糖尿病心血管疾病風險和心血管疾病死亡率的增加。大量證據表明，遺傳風險因素可以解釋2型糖尿病（T2DM）中無法解釋的心血管風險［3］。全基因組關聯（genome-wide association study，GWAS）研究發現，在9p21附近的細胞周期依賴性激酶抑制基因（cyclin-dependent kinase inhibitor 2b，CDKN2B）為糖尿病與心血管疾病的共享基因［4］。鑒于目前國內外研究其與糖尿病人群心肌梗死的關系較少報道，本研究著重探討 CDKN2B基因rs3217992多態性與T2DM人群心肌梗死風險的關系，為糖尿病人群心血管并發癥的防治提供參考。

基金項目" 山西省科技廳項目（No.202103021224401）；山西省回國留學人員科研資助項目（No.2021-158）

作者單位" 1.山西醫科大學（太原 030001）；2.山西醫科大學第一醫院（太原 030001）；3.武警山西總隊醫院

通訊作者" 張彥清，E-mail：lillyblooming@163.com

引用信息" 劉彥宏，張彥偉，岳毅，等.CDKN2B基因多態性與2型糖尿病人群心肌梗死發病風險的關系［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（19）：3569-3572.

1" 資料與方法

1.1" 一般資料

選取山西醫科大學第一醫院收治的461例T2DM病人，入選者均符合1999年世界衛生組織（WHO）提出T2DM診斷標準，其中 114例T2DM合并心肌梗死病人為觀察組，其余347例T2DM病人（不合并冠心病及其他心臟病）為對照組。心肌梗死診斷符合《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準（WS 319—2010）》。本研究經山西醫科大學倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》。所有研究對象均采用統一的調查問卷收集臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、高血壓病史、糖尿病史、高脂血癥病史、冠心病史、家族史等。

納入標準：符合T2DM診斷標準；知曉研究內容，且自愿簽署知情同意書。排除標準：肝腎功能嚴重異常者；精神異常無法配合檢查者；既往有冠心病之外的其他心臟病史者；住院期間死亡者。

1.2" 方法

采集所有受試者5 mL清晨空腹靜脈血，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，－20 ℃冰箱保存備用。將樣品取出并在室溫下解凍。采用標準流程，使用血液基因組blood genomic DNA mini kit試劑盒（太原萊博里生物技術有限公司）檢測。DNA制備過程：將200 μL血液樣本與20 pL蛋白酶K、200 pL緩沖GL在離心管沖充分混勻。細胞置于56 ℃孵育10 min，再加入200 μL無水乙醇進行短暫離心，將上述溶液全部加入備有收集管的吸附柱中，以1 200 r/min離心1 min，倒出廢液，將吸附柱放回收集管中。再加入500 μL緩沖液GW1，1 200 r/min離心1 min，重復上述步驟。室溫下放置數分鐘干燥后放入－80 ℃冰箱保存。

通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增目標序列，檢測出SNP位點信息。SNP基因分型使用MassARRAY遺傳分析系統（Sequenom，San Diego，CA，USA）進行。引物由軟件AssayDesigner 3.1設計，引物使用ABI Assayby-Design服務在線設計。

1.3" 統計學處理

采用SPSS 27.0軟件進行統計分析。采用χ2檢驗進行 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測。定性資料用例數、百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的定量資料以中位數和四分位數［M（P25，P75）］表示，采用非參數檢驗。應用多因素 Logistic 回歸分析 CDKN2B基因rs3217992多態性與北方T2DM人群心肌梗死風險的關系，并計算風險比值比（OR）及其95%置信區間（95% CI）值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" 兩組一般資料比較

觀察組年齡、體質指數（BMI）、代謝綜合征占比、高血壓占比高于對照組，糖尿病病程較對照組延長，差異均有統計學意義（P＜0.05）。兩組在性別、空腹血糖、高密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血癥占比方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2" 兩組 rs3217992 基因型及等位基因分布

兩組各基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。觀察組rs3217992 A等位基因頻率高于對照組（χ2＝9.36，P＝0.002）。詳見表2。

2.3" T2DM病人發生心肌梗死的多因素 Logistic 回歸分析

以是否合并心肌梗死為因變量，以基因多態性、年齡、BMI、代謝綜合征、高血壓、糖尿病病程為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，CDKN2B基因rs3217992位點 AG基因型、AA 基因型、代謝綜合征、年齡以及糖尿病病程與心肌梗死發病有關，是糖尿病病人發生心肌梗死的獨立危險因素。即AA基因型糖尿病病人發生心肌梗死的風險為GG基因型病人的5.175倍（OR＝5.175，P＜0.001），AG基因型為GG基因型的3.859倍（OR＝3.859，P＝0.002）。協變量分析顯示，病人確診糖尿病時間每增加1個月，相應風險提高0.018倍（OR＝1.018，P＜0.001）；病人年齡每增加1歲，相應風險提高0.082倍（OR＝1.082，P＜0.001）。詳見表3。

3" 討" 論

近年來，全基因組關聯研究已成為快速識別影響常見疾病易感性的遺傳變異的有力方法。在這方面，一些相關基因組顯示出高風險或具有保護作用。大規模全基因組關聯研究和臨床隊列研究調查了遺傳決定因素、低血糖和胰島素抵抗等因素對心血管疾病風險的影響，并解釋了T2DM 中的心血管疾病風險［3］。

rs3217992為9號染色體CDKN2B 和ANRLT（反義非編碼RNA）附近的單核苷酸變異。9p21位點附近存在INK4基因座。CDKN2A和CDKN2B是位于INK4位點的兩個相鄰位置，分別編碼細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑INK4家族的兩個成員p16INK4A和p15INK4B。CDKN2A和CDKN2B參與了在人類癌癥中失活的主要腫瘤抑制網絡，并影響關鍵生理過程［5］。這兩種蛋白質在細胞周期調節中都發揮著重要作用，通過在轉化生長因子-β（TGF-β）誘導的生長抑制中的作用，都與動脈粥樣硬化的發病機制有關［6-7］。Hannou等［8］綜述了通過功能基因組研究識別到CDKN附近基因產物（CDKN2A/B和ANRIL）在糖尿病與心血管疾病病理生理學中的功能。Rivera等［4］報道9p21.3位點與心血管疾病嚴重程度相關，并且9p21.3變異與心血管疾病嚴重程度的關聯數量因T2DM的存在與否而異。

ANRIL又稱CDKN2B-AS1，也存在于INK4基因組區間，以反義方向編碼一長鏈非編碼RNA，通過調控機制參與影響附近的CDKN2A和CDKN2B基因［9-11］。在基因調控、染色質組織、翻譯調控等方面發揮著重要作用。一項研究鑒定了248個與冠心病基因組共定位位點，強調了 mRNA 剪接的遺傳調控作為冠心病遺傳風險分子機制的重要性［12］。常見疾病的基因組相關性研究，以上基因已被確定為與T2DM相關的遺傳易感性位點［13-14］。有實驗研究表明，CDKN2B-AS1上調促進了血管平滑肌細胞（VSMC）細胞增殖和遷移，從而加重T2DM血管損傷后的內膜增生［15］。通過全基因組關聯研究發現ANRI也與動脈粥樣硬化性心血管疾病相關［16-18］。另外，ANRIL不同亞型也顯示出不同的風險性。一項關于高血壓病人的病例對照研究顯示，線性ANRIL有動脈粥樣硬化進展作用，觀察組圓形/線性比率也明顯降低［19］。ANRIL亞型的表達可能有助于預測冠心病結果，有研究表明，線性亞型與高危冠狀動脈旁路移植手術 CABG的全因死亡率有關，而 ANRIL 環狀亞型表達與氧化應激的減少相關［20］。聯合ANRIL預測支架內再狹窄（ISR）更有效，再狹窄病人lncRNA ANRIL上調［21］。相反，環狀ANRIL亞型已被證明具有動脈粥樣硬化保護作用［22］。

早期研究顯示，CDKN2B 基因中的rs3217992和 rs1063192 與男性受試者的心肌梗死相關。對于rs7027989 、rs3217992，與具有 GG 基因型的男性受試者相比，具有 AA 或 AG 基因型的男性受試者心肌梗死的風險分別增加了 1.26倍和 1.24倍［23］。這與本研究結果一致，攜帶A基因更容易并發心肌梗死。近年來，有研究發現，CDKN2B-AS1基因的多態性與我國人群早發三支血管病變（PTVD）及我國漢族群體散發性顱內動脈瘤（IA）發病率有關［24］，但rs3217992位點與不良事件無明顯相關［25］，可能存在人群異質性。

本研究結果表明，T2DM人群的基因型及等位基因頻率間比較，觀察組CDKN2B基因 rs3217992位點A等位基因頻率高于對照組，提示 CDKN2B基因與心肌梗死的發生存在關聯，A 等位基因可能是T2DM人群心肌梗死的易感等位基因（χ2＝9.36，P＝0.002）。經 Logistic回歸分析顯示，CDKN2B基因rs3217992位點AA/AG 基因型與心肌梗死發病有關，代謝綜合征、年齡以及糖尿病病程也與心肌梗死發病有關，是糖尿病病人發生心肌梗死的獨立危險因素。因此，更多地關注病人遺傳標記、年齡、糖尿病病程、是否合并各種代謝綜合征等可以更有效地預測糖尿病病人患心肌梗死的風險。

4" 小" 結

本研究初步證實了CDKN2B多態性與T2DM人群心肌梗死患病相關。但本研究存在以下不足：首先，僅進行單一位點檢測，對于該基因與心肌梗死關聯需要更多證據；其次，納入的人群樣本均來自我國北方漢族人群，未來的研究應包括多種族、多地域人口；另外還需要進一步的功能驗證，以確定以上基因位點突變對心肌梗死發病風險的作用機制。

參考文獻：

［1］" SUN H，SAEEDI P，KARURANGA S，et al.IDF Diabetes atlas：global，regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045［J］.Diabetes Research and Clinical Practice，2022，183：109119.

［2］" VIIGIMAA M，SACHINIDIS A，TOUMPOURLEKA M，et al.Macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus［J］.Current Vascular Pharmacology，2020，18（2）：110-116.

［3］" YUN J S，KO S H.Current trends in epidemiology of cardiovascular disease and cardiovascular risk management in type 2 diabetes［J］.Metabolism：Clinical and Experimental，2021，123：154838.

［4］" RIVERA N V，CARRERAS-TORRES R，RONCARATI R，et al.Assessment of the 9p21.3 locus in severity of coronary artery disease in the presence and absence of type 2 diabetes［J］.BMC Medical Genetics，2013，14：11.

［5］" GIL J，PETERS G.Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus：all for one or one for all［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7：667-677.

［6］" LOWE S W，SHERR C J.Tumor suppression by Ink4a-Arf：progress and puzzles［J］.Current Opinion in Genetics amp; Development，2003，13（1）：77-83.

［7］" KALININA N，AGROTIS A，ANTROPOVA Y，et al.Smad expression in human atherosclerotic lesions：evidence for impaired TGF-beta/Smad signaling in smooth muscle cells of fibrofatty lesions［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2004，24（8）：1391-1396.

［8］" HANNOU S A，WOUTERS K，PAUMELLE R，et al.Functional genomics of the CDKN2A/B locus in cardiovascular and metabolic disease：what have we learned from GWASs？［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，2015，26（4）：176-184.

［9］" FAROOQ U，NOTANI D.Transcriptional regulation of INK4/ARF locus by cis and trans mechanisms［J］.Frontiers in Cell and Developmental Biology，2022，10：948351.

［10］" JARINOVA O，STEWART A F，ROBERTS R，et al.Functional analysis of the chromosome 9p21.3 coronary artery disease risk locus［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2009，29（10）：1671-1677.

［11］" BURD C E，JECK W R，LIU Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk［J］.PLoS Genetics，2010，6（12）：e1001233.

［12］" AHERRAHROU R，LUE D，PERRY R N，et al.Genetic regulation of SMC gene expression and splicing predict causal CAD genes［J］.Circulation Research，2023，132（3）：323-338.

［13］" MACMILLAN H J，KONG Y H，CALVO-ROITBERG E，et al.High-throughput analysis of ANRIL circRNA isoforms in human pancreatic islets［J］.Scientific Reports，2022，12（1）：7745.

［14］" CHRISTIANSEN C E，ARATHIMOS R，PAIN O，et al.Stratified genome-wide association analysis of type 2 diabetes reveals subgroups with genetic and environmental heterogeneity［J］.Human Molecular Genetics，2023，32（16）：2638-2645.

［15］" JIN H J，WU Z H，ZHANG B F，et al.CDKN2B-AS1 mediates proliferation and migration of vascular smooth muscle cells induced by insulin［J］.Cell and Tissue Research，2023，394（3）：455-469.

［16］" GUO F，TANG C C，LI Y W，et al.The interplay of LncRNA ANRIL and miR-181b on the inflammation-relevant coronary artery disease through mediating NF-κB signalling pathway［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2018，22（10）：5062-5075.

［17］" RAZEGHIAN-JAHROMI I，KARIMI AKHORMEH A.The role of ANRIL in atherosclerosis［J］.Disease Markers，2022，2022：8859677.

［18］" SHOU F Y，LI G，MORSHEDI M.Long non-coding RNA ANRIL and its role in the development of age-related diseases［J］.Molecular Neurobiology，2024.DOI：10.1007/s12035-024-04074-y.

［19］" RAZEGHIAN-JAHROMI I，ZIBAEENEZHAD M J，KARIMI AKHORMEH A，et al.Expression ratio of circular to linear ANRIL in hypertensive patients with coronary artery disease［J］.Scientific Reports，2022，12（1）：1802.

［20］" RODRGUEZ-ESPARRAGN F，TORRES-MATA L B，CAZORLA-RIVERO S E，et al.Analysis of ANRIL isoforms and key genes in patients with severe coronary artery disease［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（22）：16127.

［21］" JIN Z J，SHEN H F，CHA W，et al.Predictive value of using plasma long non-coding RNAs ANRIL and HOXA11-AS for in-stent restenosis［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2022，23（2）：115.

［22］" HU Y，HU J.Diagnostic value of circulating lncRNA ANRIL and its correlation with coronary artery disease parameters［J］.Revista Brasileira De Pesquisas Medicas e Biologicas，2019，52（8）：e8309.

［23］" YANG X C，ZHANG Q，CHEN M L，et al.MTAP and CDKN2B genes are associated with myocardial infarction in Chinese Hans［J］.Clinical Biochemistry，2009，42（10/11）：1071-1075.

［24］" XU J J，JIANG L，XU L J，et al.Association of CDKN2B-AS1 polymorphisms with premature triple-vessel coronary disease and their sex specificity in the Chinese population［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2018，31（11）：787-796.

［25］" CHEN Y C，LI G C，FAN H Y，et al.CDKN2BAS gene polymorphisms and the risk of intracranial aneurysm in the Chinese population［J］.BMC Neurology，2017，17（1）：214.

（收稿日期：2024-03-21）

（本文編輯郭懷印）