T/CI 004-2022《高麥黃酮小麥籽粒中游離態麥黃酮及總麥黃酮含量指標和測定方法》團體標準解讀

摘 要：T/CI 004-2022《高麥黃酮小麥籽粒中游離態麥黃酮及總麥黃酮含量指標和測定方法》于2022年2月發布并正式實施。本標準的發布首次提出了高麥黃酮小麥品種（系）的游離態和總麥黃酮的含量指標并規范了簡便準確的測定方法，這將有利于高麥黃酮小麥新品種開發和營養導向型農業的健康發展。為了更好地使相關人員正確理解和使用該團體標準，本文對編制背景、主要內容、測定方法的優勢等進行了詳盡介紹。

關鍵詞：小麥，高麥黃酮，標準解讀

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.08.026

0 引 言

《高麥黃酮小麥籽粒中游離態麥黃酮及總麥黃酮含量指標和測定方法》團體標準由中國國際科技促進會標準化工作委員會提出并歸口，該標準是當前功能小麥育種領域的一項重要指標。該標準的發布首次確定了高麥黃酮小麥品種的游離及總麥黃酮含量指標并對其測定方法進行統一規范，這將有利于高麥黃酮小麥新品種開發和營養導向型農業的健康發展。

1 標準編制背景

小麥富含淀粉、蛋白質、脂肪、氨基酸以及多種微量元素，是人類和動物最主要的營養來源之一，小麥產業發展直接關系到世界糧食安全和社會穩定。小麥不僅僅為人類、動物活動提供能量來源，而且特殊用途類型的小麥具有一定的藥用價值。特殊用途品種除了黑色小麥和糯小麥外，也包括高麥黃酮和富硒、富鋅等特殊營養物質的品種。黃酮類物質包含游離態麥黃酮、其他黃酮苷元及糖苷衍生物，具有很強的抗氧化和清除自由基的能力，同時具有改善心血管疾病癥狀、抗菌抗炎、增強人體免疫力等多重功效。相關研究表明，含有較高麥黃酮小麥，其抗氧化能力能夠降低心血管疾病發生的概率，因此，麥黃酮含量較高的小麥是非常重要的功能性品種。

近年來，國內外多個研究團隊開展了高麥黃酮小麥的育種、鑒定技術研究，但通過廣泛調研發現，國內外至今仍沒有關于高麥黃酮小麥品種的游離態麥黃酮及總麥黃酮含量指標定義和規范，其檢測方法也無統一標準。因此，本標準的制定，將首次提出高麥黃酮小麥的游離態麥黃酮及總麥黃酮含量指標，制定高效、準確且統一的測定標準，對服務育種家培育更優品質的高麥黃酮小麥新品種，滿足人民群眾對生活質量和健康水平的新需求，確保我國營養導向型農業的健康發展來說意義重大。

2 標準主要內容解讀

2.1 術語及定義

游離態麥黃酮（Tricin， C17H14O7），又稱麥黃酮、苜蓿素、小麥黃素，化學名稱為5 ，7， 4 '-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮。

總麥黃酮（Total wheat flavonoid），即小麥中黃酮類物質的總含量。

高麥黃酮小麥，定義為小麥生長發育過程自然產生和積累的游離態麥黃酮含量大于0.5 mg/kg（含）或者總麥黃酮含量大于1 g/kg（含）的小麥品種（系）（不含黑、紫、藍等彩色小麥）。

2.2 標準適用范圍

本標準規定了游離態麥黃酮、總麥黃酮和高麥黃酮小麥的術語、定義、范圍，高麥黃酮小麥籽粒中麥黃酮含量指標的科學確定以及小麥籽粒及制品中游離態麥黃酮含量（高效液相色譜-串聯質譜法）和總麥黃酮含量（分光光度比色法）的檢測方法。

本文件適用于小麥籽粒中游離態麥黃酮及總麥黃酮含量的精確定量測定。企業在制定企業標準時可參照使用，相關機構在選育、審定和應用高黃酮小麥及其制品時可參照使用。

2.3 小麥籽粒中麥黃酮含量的測定方法（高效液相色譜-串聯質譜法）

2.3.1 原理

試樣用80%乙醇溶液提取，經離心濃縮后復溶，利用液相色譜串聯質譜儀檢測。根據麥黃酮的特定分子量和化學結構，通過離子碎片質譜圖進行定性，同時使用麥黃酮標準品制定定量標準曲線，利用外標法精確定量。

2.3.2 樣品準備步驟

小麥籽粒使用震動球磨儀（GRINDER GT200）磨碎，過1.0 m m篩，密封并標明標記。將試樣置于-80℃冰箱保存。

稱取100 mg試樣（精確至0.01 mg）2 mL離心管中，加入1 mL 80%乙醇水溶液，在渦旋混合器上渦旋2 min，超聲處理40 min，置于旋轉混勻儀上混勻8 h，13000 r/min離心5 min，取全部上清液至另一干凈離心管中，加入1 mL甲醇，超聲40 min，13000 r/min離心5 min，合并兩次上清液，在氮氣吹干儀上常溫吹干，加入100 μL甲醇復溶，0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜串聯質譜儀檢測。

2.3.3 測定

液相色譜-串聯質譜參考條件（按照GB/T 6041質譜分析方法通則和GB/T 16631-2008 高效液相色譜法通則操作）

a） 色譜柱：Hypersil Gold C18（美國 ThermoScientific 公司），3.5 μm，100 mm ×2.1 mm（內徑）或相當者；

b） 流動相及梯度洗脫條件見表1；

c） 柱溫：35 ℃；

d） 進樣量：5 μL；

e） 電離源模式：電噴霧離子化；

f） 電離源極性：負離子模式；

g） 霧化氣：氮氣；

h） 離子噴霧電壓：2500 V；

i） 霧化氣溫度：317 ℃；

j） 離子傳輸管溫度：333 ℃；

k） 監測離子對及碰撞氣能量見表2。

2.3.4 制作標準曲線

分別稱取5.0 mg標準物質于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配得500 μg/mL的標準溶液（標準溶液避光-40℃保存，保存期為一年）。用甲醇稀釋得到濃度為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5μg/mL的系列溶液，0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜串聯質譜儀檢測。以峰面積為縱坐標，麥黃酮濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.3.5 結果計算和表述

液相色譜-串聯質譜測定采用標準曲線法定量，標準曲線法定量結果按公式（1）計算：

式中：X i—試樣中被測組分含量，mg/kg；c i—從標準曲線上得到的被測組分溶液濃度，μg/mL；V—樣品溶液定容體積，mL；m —樣品溶液所代表試樣的重量，g。

結果保留三位有效數字，絕對差值不得超過平均數的5%。

2.4 總黃酮含量的測定方法 （分光光度比色法）

2.4.1 原理

試樣用80%乙醇溶液提取后，溶于乙醇的黃酮類物質與鋁離子顯色劑結合，形成有色物質，在510nm波長附近產生最大吸收，一定濃度范圍內，吸光度與總黃酮含量成正比，通過與標準曲線比對獲得總黃酮含量。

2.4.2 樣品準備步驟

小麥籽粒使用震動球磨儀磨碎，密封并標明標記。將試樣置于-80 ℃冰箱保存。

稱取1.0 g試樣（精確至0.01 g）于15 mL離心管中，加入10 mL 60%乙醇溶液，混勻，超聲處理60min，期間每20 min搖勻溶液一次，9500 r/min離心10min，將上清液轉移至25 mL容量瓶，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，加4%氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，以不加樣品液為空白，搖勻后用5cm的比色皿，在510 nm處測定吸光度。

2.4.3 制作標準曲線

稱量13.2 mg蘆丁，用60%乙醇定容到25 mL容量瓶作為標準溶液儲備液。

準確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標準溶液，放入10 mL容量瓶內（寫明標記），分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，放置6 min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加60%乙醇定容，搖勻后，放置15 min；以不加蘆丁對照品溶液為空白，采用分光光度法在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

2.4.4 結果計算和表述

總黃酮含量（干基）按蘆丁質量分數計，按公式（2）進行計算：

式中：ω—總黃酮含量，g/kg；m —由標準曲線上查得樣品溶液中蘆丁質量，mg；W—樣品的質量，g；d —稀釋比例。

結果保留三位有效數字，絕對差值不得超過平均數的5%。

3 確定高麥黃酮小麥品種中的游離麥黃酮及總麥黃酮含量

關于小麥中游離態麥黃酮含量的測定，僅2009年趙善倉[1]等人采用超高效液相色譜串聯質譜法測定了14個小麥品種（系）籽粒中游離態麥黃酮含量，發現游離態麥黃酮含量最高的品種為黑小麥76，達379 μg/kg，最低的品種為VICTO，僅含有47.1 μg/kg，且品種間游離態麥黃酮含量存在極顯著差異。

本團隊使用上述液相色譜-質譜聯用方法對四十余種常見小麥品種的游離態麥黃酮含量進行了精確定量檢測，結果表明，這些小麥籽粒中游離態麥黃酮含量最低的品種僅為50.33 μg/kg，最高的品種為577.48 μg/kg，進一步確認了不同品種間游離態麥黃酮含量的差異性。

而本文件主要研究材料“山農 101”（區試號：山農黃酮麥 1 號）于2020 年通過山東省農作物品種審定委員會審定（魯審麥 20206035），是國內審定的第一個高黃酮小麥新品種。經山東省農科院農業質量標準與檢測技術研究所以蘆丁比色法測定，其總麥黃酮含量1.013 g/kg，是普通小麥平均含量的3.5～5倍。

綜合考慮國內外小麥品種（含育種資源）中的麥黃酮含量范圍，同時也照顧到實際農業生產上種植高麥黃酮小麥品種產量、抗性及農藝性狀的要求，本標準認為，將游離麥黃酮含量高于0.5 mg/kg（含）或者總麥黃酮含量高于1 g/kg（含）的小麥品種（系）定義為高麥黃酮小麥品種（系）是合適的。

4 測定方法優勢

關于游離態麥黃酮含量的測定目前已有一些報道，如趙善倉[1]、Estiarte[2]、凌俊紅[3]、Tian[4]以及Meng[5]等人均采用高效液相色譜（HPLC）法分別測定了竹葉、大麥芽、小麥葉片和小麥籽粒中的游離態麥黃酮含量。而國內關于游離態麥黃酮的檢測標準只有一個廣西地方標準DB45/T 1177-2015《山銀花中苜蓿素的測定 高效液相色譜法》，其中涉及的檢測方法耗時較長（25分鐘/樣品），且單純采用的是液相方法，難于應用于小麥籽粒復雜基質中微量游離態麥黃酮的精確定性定量。國外方面，歐盟、英國和美國則沒有查詢到關于麥黃酮的任何檢測標準。

本標準建立了一種精確檢測小麥籽粒中游離態麥黃酮含量的液相色譜串聯質譜檢測方法。該方法基于2009年田紀春課題的方法進行改造，利用三重四極桿高效液相質譜法進行定量檢測，并針對小麥籽粒進行了提取方法優化改進，大大簡化檢測步驟，提高了檢測的靈敏度和準確性，單位樣品檢測耗時小于10分鐘。

關于總麥黃酮的檢測已有眾多報道[6 ]，同時有三個已經執行的標準（GB/T 20574-2006、NY/T1295-2007、DB34/T 2743-2016）列出了蜂膠、蕎麥和槐米中總麥黃酮的檢測方法，小麥及其制品中的總麥黃酮尚未有現行標準。

本標準建立了一種檢測小麥籽粒及其制品中總麥黃酮含量的分光光度比色法方法，根據小麥及其制品的特性對現行標準方法進行優化改進。

目前，本單位已經使用標準品建立標準曲線，并已經進行了上百個實際樣品的檢測和定量分析，驗證了方法的可行性和穩定性。

5 結 語

麥黃酮是小麥籽粒中重要的抗氧化劑和生理活性物質，可降低環加氧酶活性的，具有擴張血管、抗菌消炎、增強人體免疫力等多重功效。日常飲食中攝入的黃酮類化合物能夠減少心臟病等疾病的發病率。食用高麥黃酮小麥能夠提高人們自身的免疫力和患者治愈率，減少心臟病等疾病的發病率[7]，對個人和社會來說都是最經濟有效的方法。

近年來，膳食不良成為我國導致死亡的第一大因素，因此，全球農業發展研究的熱點聚焦于探尋農業、營養、健康的關系。隨著《主要農作物品種審定標準》（國品審〔2017〕1號）的發布，我國的農作物育種導向也發生了重大變化，營養導向型農業和功能作物品種迎來了前所未有的發展機遇。本標準的制定，首次提出了高麥黃酮小麥品種（系）的含量指標，并使其檢測方法具有明確的依據。通過標準的解讀，可使小麥育種、種植、檢測行業相關單位和機構更好地理解標準中內容的確定依據，為標準的順利實施和有效推廣奠定基礎。

參考文獻

[1]趙善倉，趙領軍，谷小紅，等.超高效液相色譜串聯質譜法測定小麥籽粒中麥黃酮[J].分析化學，2009 37（6）：873-876.

[2]ESTIARTE M， PENUELAS J， KIMBALL B A， et al. Freeair CO2 e nrichment o f wheat： leaf f lavonoid c oncentration throughout the growth cycle[J]. Physiologia plantarum，1999， 105（3）： 423-433.

[3]凌俊紅，王楠，任玉珍，等. HPLC法測定大麥芽中麥黃酮[J].中草藥，2005（11）：1632-1634.

[4]田向軍，邱宗波，劉曉，等.增強UV-B輻射對小麥葉片黃酮類化合物日變化的影響[J].環境科學學報，2007（3）：516-521.

[5]MENG Y， KRZYSIAK A J， DURAKO M J， et al. Flavones and f lavone glycosides from Halophila johnsonii[J].Phytochemistry， 2008， 69（14）： 2603-2608.

[6]胥倩，苗永輝，劉振，等.特殊顏色谷物研究進展和小麥相關新品種創制[J].糧油食品科技， 2021，29（2）：41-49.

[7]田紀春，胥倩.功能性小麥品種的概念、類別和發展前景[J].糧油食品科技，2021，29（2）：1-8.

作者簡介

劉振，碩士，工程師，主要研究方向為代謝組學在小麥育種

中的應用。

（責任編輯：張瑞洋）

基金項目：本文受山東省科學技術廳省級人才工程項目“泰山產業專家計劃”（項目編號：NO. tscy20221172）資助。