海藻糖敷料對激光損傷兔皮膚屏障功能的修復及體外促細胞生長、遷移和抗炎作用研究

[摘要]目的：探究海藻糖敷料對激光損傷兔動物模型皮膚的修復作用，并探索其體外促細胞生長、遷移和抗炎作用。方法：試驗兔脊柱兩邊各脫毛4個區域，隨機分為正常組（N）、模型組（M）、對照組（P）和實驗組（T）。除正常組外，其余各組使用激光照射造模；對照組及實驗組分別使用透明質酸敷料及海藻糖敷料貼敷。于第0天、第3天、第7天、第14天和第21天對創面進行紅斑和焦痂、水腫程度評分，以評價海藻糖敷料對皮膚修復效果。以L929細胞及HaCaT細胞為研究對象探索海藻糖敷料體外促細胞生長、遷移和抗炎作用。將細胞分為空白組（培養基）、正常組（細胞液+培養基）、對照組（細胞液+培養基+透明質酸）及實驗組（細胞液+培養基+海藻糖）。使用MTT比色法檢測各組L929細胞24 h、48 h及72 h增殖率，劃痕試驗檢測各組L929細胞6 h、12 h和24 h遷移力；使用TNF-α及IFN-γ誘導HaCaT細胞建立炎癥反應模型后，24 h后檢測各組IL-6、IL-8和MDC表達水平。結果：創面給予敷料后7 d，實驗組水腫評分[（1.1±0.3）分]較模型組[（1.2±0.4）分]顯著降低（P＜0.05）；第14天，相較于模型組，實驗組及對照組水腫、紅斑焦痂評分有下降趨勢但差異無統計學意義（P＞0.05）。病理結果顯示，對照組、實驗組較模型組第14天炎細胞浸潤微有減少。細胞實驗結果顯示，與正常組相比，對照組和實驗組4 h、48 h及72 h的細胞增殖率均有明顯增加；與正常組相比，對照組及實驗組6 h、12 h和24 h的細胞遷移率均有明顯增加（P＜0.05）；與細胞炎癥模型組相比，實驗組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯降低（P＜0.01）。結論：海藻糖敷料對激光所致兔皮膚屏障受損創面的組織炎癥、愈合有一定修復作用；其機制可能與其能促進細胞增殖、細胞遷移及抑制炎癥的功能相關。

[關鍵詞]海藻糖；激光術；皮膚修復；細胞增殖；細胞遷移；炎癥

[中圖分類號]R751.05" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2024）11-0001-05

Research of the Effects of Trehalose Dressing on Skin Repair after Laser Surgery in Rabbits and Its Effects on Cell Proliferation， Migration and Anti-inflammatory in Vitro

XIAO Min1， CHEN Zhonghua2，3，4， WANG Yan2，3，4， LI Li1， ZHU Weiwei1

[ 1. Department of Pharmacy， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 2. Key Laboratory of Drug Targeting and Drug Delivery System （Sichuan University） Ministry of Education， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 3. Sichuan Engineering Laboratory for Plant-Sourced Drug， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 4. Sichuan Research Center for Precision Industrial Technology， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China ]

Abstract： Objective" To evaluate the effects of trehalose dressing on skin repair after laser surgery in rabbits， and to explore its effects on cell proliferation， migration and anti-inflammatory in vitro. Methods" Four areas of hair were removed on each side of the spine in rabbits， which were randomly divided into normal group （N）， model group （M）， control group （P） and experimental group （T）. Except for the normal group， rabbits in the rest of the groups were irradiated by laser. The control group and the experimental group was treated by hyaluronic acid dressing and trehalose dressing respectively. To evaluate the effect of trehalose dressings on skin repair， erythema， eschar and edema was scored on day 0， 3， 7， 14， 21. L929 cells and HaCaT cells were used to explore effects of trehalose on cell proliferation， migration and anti-inflammatory in vitro. Cells were divided into blank group（cell culture medium， CCM）， normal group （cell+CCM）， control group （cell+CCM+ hyaluronic acid） and experimental group （cell+CCM+trehalose）. The growth of L929 cells was assayed by MTT method at 24h，48h and 72 h. The migration of L929 cells was assyed by cell scratch experiment at 6 h，12 h and 24 h. Level of IL-6， IL-8 and MDC was tested after TNF-α and IFN-γ induced inflammation in HaCaT cells after 24h. Results" On the 7th day， the edema score （1.1±0.3） in the experimental group was significantly lower than that in the model group （1.2±0.4） （P＜0.05）. On the 14th day， the edema， erythematous and eschar score of the experimental group and the control group had a downward trend compared with the model group， but there were no significant difference （P＞0.05）. The pathological results showed that， on the 14th day， the control group and the experimental group were slightly reduced in inflammatory cell infiltration compared with the model group. Results of cell experiment showed that compared with the normal group， proliferation rate of L929 cells was significantly increased in control group and experimental group at 24 h， 48 h and 72 h （P＜0.05）. Compared with the normal group， migration rate of L929 cells was significantly increased in control group and experimental group at 6 h，12 h and 24 h （P＜0.05）. Compared with the cellular inflammatory model group， level of IL-6， IL-8 and MDC was significantly decreased in experimental group （P＜0.01）. Conclusion" Trehalose have a certain repair effect on tissue inflammation and healing of laser-induced rabbit skin damage which may be related to its ability to promote cell proliferation， cell migration， and inhibit inflammation.

Key words： trehalose; laser surgery; skin repairing; cell proliferation; cell migration; inflammation

近年來，激光治療廣泛用于去除色斑、瘢痕痤瘡治療、除皺及改善光老化等皮膚問題。因其微創、治療痛苦小、治療效果佳等優勢已成為醫療美容領域的熱點[1]。但激光治療術后會形成類似輕度燒傷的創面，引起皮膚紅斑、水腫，甚至滲血、脫屑、色素沉著、瘢痕形成等[2]。創傷修復過程中，成纖維細胞是參與修復的重要細胞，該細胞的增殖與遷移是組織修復與纖維化的重要病理基礎[3]。表皮角質形成細胞（HaCaT細胞）為構成皮膚表皮的主要細胞，主要起到抵御外源性損傷的作用，當皮膚受到刺激后，HaCaT細胞會產生多種細胞因子，誘導炎癥級聯反應[4]；若炎癥因子過度活化，則會使成纖維細胞向組織局部大量遷移、侵襲，這是形成組織瘢痕及組織纖維化的主要因素之一[5]。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過α，α-1，1糖苷鍵連接的非還原性二糖，具有非特異性的抗脫水、抗冷凍、抗高滲保護、抗氧化、保濕等功能[3]，目前已廣泛用于日化產品中，在激光術后皮膚修復方面可能具有一定作用。本研究使用激光制造兔皮膚屏障損傷模型，評價海藻糖皮膚損傷修復作用；并以小鼠上皮樣成纖維細胞（L929細胞）為研究對象探索其體外對成纖維細胞增殖、遷移影響，以HaCaT細胞為研究對象，探索其體外抗炎作用，為海藻糖敷料用于激光術后皮膚修復提供理論依據。

1" 資料和方法

1.1 試驗動物及細胞、主要試劑與儀器：普通級新西蘭兔14只，2.0～2.5 kg，雌雄各半，由邳州市東方養殖有限公司提供，合格證號為SCXK（蘇）2017-0002。L929細胞（小鼠上皮樣成纖維細胞）由四川大學華西藥學院孫遜教授實驗室贈予。HaCaT細胞（人永生化角質形成細胞）由四川大學基礎醫學與法醫學院張舒羽教授贈予。DMEM培養基，批號319-005-CL，WISENT（Canada）；二甲基亞砜（DMSO），批號2094C359，Amresco（USA）；Penicillin-Streptomycin，批號SK180925，MRC（Netherlands）；胎牛血清，批號10099，Gibco Thermo Fisher Scientific，Inc.；DMEM，批號319-005-CL，WISENT（Canada）；胰酶，批號SNT-001，尚恩生物（中國武漢）；海藻糖敷料（產品名稱：皮膚修護無菌敷料，陜械注準20212140098，211201，西安德諾海思）；透明質酸敷料（產品名稱：皮膚修護敷料，陜械注準20142140032，211148，陜西佰傲再生醫學）；MTT（HY-15924，美國MCE）；人白細胞介素6（IL-6）；酶聯免疫分析試劑盒（SP10234，塞培生物）；人巨噬細胞來源的趨化因子（MDC）酶聯免疫分析試劑盒（SP10226，塞培生物）；IFN-γ蛋白（HY-P7025，美國MCE）；TNF-α蛋白（HY-P7058，美國MCE）；家用激光筆，型號DH-006，廣州市白云區韓大電子廠造；切片機，Leica Rm2235、Leica-Asp200型全自動封閉式組織脫水機、Leica-EG1160型石蠟包埋機、Leica HI1220型病理組織烤片機，均由德國徠卡公司生產；ST-360酶標儀（上海科華）；SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州安泰）；MCO-15AC型二氧化碳孵箱（日本Sanyo）；OBSERVER D1/AX10 cam HRC倒置顯微熒光鏡（德國卡爾蔡司）；BDS 300倒置生物顯微鏡（重慶奧特）；L500臺式低速離心機（湖南湘儀）；DK-8AXX電熱恒溫水槽（上海恒科）。

1.2 方法

1.2.1 皮膚修復試驗：14只新西蘭兔，脊柱兩邊各脫毛4個區域（2 cm×2 cm），隨機分為正常組（N）、模型組（M）、對照組（P）和實驗組（T）。除正常組外，其他組使用激光筆90°垂直于背部脫毛區域照射，每次照射前在照射部分涂抹冷凝膠進行保護，最終使皮膚出現灼傷，呈較嚴重紅斑，形成淺表性損傷。造模后，按照分組貼敷樣品：對照組貼透明質酸敷料，實驗組貼海藻糖敷料，正常及模型組不做處理，每次貼敷20 min，第1周每天貼敷1次，之后第10天貼敷1次，共計9次。參考《化妝品安全技術規范》（2015年版）“皮膚刺激性/腐蝕性試驗”評分標準，于0 d、3 d、7 d、14 d和21 d對創面進行紅斑和焦痂、水腫程度評分，以考察創面恢復情況。在各觀察點進行創面及周圍皮膚全層皮下組織取材，福爾馬林液固定，石蠟包埋并切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察皮膚屏障損傷修復及炎癥恢復情況。

1.2.2 MTT比色法檢測L929細胞增殖率：L929細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中，保持培養箱37℃、5% CO2、pH值7.2～7.4，相對濕度95%～98%；取處于對數生長期的L929細胞，胰酶消化、離心，調整細胞濃度約為l×104個/毫升。分別設空白組（僅含培養基）、正常組（細胞液+培養基）、對照組（細胞液+培養基+透明質酸原液）、實驗組（細胞液+培養基+海藻糖原液），其中透明質酸原液及海藻糖原液∶培養基=1∶9（V/V）。

于空白組孔中加入200μl培養基，其余組各孔中加入200μl細胞液，置孵箱孵育過夜，待細胞貼壁后，棄去每孔（除空白組）中的培養基。加樣孔分別加入已經配好的樣液200μl。加樣完成后CO2孵箱中放置24 h、48 h、72 h后每孔加入MTT 20μl，繼續孵育3 h后棄去含MTT的細胞培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl后置搖床低速震蕩10～15 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀490 nm處測定各孔吸光度OD值，計算細胞增殖率[7]：細胞增殖率=（加樣組OD值-正常組OD值）/正常值OD值×100%。

1.2.3 劃痕試驗檢測L929細胞遷移力：L929細胞培養同1.2.2。將細胞接種到12孔板中（1×104個/孔），分為：正常組（細胞液+培養基）、對照組（細胞液+培養基+透明質酸原液）及實驗組（細胞液+培養基+海藻糖原液）。置孵箱孵育，待其完全貼壁且長滿孔板后，用1 ml注射器針頭沿孔板中軸垂直劃線，用PBS清洗3次去除脫落細胞。更換無血清培養基培養和含樣品無血清培養基培養24 h，于0、6、12、24 h在10倍光學顯微鏡下拍照。用PS軟件測量0、6、12、24 h后的劃痕面積，計算細胞遷移率[7]：細胞遷移率=固定劃痕區細胞移行總面積/初始劃痕面積×100%。

1.2.4 IL-6、IL-8和MDC表達水平測定[8]：使用TNF-α及IFN-γ誘導HaCaT細胞，建立細胞炎癥模型，檢測各組IL-6、IL-8及MDC的表達水平。HaCaT細胞培養方法同上述L929細胞。分為空白組（培養基）、正常組（細胞液+培養基）、模型1組（細胞液+培養基+TNF-α）、模型2組（細胞液+培養基+IFN-γ）、實驗1組（細胞液+培養基+TNF-α+海藻糖原液）、實驗2組（細胞液+培養基+IFN-γ+海藻糖原液）。

將HaCaT細胞接種于六孔板中，106個/孔，37℃、5% CO2條件下過夜培養。細胞貼壁后，棄培養基，PBS清洗2次，加入不含血清DMEM培養基2 ml。模型組和實驗組均先加入TNF-α及IFN-γ造模，終濃度均為10 ng/ml，正常組及空白組加入等量PBS。實驗組中取海藻糖敷料原液，按1∶9比例加入細胞培養基中。37℃、5% CO2條件下培養24 h后收集細胞培養上清液。按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-6、IL-8和MDC表達水平。

1.3 統計學分析：數據以均數±標準差（xˉ±s）表示，使用單因素方差分析比較多組之間的平均數。作圖使用Graph pad Prism 5.0，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 皮膚修復影響：激光造創后，皮膚肉眼可見較嚴重淡褐紅色灼傷斑，3 d內紅斑顏色加深、結痂并伴有輕微水腫，第4～7天持續伴有紅斑結痂和水腫，第8天痂殼開始逐漸脫落，創面范圍慢慢縮小，水腫程度徐徐減輕，第21天紅斑結痂、水腫消失，創面完全愈合。見圖1。創面給予敷料后7 d，模型組和對照組水腫評分比較差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組水腫評分顯著低于模型組（P＜0.05）。第14天，相較于模型組，對照組及實驗組水腫評分有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于模型組，對照組及實驗組紅斑焦痂評分也有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1～2。病理結果顯示：造創后第0天，模型組表皮和部分真皮凝固性壞死，真皮膠原纖維腫脹，結構紊亂，可見極少量炎細胞浸潤，說明激光照射可損傷皮膚結構，并引發炎癥，提示造模成功。模型組、對照組和實驗組在造創后第3天均可見表皮和部分真皮凝固性壞死，大量炎細胞浸潤及部分肉芽組織填充；第7天出現部分上皮化和角質化；第14天三組均完全上皮化及角化，對照組、實驗組較模型組炎細胞浸潤微有減少；第21天三組均有較多毛囊和膠原纖維形成。見圖2。

2.2 細胞增殖率影響：在24 h、48 h及72 h，對照組、實驗組的細胞增殖率均高于正常組（均P＜0.05），對照組與實驗組細胞增殖率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 細胞遷移力影響：在6 h、12 h和24 h，對照組、實驗組的細胞遷移力均高于正常組（均P＜0.05），對照組與實驗組細胞遷移力比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.4 炎癥因子影響：與正常組相比，模型1組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯升高（均P＜0.001），與模型1組相比，實驗1組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯降低（均P＜0.001），實驗1組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組相比，模型2組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯升高（均P＜0.001），與模型2組相比，實驗2組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平也明顯降低（P＜0.01）。見表5。

3" 討論

選擇性光熱作用理論是激光治療的理論基礎，運用激光器發出特定的波長的光波，作用于皮膚靶組織，光能在皮膚靶組織中被吸收并轉化為熱能，使靶組織被破壞或剔除。雖然激光治療具有療效好、副作用小、治療安全性高等優點，但術后護理措施不恰當，紅斑、感染、色素沉著、瘢痕形成等不良反應風險將增加。針對激光術后的護理，除了常規的冰敷、防曬等措施外，市場上能確切緩解激光術后皮膚損傷及促進皮膚修復的產品較少[10]。目前，該類產品主要以含透明質酸的產品為主，少部分產品以含膠原蛋白、甘油等為主；且大部分的醫用功能性敷料不含有修復液，因此在促進創面細胞恢復方面無明顯優勢[11]。

在高溫、高壓、干燥等惡劣條件下，海藻糖可通過穩定細胞膜、維持蛋白質等大分子物質的活性，繼續維持生命過程和有機體生物學特征，因此它有“生命之糖”的稱號。該功能使得海藻糖可用于疫苗、血清、細胞甚至器官的保存。其膜保護機制主要有三種假說：水替代學說、玻璃轉換學說及優先排阻學說[12]。水替代學說認為海藻糖通過替代細胞膜中的水分與膜上磷脂等結構結合來維持細胞的結構；玻璃轉換學說認為海藻糖會在高溫下形成運動微弱、擴散系數低的玻璃態，從而保護蛋白質的高級結構；優先排阻學說認為海藻糖不是直接結合生物分子而是將殘留水阻滯在生物分子之間來發揮作用[12]。同時，有研究報道了海藻糖還具有促細胞生長的作用，但其機制尚不清楚[13]。因此，海藻糖敷料可能對激光術后皮膚修復具有一定效果。本實驗將兔使用激光造模后，評估其對創面水腫、紅斑及焦痂效果，結果顯示：造創后7 d，實驗組較模型組水腫評分明顯降低，而對照組水腫評分降低不明顯；造創后14 d，實驗組及對照組較模型組炎細胞浸潤均微有減少；上述結果提示海藻糖敷料較透明質酸在激光術后皮膚水腫修復效果更佳，同時可能有促進炎癥消退的作用。

傷口的愈合包含止血期、炎癥期、上皮形成期、纖維增生期和成熟期[14-15]。在炎癥反應階段，中性粒細胞、巨噬細胞等移行至傷口處，同時炎癥反應因子釋放，導致組織水腫；炎癥期通常在3 d內結束，感染等因素可造成炎癥期延長、傷口愈合減慢[16]。在上皮形成階段，基底細胞增殖和上皮細胞移行是兩個重要事件，該過程最終形成上皮淺層，阻擋細菌和其他異物[17]。

本文從細胞生長、遷移及炎癥因子水平影響方面進行進一步研究。結果顯示，海藻糖組細胞增殖率及遷移率相較于正常組均有明顯升高，IL-6、IL-8及MDC的表達水平均較細胞炎癥模型組顯著降低，提示海藻糖敷料促進激光術后皮膚修復的機制可能為：①促進上皮細胞的增殖與遷移；②抑制炎癥因子如IL-6、IL-8和MDC等的釋放，減輕炎癥反應，加速皮膚修復。因此，海藻糖敷料對于激光術后皮膚修復可能具有一定效果。

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[收稿日期]2023-01-17

本文引用格式：肖敏，陳重華，王燕，等.海藻糖敷料對激光損傷兔皮膚屏障功能的修復及體外促細胞生長、遷移和抗炎作用研究[J].中國美容醫學，2024，33（11）：1-5.