NAP染色在慢性粒細(xì)胞白血病和細(xì)菌感染中的應(yīng)用

【摘要】 目的 分析中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶（neutrophil alkaline phosphatase，NAP）染色在慢性粒細(xì)胞白血病和細(xì)菌感染中的應(yīng)用價值。方法 選取2010年1月—2022年12月尤溪縣總醫(yī)院收治的30例慢性粒細(xì)胞白血病患者與30例細(xì)菌感染患者作為研究對象，均進行血常規(guī)檢測和血涂片NAP染色，用油鏡分類計算出NAP陽性的百分?jǐn)?shù)及積分，并分析其結(jié)果。結(jié)果 細(xì)菌感染時NAP平均陽性率（86.77±4.22）%，高于慢性粒細(xì)胞白血病時NAP平均陽性率（11.96±4.83）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)菌感染時NAP平均積分（305.67±30.40）分，高于慢性粒細(xì)胞白血病時NAP平均積分（15.92±7.05）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 NAP染色用于慢性粒細(xì)胞白血病與細(xì)菌感染的鑒別有重要的意義。

【關(guān)鍵詞】 NAP染色；血像；慢性粒細(xì)胞白血?。患?xì)菌感染

文章編號：1672-1721（2024）31-0060-03" " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " "中國圖書分類號：R512.62

近年來隨著環(huán)境變化，慢性粒細(xì)胞白血病患者和細(xì)菌感染患者越來越多。血常規(guī)檢測有時難以區(qū)分慢性粒細(xì)胞白血病患者和細(xì)菌感染患者。對于慢性粒細(xì)胞白血病與細(xì)菌感染，可通過血片NAP染色的陽性率和積分的不同加以區(qū)別。本研究分析NAP染色在慢性粒細(xì)胞白血病和細(xì)菌感染中的應(yīng)用價值，為NAP染色用于慢性粒細(xì)胞白血病與細(xì)菌感染的鑒別提供參考，報告如下。

1 一般資料

選取2010年1月—2022年12月尤溪縣總醫(yī)院收治的30例慢性粒細(xì)胞白血病患者與30例細(xì)菌感染患者作為研究對象。慢性粒細(xì)胞白血病患者30例，血常規(guī)檢查中白細(xì)胞數(shù)10×109/L～50×109/L的12例，血常規(guī)檢查中白細(xì)胞數(shù)50×109/L～100×109/L的18例；肝脾腫大21例，肝脾無腫大9例。細(xì)菌感染患者30例，血常規(guī)檢查中白細(xì)胞數(shù)10×109/L～50×109/L的23例，血常規(guī)檢查中白細(xì)胞數(shù)50×109/L～100×109/L的7例；中性分葉核細(xì)胞占80%～90%的21例，中性分葉細(xì)胞占90%以上的9例。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可進行比較。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 儀器及試劑

XN-1000自動細(xì)胞分析儀、溶血劑、清洗液、稀釋及室內(nèi)質(zhì)控品由希森美康株式會社提供。血常規(guī)抗凝血采用福州長庚醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的EATD-K2真空采血管。NAP染液采用珠海貝索有限公司生產(chǎn)的瑞氏染液。鏡檢采用OLYMPUS顯微鏡。

2.2 檢測方法

儀器每天清洗保養(yǎng)及質(zhì)量控制，保證儀器正常運行及結(jié)果準(zhǔn)確。消毒患者手臂靜脈血管，用采血針抽取患者2 mL血液至EATD-K2抗凝真空管。抽完顛倒混勻，防止血液凝固。用XN-1000自動細(xì)胞分析儀測現(xiàn)結(jié)果，最好在2 h內(nèi)檢測完畢。

2.3 未梢血涂片用NAP試劑染色

偶氮偶聯(lián)法染色原理：中性粒細(xì)胞中的堿性磷酸酶在pH值9.2～9.8緩沖液中，能水解磷酸萘酚鈉，并釋放磷酸與萘酚，再以重氮鹽與奈酚偶聯(lián)生成不溶性的有色偶氮染料沉于胞質(zhì)中。

試劑組成：（1）固定劑（A液），主要成分甲醛；（2）偶氮溶液（B液），主要成分永固桃紅FBB；（3）亞硝酸鈉溶液（C液），主要成分亞硝酸鈉溶液；（4）磷酸萘酚鈉AS-BI溶液（D液），主要成分磷酸萘酚鈉AS-BI；（5）中性紅溶液（E液），主要成分中性紅。

2.4 工作液配制

1份43 mL浸染工作液至少可以同時放置8～10張涂片。以50 mL容積的染缸配制為例，浸染工作液的配制方法如下：（1）重氮鹽的準(zhǔn)備。取B液1 mL與C液1 mL徹底混勻，靜置2 min。（2）染缸（自備染液缸）內(nèi)加入40 mL蒸餾水。（3）將重氮鹽溶液倒入染缸內(nèi)混勻。（4）取D液1 mL加入染缸內(nèi)，輕輕混勻。

1份2.15 mL滴染工作液配制方法：試管內(nèi)加入B液50 μL和C液50 μL，混勻，靜置2 min；加蒸餾水2 mL，加D液50 μL，混勻。

2.5 染色步驟

（1）末梢涂片充分干燥后，滴加固定劑A液（用前恢復(fù)室溫，并充分搖勻）固定30～60 s，蒸餾水沖洗、甩干。（2）滴加或浸入工作液15 min（冬天室溫低，用37℃水浴孵育），蒸餾水沖洗10～30 s，甩干。（3）E液（使用前一定要充分搖勻）復(fù)染1～2 min，蒸餾水稍沖（沖水時間不宜過長，否則核淡染），干后鏡檢。（4）計算和積分。反應(yīng)結(jié)果以積分值報，油鏡下計算100個中性桿核、分葉粒細(xì)胞，分別記錄其分級情況，所有陽性細(xì)胞積分相加即為積分。參考范圍陽性反應(yīng)主要見于成熟中性粒細(xì)胞（桿核及分葉核粒細(xì)胞）中，健康成人一般中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶積分為35～100分。

2.6 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)及注意事項

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為NAP陽性顆粒藍(lán)色?！?”，0分，細(xì)胞質(zhì)中無陽性染色顆粒?！?”，1分，胞質(zhì)中含少量顆粒呈彌漫淺藍(lán)色，不超過胞質(zhì)總面積的1/4?！?+”，2分，胞質(zhì)中含中等量顆粒或呈彌漫藍(lán)色，占胞質(zhì)總面積的1/2。“+++”，3分，胞質(zhì)中含較多深顆?；虺蕪浡^深藍(lán)色?！?+++”，4分，胞質(zhì)中充滿粗大顆粒呈彌漫深藍(lán)色。分類100個中性分葉核粒細(xì)胞，計算出NAP陽性率及積分。

注意事項：（1）建議E液放于常溫儲存，其余試劑使用前恢復(fù)室溫，用前搖勻試劑；B液、C液充分混勻，所用容器必須潔凈，正常工作液顏色為淺黃色或金黃色，若工作液配制后液體呈棕色或暗棕色，說明B液、C液沒有充分混勻或試劑快失效，致使染色失敗。（2）應(yīng)采用新鮮涂片做NAP染色，涂片放置過久會導(dǎo)致酶活性降低；使用抗凝血涂片染色，陽性結(jié)果不穩(wěn)定。（3）工作液于臨用前新鮮配制，并在10 min內(nèi)使用，以免影響染色效果。（4）需用感染發(fā)熱患者或正常人外周血涂片作為陽性對照。（5）血片經(jīng)工作液染完后，用水充分沖洗，將片子上殘留的工作液沖洗干凈，否則影響E液對細(xì)胞核的復(fù)染效果。（6）工作液對染片有脫片的作用，可能導(dǎo)致涂片粘附不牢。建議沖水時注意力度，以免涂片脫落。（7）由專業(yè)人士使用及進行結(jié)果判讀。（8）使用前要詳細(xì)閱讀使用說明書，在有效期內(nèi)使用，并做好個人防護。（9）注意生產(chǎn)早期、生產(chǎn)批號和有效期。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

細(xì)菌感染時NAP平均陽性率（86.77%），高于慢性粒細(xì)胞白血病時NAP平均陽性率（11.96%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)菌感染時NAP平均積分（305.67±30.40）分，高于慢性粒細(xì)胞白血病時NAP平均積分（15.92±7.05）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌感染時NAP平均陽性率、平均積分均明顯高于慢性粒細(xì)胞白血病，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。慢性粒細(xì)胞白血病患者血常規(guī)檢測時，有的患者血常規(guī)白細(xì)胞數(shù)很高、分類分葉細(xì)胞增多、嗜酸細(xì)胞與嗜堿細(xì)胞增多、血小板增多，與慢性粒細(xì)胞白血病患者血常規(guī)檢測接近；有的血常規(guī)白細(xì)胞不高，分類時分葉細(xì)胞增多，與細(xì)菌感染的血像相似很難區(qū)分，需做NAP染色進行區(qū)分。細(xì)菌感染時NAP陽性率達(dá)80%以上，NAP積分200以上；慢性粒細(xì)胞白血病時NAP陽性率低，有的甚至為0，NAP積分也低[1-4]。當(dāng)NAP陽性率及積分小時，進一步做bcr/abl基因的檢測。bcr/abl p210由t（9；22）（q34；q11）易位形成，存在于95%的慢性粒細(xì)胞白血病患者中。

慢性粒細(xì)胞白血病是造血干細(xì)胞克隆性增生疾病，表現(xiàn)外周血白細(xì)胞進行性增高，中幼、晚幼、桿狀核粒細(xì)胞增生為主，伴有嗜酸、嗜堿粒細(xì)胞增多，脾腫大。90%以上的慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞中有Ph染色體或bcr/abl基因[5]。慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病率高，占成人白血病的40%左右，多發(fā)于20～50歲人群。

慢性粒細(xì)胞白血病病因未明。電離輻射是公認(rèn)的慢性粒細(xì)胞白血病致病因素之一，暴露于電離輻射有較高的發(fā)病率。90%以上慢性粒細(xì)胞白血病患者粒細(xì)胞中出現(xiàn)Ph染色體。Ph染色體是9號與22號染色體長臂末端相互易位形成。分子生物研究證明，9號染色體長臂q34帶的斷裂使abl基因位點轉(zhuǎn)移到22號染色體q11帶上bcr基因位點，產(chǎn)生新的bcr/abl融合基因，表達(dá)新的雜合mRNA，進而編碼翻譯出新的融合蛋白，具有很強的酪氨酸激酶活性，觸發(fā)細(xì)胞增生失常而致病。bcr/abl融合基因還有抗細(xì)胞凋亡的功能，造成粒細(xì)胞在體內(nèi)聚集。

慢性粒細(xì)胞白血病在各年齡均可發(fā)病，中老年人多見，男性多于女性。大多數(shù)慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病在慢性期，患者自覺癥狀不明顯。有的患者在體檢或其他疾病就醫(yī)發(fā)現(xiàn)血常規(guī)白細(xì)胞異常增高或脾大而被發(fā)現(xiàn)。有的患者只有白細(xì)胞高，肝脾并不腫大。有的患者表現(xiàn)為低熱、多汗、食欲減退等癥狀。脾臟腫大是慢性粒細(xì)胞白血病最為突出的特征，就醫(yī)時已達(dá)到臍或臍以下，質(zhì)硬、無壓痛。肝可輕度至中度腫大，部分患者胸骨中下段有壓痛。當(dāng)白細(xì)胞極度增高至大于200×109/L時，可發(fā)生“白細(xì)胞淤滯癥”，表現(xiàn)為呼吸困難、語言不清、中樞神經(jīng)出血等癥狀。疾病后期可有貧血、出血等癥狀，表現(xiàn)為皮膚出血、鼻衄、月經(jīng)過多等出血癥狀。多數(shù)慢性粒細(xì)胞白血病患者最終轉(zhuǎn)化為急性白血病。該病中位生存期為3～5年。通過造血干細(xì)胞移植，可使部分患者得到治愈。

慢性粒細(xì)胞白血病時白細(xì)胞總數(shù)顯著增高，常超過30×109/L，多數(shù)在50×109/L～300×109/L；分類時，出現(xiàn)大量未成熟細(xì)胞，以中性中幼、晚幼粒增多尤為突出；桿狀分葉粒細(xì)胞增多；嗜酸性粒細(xì)胞增多，嗜堿性粒細(xì)胞增多可達(dá)10%～20%；NAP陽性率及積分低。嗜堿性粒細(xì)胞的增多是慢性粒細(xì)胞白血病特征之一。90%～95%的慢性粒細(xì)胞白血病患者處于慢性期，持續(xù)1～4年，表現(xiàn)為貧血和脾大，可能有出血、疲乏無力等癥狀。隨著病情發(fā)展，原粒細(xì)胞可增多；加速期原粒細(xì)胞多于10%，可出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、納差、淋巴結(jié)突然腫大等癥狀，持續(xù)數(shù)月或數(shù)年；急變期原粒細(xì)胞大于20%。慢性粒細(xì)胞白血病終未期可能危及生命，可發(fā)生急粒變、急淋變和急單變。在疾病早期，紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白正常，以后逐漸減少，出現(xiàn)貧血。初診病例血小板正?；蛟龆?，增多時可達(dá)

1 000×109/L以上，加速期或急變期可減少。骨髓涂片檢查時，有核細(xì)胞增生極度活躍，粒系增生為主，紅系或其他系相對減少或受抑，粒紅比例可達(dá)（10～50）∶1；中幼、晚幼及桿狀核粒細(xì)胞明顯增多，原始粒細(xì)胞＜10%，嗜酸、嗜堿性粒細(xì)胞增多；巨核細(xì)胞正?；蛟龆?，晚期可減少。該病晚期可發(fā)生急變[6]，50%～60%發(fā)展為急粒變，20～30%為急淋變，少數(shù)患者為急單變。急粒變時，骨髓中原粒細(xì)胞＞20%；急淋變時，骨髓中原淋+幼淋＞20%；急單變時，骨髓中原單+幼單＞20%。

感染反應(yīng)是機體受某些疾病或外界因素刺激后，造血組織出現(xiàn)的一種異常反應(yīng)，血象類似白血病但非白血病的表現(xiàn)。微生物或內(nèi)毒素進入機體被巨噬細(xì)胞吞噬后，巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞被激活，產(chǎn)生各種造血生長因子，如G-CSF、GM-CSF、M-CSF，并釋放細(xì)胞因子，如IL-1、IL-3、TNF。G-CSF、GM-CSF、IL-3等可刺激骨髓造血干細(xì)胞和前細(xì)胞的增生、分化，促使貯存池中的中性粒細(xì)胞大量釋放至邊緣池、循環(huán)池，使外周白細(xì)胞計數(shù)明顯增高（少數(shù)正?；驕p少）。血常表現(xiàn)為白細(xì)胞總數(shù)明顯增高，同時出現(xiàn)一些桿狀粒細(xì)胞及少數(shù)的晚、中幼粒細(xì)胞，C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原、白細(xì)胞介素-6增高[7-9]。有些患者伴有貧血和血小板減少。大多數(shù)感染反應(yīng)有明確的病因，以細(xì)菌感染及惡性腫瘤多見，其次是某些藥物的毒性作用或中毒，還有變態(tài)反應(yīng)性疾病，急性出血、溶血性貧血、組織損傷、大面燒傷等都可以引起白細(xì)胞增高。當(dāng)原發(fā)病好轉(zhuǎn)，類白反應(yīng)迅速恢復(fù)，一般愈后良好。

當(dāng)血常規(guī)白細(xì)胞明顯增高，以中性分葉核粒細(xì)胞為主，出現(xiàn)核左移時，進行NAP染色。如NAP陽性率及積分明顯增高，細(xì)菌感染概率更大；如NAP陽性率及積分減低，慢性粒細(xì)胞白血病的概率更大[10]。NAP染色對細(xì)菌感染與慢性粒細(xì)胞白血病的診斷有重要的意義。

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（編輯：張興亞）

作者簡介：張立佑（1973—），男，福建尤溪人，本科，副主任技師，主要從事血常規(guī)血液病骨髓檢查方面的研究。