香葉木素對APAP誘導的肝損傷作用及機制研究

摘 要 為了探究香葉木素（diosmetin）對對乙酰氨基酚（APAP）誘導的肝損傷作用及機制，將48只昆明小鼠隨機分為6組，分別為空白組（NC）、APAP肝損傷模型組（DILI）、香葉木素低、中、高劑量治療組（XL+DILI、XM+DILI、XH+DILI）、香葉木素高劑量對照組（XHD），每組8只。NC組和XHD組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余小鼠腹腔注射等體量的APAP注射液（300 mg/kg），每日2 次，連續注射4 d。第5天開始NC組和DILI組小鼠灌胃生理鹽水，XL+DILI組、XM+DILI組、XH+DILI組和XHD組小鼠分別按照25"" mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、100 mg/kg等體量灌胃香葉木素藥液，每日2次，連續3 d。最后一次給藥12 h后，檢測各組小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性，以及肝組織中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的水平，肝組織切片HE染色觀察肝損傷情況，qPCR檢測細胞色素P450酶2E1（CYP2E1） mRNA表達水平，Western blot檢測CYP2E1、熱休克蛋白60（HSP60）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）在蛋白水平的表達。結果表明：香葉木素可降低ALT和AST活性，提高GSH和SOD水平，顯著降低H2O2和MDA水平。香葉木素可顯著降低DILI小鼠肝組織中CYP2E1" mRNA和蛋白表達水平，對肝臟組織中HSP60和Caspase 3蛋白的表達具有良好的抑制作用。綜上所述，香葉木素具有抗APAP誘導的小鼠肝損傷的作用，其機制可能與改善氧化應激、抑制CYP2E1表達、減緩線粒體應激和細胞凋亡有關。

關鍵詞 香葉木素；藥物性肝損傷；氧化應激；CYP2E1；線粒體應激；細胞凋亡

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury， DILI）是指機體對藥物或其代謝產物的特異性反應所導致的肝損傷［1］。近年來，藥物性肝損傷的發生率逐年增高，其發病機制復雜，單一藥物或者藥物聯合使用均可以誘發DILI［2］。根據發病機制，將DILI分為固有型DILI（intrinsic DILI）、特異型DILI（idiosyncratic DILI）及間接型DILI （indirect DILI）［3］。

對乙酰氨基酚（acetaminophen， APAP）又名撲熱息痛，在臨床上主要用于解熱鎮痛、抗炎等，也是引起DILI的常見原因，是固有肝毒性藥物的典型代表［4］。安全劑量下，APAP在肝臟中主要通過Ⅱ相代謝途徑代謝，85%～90%的APAP在葡萄糖醛酸基轉移酶（glucuronic transferase， UGTs）和磺基轉移酶（sulfonate transferase， SULTs）的催化作用下與葡萄糖醛酸和硫酸物結合，生成無毒的代謝產物［5］。但APAP劑量過大時，超出治療劑量的APAP主要經細胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）氧化酶系統中的" CYP2E1代謝成N-乙酰基-對苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine， NAPQI）［6］，NAPQI聚集會導致還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）的嚴重耗竭，過量的NAPQI與其他蛋白質、不飽和脂質發生反應，并產生氧化應激、脂質過氧化等，最終導致肝細胞死亡而造成肝損傷［7-8］。

線粒體是真核生物進行氧化代謝產生能量的細胞器，對氧化損傷極為敏感，缺氧、細胞滲透壓改變、各種毒物以及射線等均會引起線粒體腫脹［9］。同時，線粒體也是NAPQI的主要靶標，參與APAP引起的代謝損傷和炎癥損傷［10］，過量的NAPQI與線粒體膜蛋白結合形成復合物，從而改變線粒體膜結構，致使線粒體膜通透性增加，膜電位被破壞［11］，并且 NAPQI消耗細胞內大量的GSH會造成肝臟內的氧化還原平衡狀態被打破，從而使線粒體中活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平升高，導致線粒體膜脂質過氧化，膜流動性降低，引發線粒體應激反應［12］。

香葉木素（diosmetin）是一種天然黃酮類化合物，主要來源于蓬子菜、菊花、檸檬、柑橘類等多種植物［13］，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤及雌激素樣作用，其作用機制涉及清除自由基、誘導細胞凋亡以及抑制細胞內信號傳遞等［14］。有研究表明，香葉木素能保護組織免受氧化應激損傷，具有抗氧化、減輕APAP引起的急性肝損傷等作用［15］。

目前關于香葉木素對APAP誘導的肝損傷作用的研究較少，且機制尚不明確。本研究旨在從線粒體應激的角度出發，探究香葉木素對APAP誘導肝損傷的作用及其機制，尋找其作用的靶點，為進一步研發治療APAP誘導的肝損傷的新型藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

潔凈級昆明小鼠，體質量為（25±5） g，雌雄各半，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，動物飼養于甘肅農業大學動物醫學院實驗室，自由進食飲水。動物試驗經甘肅農業大學倫理委員會" 批準。

1.2 主要試劑

香葉木素（貨號：S31450）購自上海源葉生物科技有限公司；谷草轉氨酶（AST/GOT）測定試劑盒（貨號：C010-1-1）、谷丙轉氨酶（ALT/GPT）測定試劑盒（貨號：C009-1-1）、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒（貨號：A003-2）、谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（貨號：A006-1-1）、過氧化氫（H2O2）測定試劑盒（貨號：A064-1-1）和總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（貨號：A001-1）等均購于南京建成生物工程研究所；高效RIPA組織/細胞裂解液（貨號：R0010）、PBS磷酸鹽緩沖液干粉（貨號：P1010）、苯甲基磺酰氟PMSF（貨號：P8340）、5×蛋白上樣緩沖液（含DTT）（貨號：P1040）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）和ECL超敏發光液（貨號：PE0010）均購于北京索萊寶科技有限公司；Tween-20（貨號：gfdbz057）購自天津光復試劑有限公司；HiScript Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒（貨號R123-01）和高靈敏性染料法定量PCR檢測試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix（貨號Q311-02/03）購于南京諾唯贊生物技術有限公司；TransZol UP強效型RNA提取試劑盒（貨號：ET111-01）購自北京全式金生物技術有限公司；

細胞色素P450 2E1（CYP2E1）抗體（貨號：bs-1725R）、熱休克蛋白-60（HSP60）抗體（貨號：bs-0191R）、活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3）抗體（貨號：bsm-33199M）、β-肌動蛋白（β-Actin）抗體（貨號：bs-10966R）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：bs-0755R）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG （貨號：bs-80295G-HRP）及辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG （貨號：bs-40296G-HRP）均購于北京博奧森公司。

1.3 儀 器

SpectraMax i3x多功能酶標測定儀（美國Molecular Devices公司），Amersham Imager600全自動化學發光成像系統（美國GE公司），Light Cycler96熒光定量PCR儀（瑞士羅氏集團），蛋白電泳儀及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司），冷凍型高通量組織研磨器（寧波新芝），Leica ASP300S自動組織脫水機、HistoCore Arcadia H石蠟包埋機和HistoCore MULTICUT輪轉式切片機均購自德國萊卡公司。

1.4 方 法

1.4.1 動物分組及處理 取香葉木素粉末溶于0.9%的生理鹽水中，分別配制成25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的藥液，4 ℃保存，備用。將48只試驗小鼠適應性飼喂1周后，隨機分為6組：空白組（NC組）、APAP肝損傷模型組（DILI組）、香葉木素低劑量治療組（XL+DILI組， 25 mg/kg）、香葉木素中劑量治療組（XM+DILI組， 50 mg/kg）、香葉木素高劑量治療組（XH+DILI組， 100 mg/kg）、香葉木素高劑量對照組（XHD組， 100 mg/kg），每組8只。試驗時NC組和XHD組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠均腹腔注射等體積的APAP注射液（300 mg/kg），每日兩次，連續注射4 d。第5天開始NC組和DILI組小鼠灌胃生理鹽水，XL+DILI組、XM+DILI組、XH+DILI組和XHD組小鼠分別按照25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、100 mg/kg等體量灌胃香葉木素藥液，每日2次，連續3 d，最后一次給藥后禁食12 h，不限制飲水，稱體質量，小鼠眼眶靜脈叢采血，血液于室溫靜置30 min后，" 4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清，分裝。同時摘除小鼠肝臟，清洗干凈后一側肝臟組織于4%多聚甲醛溶液中固定，其余組織保存于"" -80 ℃冰箱，備用。

1.4.2 肝功能指標檢測 按照試劑盒說明書測定小鼠血清中ALT、AST的活性。

1.4.3 HE染色檢測肝組織病變 將肝臟組織固定14 d后，用濾紙吸去多余的多聚甲醛，并修整為1 cm3大小的組織塊，標記后流水沖洗24 h，使用全自動脫水透明儀進行梯度脫水及透明，然后將組織取出進行包埋以及切片，厚度為5 μm。切片放置在烘片機上37 ℃烘烤6～8 h，之后取出置于染色架上，依次放入二甲苯、苯酒精、100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精及蒸餾水中，蘇木精染色，然后用自來水流水沖洗15 min，鹽酸乙醇分化2～3 s，流動自來水沖洗反藍30 min后進行伊紅染色。

染色完成后對切片進行脫水透明，中性樹膠封片，放置在37 ℃烘箱中烘干，然后置于光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織的病理形態學" 特征。

1.4.4 氧化應激指標檢測 取適量肝臟樣品制成10%肝組織勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心10 min取上清液，按照試劑盒說明書測定SOD活性、GSH、MDA和H2O2含量。

1.4.5 qPCR法檢測肝臟組織相關基因表達 使用Trizol試劑提取各組小鼠肝臟組織總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒說明反轉錄成cDNA，建立20 μL的PCR反應體系，以GAPDH為內參，進行40次擴增。反應溫度設定為預變性95 ℃ 600 s，95 ℃ 10 s，60 ℃退火30 s。采用2-△△Ct法計算目標基因的表達。引物信息見表1。

1.4.6 Western blot檢測肝臟組織相關蛋白表達 用RIPA裂解液提取肝臟組織蛋白，BCA 法測定各組蛋白的濃度，并將所有蛋白標定為同一濃度。然后配制分離膠和濃縮膠，對處理好的蛋白樣品進行SDS-PAGE，設置為120 V電泳90 min，然后將蛋白轉印到PVDF膜上，將PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h。將多余的脫脂奶粉溶液從PVDF膜上洗掉后，用一抗及相應的二抗孵育。PVDF膜孵育二抗后，置于搖床上PBST清洗2 h，之后在PVDF膜表面滴加 ECL發光液，使用化學發光儀顯影成像，并用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。

試驗中所有抗體均用PBST稀釋。

1.4.7 統計學方法 所有試驗數據以“平均數±標準差”的形式表示，應用統計學軟件SPSS 26.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 香葉木素對小鼠血清ALT、AST活性的影響

由圖1-A可知，與NC組相比，DILI、XL+DILI、XM+DILI及XH+DILI組小鼠血清中ALT活性均顯著升高（Plt;0.05），而XHD組小鼠血清ALT活性無顯著差異（Pgt;0.05）。相較于DILI 組，XM+DILI、XH+DILI和XHD組小鼠血清ALT活性均顯著降低（Plt;0.05），而" XL+DILI組小鼠血清ALT活性無顯著差異" （Pgt;0.05）。

由圖1-B可知，與NC組相比，DILI、XL+DILI、XM+DILI及XHD組小鼠血清中AST活性均顯著升高（Plt;0.05），而XH+DILI組小鼠血清AST活性無顯著差異（Pgt;0.05）。與DILI 組相比，XL+DILI、XM+DILI、XH+DILI和XHD組小鼠血清中AST活性均顯著降低（Plt;0.05）。

綜上所述，XM+DILI和XH+DILI組小鼠血清中ALT和AST活性較之DILI 組均顯著降低（Plt;0.05），說明香葉木素能夠顯著降低DILI小鼠血清中的ALT和AST活性，且在高劑量時效果最好。

2.2 香葉木素對小鼠肝組織病理變化的影響

如圖2可見，NC組（圖2-A）與XHD組（圖2-F）小鼠肝小葉結構完整，肝細胞中央靜脈周圍呈放射狀排列，肝竇清晰，肝索、肝細胞排列整齊，細胞核染色均勻，大小正常，無變性、壞死等病理變化。DILI組（圖2-B）小鼠肝細胞大量壞死，肝索萎縮，可見細胞核碎裂、溶解、消失。XL+DILI組（圖2-C）小鼠肝細胞壞死、變性，肝索萎縮。XM+DILI組（圖2-D）小鼠肝細胞輕度變形，排列不整齊。XH+DILI組（圖2-E）小鼠個別肝細胞壞死，肝索整齊，無明顯病變。該結果表明，香葉木素能夠改善APAP導致的肝組織損傷。

2.3 香葉木素對小鼠肝組織氧化應激水平的" 影響

由圖3-A、3-B可知，與NC組相比，DILI、" XL+DILI和XM+DILI組小鼠肝臟GSH含量和SOD活性均顯著降低（Plt;0.05）， XH+DILI組小鼠肝臟GSH含量無顯著差異（Pgt;0.05），而SOD活性顯著降低（Plt;0.05），XHD組小鼠肝臟GSH含量和SOD活性均無顯著差異（Pgt;" 0.05）。相較于DILI 組，XH+DILI和XHD組小鼠肝臟GSH含量和SOD活性均顯著升高" （Plt;0.05），XL+DILI和XM+DILI組小鼠肝臟GSH含量和SOD活性均無顯著差異" （Pgt;0.05）。該結果表明，高劑量香葉木素可以顯著提高DILI組小鼠肝臟GSH含量和SOD活性。

由圖3-C、3-D可知，與NC組相比，DILI和XL+DILI組小鼠肝組織中MDA含量與H2O2含量均顯著升高（Plt;0.05）；XM+DILI、XH+DILI和XHD組小鼠肝組織中MDA含量顯著升高（Plt;0.05），而H2O2含量無顯著差異（Pgt;" 0.05）。相較于DILI 組，XL+DILI、 XM+DILI、XH+DILI及XHD組小鼠肝組織MDA含量和H2O2含量均顯著降低（Plt;0.05）。該結果表明，香葉木素可以顯著降低DILI組小鼠肝組織中MDA含量和H2O2含量。

2.4 香葉木素對小鼠肝組織" CYP2E1基因和蛋白表達的影響

由圖4-A可知，與NC組相比，DILI、XL+DILI、XM+DILI及XH+DILI組小鼠肝組織中" CYP2E1基因表達水平顯著升高（Plt;0.05），而XHD組小鼠" CYP2E1基因表達水平無顯著差異（Pgt;0.05）。相較于DILI 組，XL+DILI、XM+DILI、XH+DILI和XHD組小鼠肝臟中" CYP2E1基因表達水平均顯著降低（Plt;0.05）。結果表明，香葉木素可以顯著降低DILI組小鼠肝組織中" CYP2E1基因的表達水平。

由圖4-B可知，與NC組相比，DILI組小鼠肝組織中CYP2E1蛋白表達水平顯著升高（Plt;0.05），說明APAP可促進CYP2E1蛋白的表達；相較于DILI 組，XL+DILI、XM+DILI和XH+DILI組小鼠肝臟中CYP2E1蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05），表明香葉木素可以抑制DILI組小鼠肝組織中CYP2E1蛋白的表達。

2.5 香葉木素對小鼠肝組織HSP60和Caspase 3蛋白表達的影響

由圖5-A可知，與NC組相比，DILI、XL+DILI和XM+DILI組小鼠肝組織中HSP60蛋白表達水平顯著升高（Plt;0.05），而XH+DILI和XHD組小鼠HSP60蛋白表達水平無顯著差異（Pgt;0.05）。相較于DILI 組，XL+DILI、XM+DILI、XH+DILI和XHD組小鼠肝臟中HSP60蛋白表達水平均顯著降低（Plt;0.05）。結果表明，香葉木素可以顯著降低DILI組小鼠肝組織中HSP60蛋白的表達水平。

由圖5-B可知，與NC組相比，DILI組小鼠肝組織中Caspase 3蛋白表達水平顯著升高（Plt;0.05）。相較于DILI 組，XL+DILI、XM+DILI和XH+DILI組小鼠肝臟中Caspase 3蛋白表達水平顯著降低（Plt;" 0.05）。該結果表明，香葉木素對DILI組小鼠肝組織中Caspase 3蛋白的表達具有良好的抑制" 作用。

3 討 論

APAP是臨床上廣泛使用的解熱鎮痛藥，其肝毒性問題愈加突出，已成為引起急性藥物性肝損傷甚至肝衰竭的最常見藥物之一［16］。本研究采用APAP誘導建立小鼠DILI模型，觀察香葉木素對DILI的作用。谷丙轉氨酶（alanine transaminase， ALT）和谷草轉氨酶（aspartate transferase， AST）是判斷肝損傷的重要指標［17］。ALT主要分布于肝細胞漿的可溶性部分，是非常靈敏的肝損傷指標，可以反映肝細胞的完整性，ALT活性增高往往說明肝實質細胞受到損傷［18］。AST主要分布于肝細胞漿的可溶性部分及線粒體中，當肝細胞發生了嚴重損傷甚至發生病變時，線粒體受損，AST將大量進入血液［19］。研究結果顯示，DILI模型構建成功，中劑量和高劑量的香葉木素能夠顯著降低APAP誘導的DILI小鼠體內的ALT和AST活性。此外，APAP肝毒性可引起肝臟小葉中心性壞死、肝淤血以及散在的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等［20］。HE染色結果顯示，DILI組小鼠肝細胞大量壞死，肝索萎縮，可見細胞核碎裂、溶解，而香葉木素各劑量治療組小鼠肝臟損傷出現一定好轉。結合ALT和AST結果與組織病理觀察結果，表明香葉木素對APAP導致的藥物性肝損傷具有治療作用。

APAP誘導的肝損傷發病機制十分復雜，其中氧化應激是非常關鍵的步驟［21-22］。正常情況下，生物體內的氧化系統與抗氧化系統處于動態平衡狀態，但是各種因素導致體內的ROS水平與抗氧化劑平衡紊亂，即產生氧化應激［23］。總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是機體內重要的抗氧化酶，具有清除自由基，減輕自由基對機體組織損傷的能力［24］。GSH是生物體內絕大多數細胞中巰基的主要來源，是機體抗自由基的主要成分，肝細胞中的GSH可達機體總GSH的95%以上，在維持機體氧化還原平衡中發揮著十分重要的作用［25-26］。丙二醛（malondialdehyde， MDA）是生物體內自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化從而形成的產物，可以間接反映細胞氧化應激水平，常用來評價機體的脂質過氧化和氧化損傷程度，體內MDA含量越高說明機體氧化損傷越嚴重［27］。過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）是一種相對穩定的重要ROS分子，常用于研究細胞氧化損傷［28］。本研究結果顯示，香葉木素可以提高APAP所致DILI小鼠肝臟組織GSH含量和SOD活性，顯著降低MDA含量和H2O2含量，表明其可以改善氧化應激，從而緩解APAP誘導的藥物性肝損傷，發揮護肝作用。

在治療劑量下，APAP是安全的，但APAP 使用過量時會導致Ⅱ相代謝途徑中的代謝酶飽和，剩余的APAP會通過CYP450酶系統生成NAPQI，過量的NAPQI會消耗細胞內大量的GSH，導致細胞中線粒體蛋白巰基團的共價結合［29］，最終致使線粒體應激和功能障礙，引起肝細胞的凋亡與壞死［30］。NAPQI還會擾亂線粒體電子傳遞鏈（electron transfer chain， ETC），導致電子從電子傳遞鏈中泄漏，從而形成超氧自由基，破壞細胞內的氧化還原平衡［31-32］。CYP2E1作為CYP450酶系中主要的一種，大部分分布于肝臟組織，是參與氧化應激和脂質過氧化的關鍵酶，同時也在細胞凋亡、炎性因子形成以及星狀細胞活化等過程中發揮一定作用［33］。有研究表明，抑制CYP2E1活性可減輕APAP誘導的肝損傷［34-35］。熱休克蛋白60 （heat shock protein 60， HSP60）主要存在于線粒體中，能幫助線粒體蛋白正確折疊，維持線粒體蛋白穩定，對于維持線粒體完整性和呼吸鏈穩態十分重要［36］。此外，有少部分HSP60分布于細胞質中，與多種蛋白相互作用，具有調節細胞存活和代謝的功能［37］。研究發現，肝細胞凋亡是引發急性肝損傷的重要機制之一［38］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）處于Caspase家族中多種凋亡途徑的下游，是細胞凋亡執行的標志性分子，在細胞凋亡過程中起重要作用，當細胞凋亡啟動時它會被活化，可進一步促進凋亡進程［39-40］。本研究結果顯示，香葉木素可以顯著降低DILI小鼠肝組織中CYP2E1 mRNA和蛋白的表達水平，對DILI小鼠肝臟中HSP60和Caspase 3蛋白的表達具有良好的抑制作用，表明香葉木素可能通過抑制CYP2E1的表達、緩解線粒體應激和細胞凋亡，減輕APAP導致的肝損傷。

綜上所述，香葉木素具有緩解APAP誘導的小鼠肝損傷的作用，其機制可能與改善氧化應激、抑制CYP2E1的表達、減緩線粒體應激和細胞凋亡有關。

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Effect and Mechanism of Diosmetin on APAP-Induced Liver Injury

YAO Yale， PAN Yangyang， ZHANG Zhijie， CHEN Guowen， WANG Zhongyi，

FAN Biyue， AN Zhixia， MA Xiaoyan and WANG Meng

（College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，China）

Abstract In order to investigate the effect and mechanism of diosmetin on acetaminophen（APAP）-induced liver injury， forty-eight Kunming mice were randomly divided into six groups with eight mice in each group.The groups included normal control group （NC）， APAP liver injury model group （DILI）， diosmetin low， medium and high dose treatment groups （XL+DILI， XM+DILI， XH+DILI）， diosmetin high dose control group （XHD）.The mice in the NC group and XHD group were injected intraperitoneally with saline， while the rest of the mice were injected intraperitoneally with equal"" amount of APAP injection （300 mg/kg） twice a day for 4 days.On the fifth day， mice in the NC group and DILI group were gavaged with saline， while mice in the XL+DILI， XM+DILI， XH+DILI and XHD groups were gavaged with diosmetin at levels of 25 mg/kg， 50 mg/kg， 100 mg/kg and 100"" mg/kg twice a day for 3 days.Twelve hours after the last gavage， the serum alanine transaminase （ALT）， aspartate transferase （AST） activities and the levels of glutathione （GSH）， superoxide dismutase （SOD）， hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde （MDA） in liver tissues of the mice were measured， and liver sections were stained with hematoxylin-eosin to observe liver injury.The expression of cytochrome P450 enzyme 2E1 （CYP2E1） at the mRNA level was detected by qPCR， and the expression of" CYP2E1， heat shock protein 60 （HSP60） and cysteine aspartate protease 3 （Caspase 3） at the protein level was detected by Western blot.The results showed that diosmetin reduced ALT and AST activity， increased GSH and SOD levels， significantly reduced H2O2 and MDA levels.Gene and protein expression of" CYP2E1" in liver tissues of DILI mice were significantly reduced， and the expression of HSP60 and Caspase 3 proteins in liver were well inhibited.In summary， diosmetin can protect the liver from APAP induced injury in mice， and the mechanism may be related to the improvement of oxidative stress， inhibition of" CYP2E1 expression， moderation of the mitochondrial stress and apoptosis.

Key words Diosmetin; Drug-induced liver injury; Oxidative stress; CYP2E1; Mitochondrial stress; Apoptosis

Received "2022-11-15 """Returned 2023-02-08

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.32160850）; Natural Science Foundation of Gansu Province （No.22JR5RA868）; Youth Mentor Support Fund of Gansu Agricultural University （No.GAU-QDFC-2021-05）.

First author YAO Yale， male， master student.Research area： veterinary pharmacology and toxicology.E-mail： 2931669157@qq.com

Corresponding"" author WANG Meng， female， Ph.D，master supervisor.Research area： veterinary pharmacology and" development of the new veterinary drug.E-mail： wangmeng@gsau.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）