環泊酚減輕缺氧/復氧誘導心肌細胞損傷的實驗研究

摘要" 目的：探究環泊酚對H9c2心肌細胞缺氧/復氧（H/R）性損傷的影響及其潛在機制。方法：H9c2心肌細胞分別用不同濃度環泊酚預處理48 h，并在缺氧條件下培養7 h，再復氧培養6 h。將細胞分為6組：對照組、H/R組、異丙酚組、環泊酚1 μmol/L組、環泊酚2 μmol/L組和環泊酚4 μmol/L組。使用噻唑藍（MTT）評估H9c2心肌細胞存活；流式細胞術檢測細胞凋亡；2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFHDA）評估細胞內活性氧（ROS）水平；試劑盒檢測丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定白細胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測相關蛋白的表達。結果：與對照組比較，H/R組H9c2心肌細胞凋亡率增加（P＜0.01），Caspase-3蛋白水平升高（P＜0.01）；ROS濃度和MDA含量增加（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；炎性細胞因子釋放明顯增加（P＜0.01）；蛋白激酶B（AKT）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、血紅素加氧酶1（HO-1）、核因子紅細胞相關因子2（Nrf2）蛋白表達下降（P＜0.01）。與H/R組相比，環泊酚2 μmol/L組、環泊酚4 μmol/L組心肌細胞凋亡，氧化應激和炎癥反應明顯減輕（P＜0.01），AKT/GSK-3β/Nrf2通路明顯激活（P＜0.01）。結論：環泊酚在H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷中發揮保護作用，是一種潛在的抗心肌缺血再灌注損傷候選藥物。

關鍵詞" 環泊酚；H9c2心肌細胞；缺氧/復氧；細胞凋亡；氧化應激；炎癥反應；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.010

心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見病，具有高致殘率和高死亡率，也是病人生活質量下降的主要原因［1-2］。心肌缺血與多種心臟病的發生發展密切相關，是心肌梗死和惡性心律失常的急性加重因素。心肌缺血是由于缺乏血液流向心肌，導致氧氣、葡萄糖和其他可支持線粒體氧化磷酸化的營養物質不足［3］?；謴腿毖孕呐K的血供是缺血性心臟病的主要治療方法，但血液再灌注可引起心肌缺血/再灌注（I/R）損傷，使病人病情惡化，影響病人預后［4］。I/R伴有氧化應激、細胞內鈣超載和炎癥反應，可激活細胞凋亡、壞死和自噬，最終導致心肌的進一步損傷［5］。由于心肌細胞是終末分化的細胞，不能再生，因此，防止心肌細胞損傷是一種治療心肌缺血的有效策略。

環泊酚（HSK3486）是一種新型2，6-烷基二取代苯酚衍生物，其化學結構類似于異丙酚。在前期實驗中，環泊酚具有起效快、恢復快、無積累、注射后疼痛小、呼吸抑制小等特點，具有潛在的臨床應用價值［6］。研究表明，環泊酚表現出比異丙酚更高的脂溶性和藥代效力［6］。動物研究表明，異丙酚對心肌I/R損傷具有保護作用［7］，環泊酚可以有效保護心臟心肌梗死［8］，但環泊酚對心肌I/R損傷是否有保護作用尚不清楚。本研究用缺氧/復氧（H/R）處理H9c2細胞以模擬體外I/R損傷，旨在確定環泊酚對心肌I/R損傷的保護作用和潛在機制。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑

大鼠心肌細胞（H9c2）購自上海生物科學研究所；

基金項目" 山西省衛健委科研課題項目（No.2019WS0605）

作者單位" 山西省心血管病醫院（太原 030024），E-mail：13835138359@163.com

引用信息" 劉艷，郝杰，張迅，等.環泊酚減輕缺氧/復氧誘導心肌細胞損傷的實驗研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（23）：4293-4300.

環泊酚和異丙酚購自四川海思科制藥公司；V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢云克隆生物公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）診斷試劑盒購自南京建成生物公司；所有抗體均購自美國Abcam公司。

1.2" 細胞培養

大鼠心肌H9c2細胞孵育在DMEM高糖培養基中，補充有10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（美國Gibco公司）。在37 ℃，5% CO2的環境下，細胞保存在含95%空氣的加濕培養箱中。本研究獲得山西省心血管病醫院醫學倫理委員會批準（2023WJ500）。

1.3" 體外H/R模型［9］及分組

H9c2心肌細胞分別用0.5、1、2、4、8、16和32 μmol/L 環泊酚預處理48 h，并在缺氧條件下培養7 h，再復氧培養6 h。比較不同濃度環泊酚預處理后的H9c2細胞存活率以及缺氧7 h/復氧1～6 h的H9c2細胞存活率。將培養的H9c2心肌細胞隨機分為對照組、H/R組、異丙酚組、環泊酚1 μmol/L組、環泊酚2 μmol/L組和環泊酚4 μmol/L組。對照組細胞常規培養，環丙酚各濃度組細胞在缺氧前用不同濃度的環泊酚處理1 h，異丙酚組細胞在缺氧前用異丙酚處理1 h，然后在缺氧條件下培養7 h，再復氧6 h。用4 μmol/L 環泊酚和10 μmol/L" PI3K抑制劑Ly294002共同處理H/R誘導的H9c2細胞，分為對照組、環泊酚4 μmol/L組、環泊酚4 μmol/L＋10 μmol/L Ly294002組，檢測3組蛋白激酶B（AKT）/糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/紅細胞相關因子2（Nrf2）信號通路蛋白表達、H9c2細胞凋亡率、氧化應激指標、炎性因子。

1.4" 噻唑藍（MTT）法

將H9c2細胞以1×104細胞/孔的密度孵育在96孔板（美國Croning公司）中，環泊酚處理完成后，用磷酸緩沖液溶液（PBS）清洗每組H9c2細胞2次，并向每孔中加入100 μL正常培養基，20 μL的MTT溶液，并在37 ℃下孵育4 h。去除上清液后，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜，并在振蕩器上振蕩10 min，并通過微孔板讀數器在490 nm處測量吸光度（OD）值。

1.5" 流式細胞術

環泊酚預處理和H/R損傷后，收集培養基中的懸浮細胞和貼壁細胞。用胰蛋白酶（北京碧云天生物技術有限公司）消化H9c2細胞。根據制造商的說明，用冰PBS洗滌細胞2次，并將其重懸在1×結合緩沖液（300 μL）中。室溫條件下，用異Annexin V-FITC（5 μL）和PI（5 μL）在黑暗中對細胞染色15 min。最后，使用流式細胞儀（美國Thermo Fisher公司）分析伴隨光散射的熒光信號。

1.6" 活性氧（ROS）水平檢測

環泊酚預處理和H/R損傷的H9c2細胞達到70%～80%的融合度時，取出上層培養基，并用PBS洗滌2次。用ROS測定試劑盒（美國Abcam公司）在37 ℃下對細胞進行30 min的染色。用適合于異硫氰酸熒光素（FITC）的過濾器組對活細胞進行成像。在熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

1.7" MDA、SOD和 GSH-Px 活性測定

環泊酚預處理和H/R損傷后，用指定的商業試劑盒采集細胞，測量H9c2細胞中MDA、SOD水平和GSH-Px活性。

1.8" 促炎細胞因子水平測定

環泊酚預處理和H/R損傷后，離心H9c2細胞并收集上清液。根據制造商的說明，通過ELISA試劑盒檢測白介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。

1.9" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

在4 ℃下用RIPA裂解緩沖液提取H9c2蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京碧云天生物技術有限公司）測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 （SDS-PAGE） 電泳分離蛋白，并轉膜到聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，4 ℃下用稀釋的抗Caspase-3（1∶1 000）、抗蛋白激酶B（AKT）（1∶1 000）、抗糖原合酶激酶3β（GSK-3β）（1∶1 000）、抗核因子紅細胞相關因子2（Nrf2）和抗血紅素加氧酶1（HO-1）孵育過夜。用與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，并用增強化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）化學發光檢測系統檢測。用Image J 分析圖像灰度值。以β-actin作為內參。

1.10" 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" 環泊酚對H/R損傷性H9c2細胞存活率的影響

與對照組相比，H9c2細胞存活率隨著復氧時間的增加而降低（P＜0.01）。在缺氧7 h和復氧6 h條件下，細胞存活率為（55.23±3.41）%。詳見圖1。與對照組相比，環泊酚0.5 μmol/L組、環泊酚1 μmol/L組、環泊酚2 μmol/L組、環泊酚4 μmol/L組H9c2細胞存活率差異均無統計學意義（P＞0.05），表明在0.5～4 μmol/L劑量下環泊酚對H9c2細胞沒有毒性。與對照組相比，環泊酚濃度高于8 μmol/L時，H9c2細胞存活率明顯降低（P＜0.01），表明高于8 μmol/L的劑量對細胞有毒性。詳見圖2。與對照組相比，H/R組細胞存活率下降至（56.87±1.95）%（P＜0.01）；與H/R組相比，不同濃度環泊酚組細胞存活率明顯增加（P＜0.01）。詳見圖3。

2.2" 環泊酚對H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

與對照組相比，H/R誘導了HCC827和PC-9細胞凋亡，裂解的Caspase-3表達上調（P＜0.01）。與H/R組相比，環泊酚明顯抑制H/R誘導的細胞凋亡，裂解的Caspase-3表達下調（P＜0.05），表明環泊酚抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡。詳見圖4～圖7。

2.3" 環泊酚對H/R誘導的H9c2細胞氧化應激的影響

與對照組相比，H/R組MDA含量明顯增加，GSH-Px和SOD活性明顯降低，ROS水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與H/R組相比，環泊酚2、4 μmol/L處理明顯減弱了H9c2細胞氧化應激（P＜0.01），表明環泊酚處理可減少H/R誘導心肌損傷中的氧化應激。詳見圖8～圖10。

2.4" 環泊酚對H/R誘導的H9c2細胞炎癥反應的影響

與對照組相比，H/R誘導的H9c2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與H/R組相比，環泊酚2 μmol/L組、環泊酚4 μmol/L組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），表明環泊酚處理減弱了H9c2細胞炎癥反應。詳見圖11。

2.5" 環泊酚對AKT/GSK-3β/Nrf2通路的影響

與對照組相比，環泊酚可下調p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2和HO-1蛋白的表達（P＜0.01）。與H/R組相比，環泊酚2、4 μmol/L處理明顯增加p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2和HO-1表達（P＜0.01），表明環泊酚激活了AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路。詳見圖12、圖13。

2.6" 環泊酚通過AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路保護心臟損傷

用4 μmol/L環泊酚和10 μmol/L的磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑Ly294002共同處理H/R誘導的H9c2細胞。與環泊酚組相比，LY294002在H/R誘導的H9c2細胞中明顯逆轉了環泊酚的抗凋亡、抗氧化應激和抗炎癥反應作用（P＜0.05），表明環泊酚通過抑制AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路保護心肌I/R損傷。詳見圖14～圖21。

3" 討" 論

本研究闡明了環泊酚在調節H/R誘導的H9c2細胞心肌損傷中的保護作用。結果表明，環泊酚減輕了H9c2心肌細胞中H/R誘導的細胞凋亡、ROS產生和炎性因子的釋放。PI3K抑制劑Ly294002下調Nrf2的激活，并部分逆轉了環泊酚的保護作用。此外，環泊酚通過激活AKT/GSK-3β/Nrf2信號在心肌I/R損傷中發揮重要作用。

炎癥反應是心肌損傷的一個關鍵特征，表現為釋放出大量的促炎細胞，包括IL-6、IL-1β 和TNF-α［10］，加劇心臟損害和心肌細胞凋亡。此外，炎癥反應與氧化應激密切相關，互相調節，引發惡性循環最終導致心肌細胞死亡和凋亡［11］。本研究中，I/R誘導明顯升高IL-6、IL-1β 和TNF-α表達水平，而環泊酚給藥明顯降低炎性因子的釋放。在心肌I/R損傷條件下，細胞凋亡通路被異常激活，并發生過度凋亡［12］。一些實驗研究表明，可通過抑制細胞凋亡改善心肌I/R損傷［13］。本研究還發現，環泊酚處理明顯抑制H/R誘導的細胞凋亡率，并抑制Caspase-3的裂解。這些結果表明，環泊酚可作為一種抗H/R誘導的心臟炎癥和心肌細胞凋亡的保護劑。

ROS是心肌I/R損傷的主要致病因素之一［14］，內源性抗氧化劑SOD水平間接影響細胞清除氧自由基的能力。心肌細胞更容易受到自由基損傷，因為其含有較少的抗氧化劑和抗氧化酶，如GSH、SOD和過氧化氫酶。當心肌細胞發生H/R損傷時，心肌損傷標志物乳酸脫氫酶（LDH）和MDA會增加［15］。MDA是一種脂質過氧化物質，可以遷移到細胞內外，從而加劇了氧化應激引起的損傷范圍。本研究發現，H/R處理后MDA和ROS水平明顯增加，活細胞數量明顯減少，并明顯降低了抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性。這些結果表明，環泊酚可以通過增加GSH-Px和SOD活性來減少ROS和MDA的產生，從而防止心肌H/R損傷。

活性AKT可促進體外心肌細胞的存活，并對心肌H/R損傷具有保護作用。GSK-3β是PI3K/AKT信號通路的關鍵下游分子，通常通過PI3K/AKT介導的磷酸化調節細胞凋亡［16］。缺血預處理或后處理可以通過激活PI3K-AKT-GSK-3β通路抑制線粒體通透性轉換孔道（mPTP）開放來預防心肌H/R損傷［17］。本研究中，環泊酚增強了AKT和GSK-3β的磷酸化水平，同時環泊酚對心肌H/R損傷的保護作用被PI3K抑制劑逆轉。Nrf2是氧化還原敏感轉錄因子之一，被認為是抑制細胞內ROS產生的重要抗氧化傳感器［18］。增強Nrf2轉錄活性可以減弱H/R誘導的氧化應激和心肌損傷［19］。Nrf2上調易位到細胞核以增加氧化應激反應基因的轉錄［如HO-1、醌氧化還原酶-1（NQO-1）］，而HO-1的上調可以促進細胞對H/R誘導損傷的抗性［19］。研究表明，Nrf2的核轉位需要PI3K/AKT途徑的激活［20］。在本研究中，環泊酚處理增加了AKT和GSK-3β的磷酸化。此外，環泊酚可明顯上調Nrf2蛋白及其下游基因HO-1，以抑制H/R誘導的細胞凋亡，炎癥反應和氧化應激損傷。這些結果表明，環泊酚通過激活H9c2細胞中的AKT/GSK3β/Nrf2信號軸發揮抗心肌損傷作用。

綜上所述，本研究闡明了環泊酚通過激活AKT/GSK-3β/Nrf2信號保護H9c2細胞免受H/R誘導的細胞凋亡、氧化應激和炎癥的影響。環泊酚可能在心肌I/R損傷的進展中發揮重要作用，并提示環泊酚/AKT/GSK-3β/Nrf2信號傳導是調節心肌I/R損傷的一種新機制。本研究為環泊酚在臨床麻醉中，特別是在心臟病病人中的應用提供了理論依據。

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（收稿日期：2023-04-11）

（本文編輯郭懷印）