川芎-赤芍藥對及其有效成分抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化及鐵調素的作用機制

摘要目的：觀察川芎-赤芍藥對及其有效成分能否減緩細胞泡沫化，并探討其作用機制。方法：采用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導人單核細胞白血病（THP-1）細胞建立泡沫化模型，將川芎-赤芍藥對及其有效成分分別作用于ox-LDL誘導的THP-1細胞。采用油紅O染色分析細胞泡沫化程度，通過逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測鐵代謝相關鐵調素（Hep）、膜鐵轉運蛋白（FPN）、鐵調素調節蛋白（HJV）、血色素沉著癥基因（HFE）、轉鐵蛋白受體2（TfR2）mRNA表達情況。結果：油紅O細胞染色后鏡下可見，染色后的紅色脂滴因川芎-赤芍藥對及其有效成分干預而減少。與對照組比較，模型組Hep、FPN、HFE、TfR2 mRNA表達上升，HJV mRNA表達減少；與模型組比較，川芎-赤芍藥對及其有效成分干預組抑制作用明顯，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：川芎-赤芍藥對及其有效成分可抑制ox-LDL誘導的THP-1源巨噬細胞泡沫化，作用機制與川芎-赤芍藥對及其有效成分調節鐵代謝相關基因表達有關。

關鍵詞川芎-赤芍藥對；巨噬細胞泡沫化；鐵調素；川芎嗪；芍藥苷；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.008

Mechanism of Chuanxiong-Chishao and its Effective Ingredients on ox-LDL-induced Macrophage Foaming and Hepcidin

XU Guipeng， WEI Fengni， CHEN Qiting， LIN Baohong， CHEN Lijie， ZHANG Miao

Shenzhen Second People′s Hospital， Shenzhen 518000， Guangdong， China

Corresponding AuthorZHANG Miao， E-mail： shuixi.an@163.com

AbstractObjective：To observe the effect of Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients on cell foaming，and to explore its mechanism of action.Methods：The foaming model of THP-1 cells was established by oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）.The tohoku hospital pediatrics-1（THP-1） cells induced by ox-LDL were treated with Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients respectively.The cell foam was analyzed by oil red O staining，and the mRNA expressions of hepcidin（Hep），ferroportin（FPN），ferrimodulin regulatory protein（HJV），hemochromatosis gene（HFE） and transferrin receptor 2（TfR2） were detected by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results：Oil red O staining showed that the number of red fat drops decreased with the intervention of Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients.Compared with the control group，the mRNA expressions of Hep，FPN，HFE and TfR2 increased in the model group，while mRNA expression of HJV decreased.Compared with the model group，Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients of the intervention group showed obvious inhibitory effect，and the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Chuanxiong-Chishao and its effective ingredients could inhibit the ox-LDL-induced THP-1-derived macrophage foaming，and its mechanism of action was related to the regulation of iron metabolism related gene expression.

KeywordsChuanxiong-Chishao; macrophage foaming; ferroportin; ligustrazine; paeoniflorin; experimental study

活血化瘀中藥川芎-赤芍藥對防治動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的臨床及動物相關研究較多，抗AS療效已被證實，但具體作用機制尚未明確［1-3］。相關研究顯示，鐵代謝及鐵調素（hepcidin，Hep）/膜鐵轉運蛋白（ferroportin，FPN）信號通路異常是促進AS的重要危險因素，可能成為治療AS的新靶點［4-5］。鐵是機體必需的微量元素，Hep是富含半胱氨酸的具有負性鐵調節作用的在肝內合成的抗菌多肽，可抑制單核巨噬細胞系統鐵的釋放及腸道鐵的吸收［6-7］。FPN是哺乳動物膜鐵輸出的蛋白，受Hep調節，當Hep與其受體FPN結合，泛素化誘導降解了FPN，使鐵在細胞內滯留，減少鐵的輸出。Hepcidin/Ferroportin軸可調節鐵平衡，在體內受到精準的調控，通過協調小腸上皮細胞調控鐵的吸收，協調肝臟細胞和脾臟巨噬細胞中儲存的鐵釋放，調控機體游離的鐵濃度，維持機體鐵穩態［7］。Hep的分子調控機制復雜，主要是通過骨形態發生蛋白（BMP）信號途徑［8］。鐵調素調節蛋白（HJV）是血色素沉著癥基因（HFE）2的產物，其是BMPs的協同受體，通過BMP受體增強BMP通路信號傳導［9］。當機體累積過量的鐵時可產生一種復合物，這種復合物是由細胞膜上的轉鐵蛋白受體（TfR）1或TfR2、HFE與飽和轉鐵蛋白結合形成，通過促進BMP信號轉導調控Hep表達［10-11］。因此，在鐵調節中FPN、Hep、HFE、HJV、TfR2參與其中并發揮重要作用。

巨噬細胞泡沫化是公認的體外AS細胞模型，為進一步探討川芎-赤芍藥對及其有效成分對AS的影響及其機制，本研究采用人單核細胞白血病（THP-1）細胞，通過丙二醇甲醚醋酸脂（PMA）及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導為泡沫細胞，構建AS體外模型；建模成功后加入川芎-赤芍藥對及其有效成分進行干預，并設置空白對照組及陽性藥物組，進而觀察川芎-赤芍藥對及其有效成分對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的影響及作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

人單核/巨噬細胞株THP-1購自中科院上海生命科學研究院生化與細胞所。

1.2實驗藥物

川芎嗪、芍藥苷標準品購自北京索萊寶科技有限公司；川芎-赤芍藥對及單體凍干粉購自華潤三九藥業；辛伐他汀（杭州默沙東制藥有限公司生產，批號：M023632，規格：每片20 mg）。

1.3實驗試劑

RPMI-1640培養液，胎牛血清（Hyclone）；PMA（大連唯諾商貿有限公司）；Trizol（Takara）；油紅O染料（Sigma）；逆轉錄及SYBR Green PCR 試劑盒（ABI）。

1.4細胞培養及模型制備

THP-1細胞培養于RPMI-1640培養基（含10%標準胎牛血清、100 U/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素）中。培養條件：37 ℃恒溫培養箱，5%的CO2，細胞密度為2×106個細胞數，間隔2～4 d進行傳代。

巨噬細胞泡沫化模型的建立：取對數生長期細胞計數后的THP-1細胞轉移至離心管中，以1 000 r/min離心3 min后，棄上清，加入PMA（160 nmol/L）的細胞培養基，48 h后觀察細胞狀態。THP-1單核細胞分化，表現為細胞體積增大，由懸浮變成貼壁，偽足由圓形變成不規則形狀，表明已分化成THP-1細胞源性的巨噬細胞。

分化誘導成功后，加入含ox-LDL（100 mg/L）、10%胎牛血清的細胞培養基，培養24 h后觀察到細胞體積繼續增大，脂質變多，有透亮脂滴形成；使用油紅O對細胞進行染色，細胞質中可見較多圓形、亮紅色及典型戒環樣的脂滴，表明THP-1細胞巨噬源性泡沫細胞模型構建成功。

1.5油紅O染色

取狀態較好的對數生長期THP-1細胞接種于6孔板中，PMA處理48 h，使其分化為巨噬細胞，再給予ox-LDL誘導24 h后油紅O染色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察并照相。

1.6實驗分組

將PMA誘導后的THP-1源性巨噬細胞混勻后分為9組，每組4孔，分別為對照組（正常巨噬細胞）、模型組（ox-LDL 100 mg/L）、陽性藥物組（ox-LDL 100 mg/L＋辛伐他汀 1 μmol/L）、川芎嗪組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎嗪 500 μmol/L）、芍藥苷組（ox-LDL 100 mg/L＋芍藥苷 500 μmol/L）、川芎組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎20 g/L）、赤芍組（ox-LDL 100 mg/L＋赤芍20 g/L）、川芎嗪＋芍藥苷組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎嗪 500 μmol/L＋芍藥苷500 μmol/L）、芎芍藥對組（ox-LDL 100 mg/L＋川芎-赤芍藥對20 g/L）。

1.7逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）測定目的基因

收集細胞，使用Trizol將細胞充分裂解，進行RNA提取；按說明書將RNA逆轉錄為cDNA；再經過預變性、擴增等PCR反應計算目的基因相對表達量。Hep正向引物5′-CCTGACCAGTGGCTCTGTTT-3′，反向引物5′-CACATCCCACACTTTGATCG-3′；FPN正向引物5′-ACCTCGCTGGTGGTACAGAATGTT-3′，反向引物5′-AGCAGGAAGTGAGAACCCATCCAT-3′；HFE正向引物5′-GGATCTTGGAGCAAACCTCA-3′，反向引物5′-GACACCACTCCCAACTTCGT-3′；HJV正向引物5′-TTCCAATCCTGCGTCTTTGAT-3′，反向引物5′- GGAAAAGGTGCAAGTTCTCCAA-3′；TfR2正向引物5′-CCATCAGTGCTGACATTGCT-3′，反向引物5′- TGGGGGTAGAGACTCTGTGG-3′。以GAPDH為內參，對照組及模型組作為對照，各藥物干預組目的基因的mRNA相對含量用2－△△Ct計算。

1.8統計學處理

使用GraphPad Prism 9.4統計軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1川芎-赤芍藥對及其有效成分對巨噬細胞泡沫化的影響

紅O染色后顯微鏡下可見：對照組細胞質內有少量的紅色微粒；模型組經ox-LDL誘導后，細胞質內有大量亮紅色的脂滴，細胞體積變大，并出現了戒環樣的典型泡沫細胞形態；與模型組比較，川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組細胞質內的紅色脂滴均顯著減少、變小，川芎嗪＋芍藥苷組及芎芍藥對組紅色脂滴減少更顯著。詳見圖1。

2.2川芎-赤芍藥對及其有效成分對泡沫細胞Hep mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組Hep mRNA表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組Hep mRNA表達均減少，且川芎嗪＋芍藥苷組降低最顯著，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖2。

2.3川芎-赤芍藥對及其有效成分對泡沫細胞FPN mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組FPN mRNA表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組FPN mRNA表達均降低，且陽性藥物組降低最顯著，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖3。

2.4川芎-赤芍藥對及其有效成分對泡沫細胞HFE mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組HFE mRNA表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組HFE mRNA表達均降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖4。

2.5川芎-赤芍藥對及其有效成分對泡沫細胞HJV mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組HJV mRNA表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組HJV mRNA表達均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖5。

2.6川芎-赤芍藥對及其有效成分對泡沫細胞TfR2 mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組TfR2 mRNA表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組TfR2 mRNA表達均降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖6。

3討論

AS是引起心腦血管疾病的重要病理因素之一，嚴重威脅人類的健康及生命，但具體機制尚未明確。有研究證實，鐵代謝紊亂與AS關系密切，可促進脂質過氧化、炎癥等病理過程，AS斑塊不穩定、斑塊內出血、鐵沉積及脂質過氧化是晚期AS斑塊的重要特征［12］。相關研究顯示，在AS的發展過程中，鐵代謝相關信號通路有重要的關聯作用，Hepcidin/Ferroportin信號通路是鐵代謝主要的信號通路，該通路異常是AS的重要危險因素，可能成為治療AS的新靶點。研究表明，Hep和FPN比例在AS的發病中發揮著重要的作用［13-14］。一項流行病學調查顯示，絕經后的女性Hep水平與AS的發生關系密切，Hep和FPN比例與AS的發病密切相關［15］。體內研究發現，AS斑塊中的Hep水平升高，可促進AS斑塊內鐵沉積、炎癥反應及脂質在巨噬細胞聚積［16-17］。體外研究發現，ox-LDL通過刺激誘導巨噬細胞Hep表達，內化降解巨噬細胞膜的FPN，引起細胞內鐵沉積，上調噬紅巨噬細胞內聚積脂質，從而誘發炎癥、氧化應激及細胞凋亡［18］。Wunderer等［12］研究指出，BMP-Hep-FPN軸可能作為預防和治療心血管疾病的新靶標。

中醫藥在抗氧化、抗炎、調節脂質代謝等方面的多靶點作用使其在預防及抗AS方面有獨到的優勢。瘀血阻滯是AS主要的病因病機，活血化瘀是目前防治該病的有效策略。活血化瘀藥對（川芎-赤芍）是從經典方血府逐瘀湯中精制簡化得來［19］。川芎溫通辛散，是血中之氣藥，既化瘀活血又行血中氣滯；赤芍寒苦，散瘀止痛、涼血清熱；二藥配伍，增加活血化瘀功效同時借氣而行血，使破滯行血效力增倍。陳可冀院士治療冠心病經皮冠狀動脈介入（PCI）術后血瘀證常用川芎-赤芍藥對，該藥對為治療該病的專方專藥［20］。川芎嗪為川芎發揮效用的主要成分，具有抗炎、減輕氧化應激、抗血栓等作用［21］。芍藥苷為赤芍發揮效用的主要組分，可保護心臟、神經，具有抗炎、抗凝、抗氧化等［22］。川芎-赤芍藥對及其效用組分相須互補，協同改善心腦血管疾病如AS等的病理變化［23］。多項研究顯示，活血化瘀中藥單體川芎嗪能有效改善AS小鼠鐵過載，降低血脂并抑制斑塊形成，具有調節機體鐵穩態及抗氧化損傷的作用［18-19，24］。

本研究選用活血化瘀中藥藥對川芎-赤芍，構建ox-LDL刺激誘導的THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞即AS體外模型，結果顯示，與對照組比較，模型組Hep、FPN、HFE、TfR2 mRNA表達均增多，HJV mRNA降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組、川芎嗪組、芍藥苷組、川芎組、赤芍組、川芎嗪＋芍藥苷組、芎芍藥對組FPN、Hep、HFE、TfR2 mRNA表達均降低，HJV mRNA升高（P＜0.05）；油紅O結果提示巨噬細胞泡沫化模型造模成功，PCR結果證明模型組Hepcidin、FPN、HFE、TfR2表達增高、HJV降低，川芎-赤芍藥對及其有效成分可抑制其異常表達。提示中藥川芎-赤芍藥對及其有效成分通過降低Hepcidin、FPN、HFE、TfR2，升高HJV，調節Hepcidin/Ferroportin信號通路，從而發揮改善AS的作用。

綜上所述，鐵代謝及Hepcidin/Ferroportin軸為靶點的AS研究處于起步階段，活血化瘀藥對在AS過程中鐵代謝及Hepcidin/Ferroportin通路調節作用的研究較少，亟待開發。本研究為川芎-赤芍藥對的臨床應用提供了實驗證據，并為活血化瘀新藥中成藥的研發及機制研究提供Hepcidin相關的新靶點和新思路，為中醫藥的現代化發展提供了科學的實驗證據，對闡明AS病變加重、發現新的治療靶點及有效的治療藥物具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2023-03-31）

（本文編輯薛妮）