miR-9-5p靶向TIMP2誘導多發性骨髓瘤細胞自噬和凋亡的機制

摘要：目的 探究miR-9-5p和組織金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP2）相互作用對多發性骨髓瘤（MM）細胞自噬和凋亡的影響機制。方法 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測初診MM和復發MM各9例患者骨髓樣本中miR-9-5p和TIMP2的表達水平，分析兩者表達水平的相關性。U266細胞分為miR-對照組、miR-9-5p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TIMP2組、miR-9-5p+pcDNA3.1組、miR-9-5p+pcDNA3.1-TIMP2組。采用流式細胞術、免疫熒光染色、蛋白質印跡實驗檢測過表達miR-9-5p和TIMP2對U266細胞自噬和凋亡的影響；雙螢光素酶報告實驗驗證miR-9-5p和TIMP2的靶向關系。結果 與初診MM患者相比，復發MM患者miR-9-5p表達水平升高，TIMP2表達降低；miR-9-5p和TIMP2表達水平呈負相關（P＜0.05）。與miR-對照組相比，miR-9-5p組MAP1LC3B-Ⅱ的表達水平降低，MAP1LC3B-Ⅰ和SQSTM1的表達水平增加，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TIMP2組MAP1LC3B-Ⅱ的表達水平升高，MAP1LC3B-Ⅰ和SQSTM1的表達水平降低，細胞凋亡率增加（P＜0.05）。生物信息學和雙螢光素酶報告實驗證實TIMP2是miR-9-5p的靶基因。結論 miR-9-5p靶向TIMP2抑制MM細胞的自噬和凋亡，從而促進MM的發生發展。

關鍵詞：多發性骨髓瘤；自噬；細胞凋亡；金屬蛋白酶2組織抑制劑；miR-9-5p

中圖分類號：R733.3 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240086

miR-9-5p-induced autophagy and apoptosis in multiple myeloma cells by targeting TIMP2

FANG Jie1， HUANG Rui1， ZHENG Honghui1， JIA Qianqian1， BAO Jing2△

1 Department of Hematology， Hefei Cancer Hospital， Chinese Academy of Sciences， Hefei 230031， China; 2 Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University

△Corresponding Author E-mail： baojing@ahmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the mechanism of the interaction between miR-9-5p and tissue metalloproteinase inhibitor 2 （TIMP2） on autophagy and apoptosis in multiple myeloma （MM） cells. Methods Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect expression levels of miR-9-5p and TIMP2 in bone marrow samples of 9 patients with newly diagnosed MM and 9 patients with recurrent MM. The correlation of expression levels between the two were analyzed. U266 cells were divided into the miR-control group， the miR-9-5p group， the pcDNA3.1 group， the pcDNA3.1-TIMP2 group， the miR-9-5p+pcDNA3.1 group， and the miR-9-5p+pcDNA3.1-TIMP2 group. The effects of overexpressed miR-9-5p and TIMP2 on autophagy and apoptosis in U266 cells were detected by flow cytometry， immunofluorescence staining and Western blot experiments. The dual luciferase report experiment verified the interaction between miR-9-5p and TIMP2. Results Compared with newly diagnosed MM patients， the expression level of miR-9-5p was increased and the expression level of TIMP2 was decreased in patients with recurrent MM. The expression levels of miR-9-5p and TIMP2 were negatively correlated （P＜0.05）. Compared with the miR-control group， the miR-9-5p group showed a decrease in the expression level of MAP1LC3B-Ⅱ， an increase in expression levels of MAP1LC3B-Ⅰ and SQSTM1， and a decrease in cell apoptosis rate （P＜0.05）. Compared with the pcDNA3.1 group， the expression level of MAP1LC3B-Ⅱwas increased in the pcDNA3.1-TIMP2 group， while the expression levels of MAP1LC3B-Ⅰand SQSTM1 were decreased， and the apoptosis rate of cells increased （P＜0.05）. Bioinformatics and dual luciferase reporter experiments confirmed that TIMP2 was the target gene of miR-9-5p. Conclusion miR-9-5p inhibits autophagy and apoptosis in MM cells by targeting TIMP2， thereby promoting the occurrence and development of MM.

Key words： multiple myeloma; autophagy; apoptosis; tissue inhibitor of metalloproteinase-2; miR-9-5p

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞惡性腫瘤，約占所有血液系統惡性腫瘤的13%，其特征是骨髓中漿細胞克隆性增殖，通常伴有單克隆免疫球蛋白分泌［1］。盡管在該病發病的分子機制和新療法方面取得了一些進展，但目前MM仍無法治愈［2］。因此，迫切需要挖掘新的、更好的MM治療策略。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類內源性非編碼單鏈RNA，通過與靶標mRNA的3'－非翻譯區（3'-UTR）結合阻斷調控病理生理過程相關靶標RNA的翻譯，從而達到負調控基因表達的目的［3］。Huang等［4］發現miR-9通過調控泛素連接酶56（TRIM56）/核因子κB（NF-κB）通路促進MM的發生發展，從而為MM治療提供了潛在的靶點。組織金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP2）是一種基質金屬蛋白酶（MMP）抑制劑［5］，其異常表達與骨髓瘤、卵巢癌等腫瘤的發生發展密切相關［6-7］。本研究旨在探討miR-9-5p與TIMP2的相互作用關系以及對MM發生發展的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2021年8月—2023年8月在中國科學院合肥腫瘤醫院血液科住院治療的18例MM患者，其中男9例，女9例，年齡50～78歲，平均（65.44±6.75）歲。初診和復發MM各9例，收集患者骨髓血3 mL，3 000 r/min離心10 min得到骨髓細胞?；颊咴\斷標準符合《中國多發性骨髓瘤診治指南》［8］，臨床資料完整。本研究已獲得中國科學院合肥腫瘤醫院倫理委員會批準（PJ—KY2024-008）和患者知情同意。

1.2 主要材料、試劑和儀器 人正常淋巴細胞GM50113、MM細胞U266、NCI-H929和RPMI-8226細胞購于中國科學院上海典型培養物保藏中心細胞庫；RPMI-1640培養基和1%青霉素/鏈霉素購于Hyclone公司；10%胎牛血清購于Gibco公司；Trizol RNA提取試劑盒、Lipofectamine 3000購于Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT試劑盒、SYBR Premix EX TaqTM試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒購于日本Takara公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-TIMP2質粒，qRT-PCR引物、BCA試劑盒、4′，6－二氨基-2-苯乙烯醇（DAPI）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；miR-cortrol和miR-9-5p購于廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒、含有磷酸酶抑制劑的細胞裂解液RIPA購于北京碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購于默克生命科學技術有限公司；兔源微管關聯蛋白1輕鏈3β（MAP1LC3B）、螯合體1（SQSTM1）、TIMP2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；化學發光ECL試劑、4%多聚甲醛以及0.5% Triton X-100購于賽默飛世爾科技有限公司；雙螢光素酶報告基因分析試劑盒購于Promega公司；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀和聚丙烯酰胺電泳儀購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；流式細胞儀購于貝克曼庫爾特（中國）；倒置共聚焦熒光顯微鏡購于卡爾蔡司光學（中國）有限公司。

1.3 細胞培養及分組 將人MM細胞系U266細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基中，并置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞生長至80%后進行傳代。根據本研究的目的，實驗分為miR-對照組、miR-9-5p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TIMP2組、miR-9-5p+pcDNA3.1組、miR-9-5p+pcDNA3.1-TIMP2組。取對數生長期的細胞，接種于6孔板，待細胞生長至80%時，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書轉染，轉染6 h后，更換為完全培養液，繼續培養24 h或48 h進行后續實驗。

1.4 qRT-PCR檢測骨髓樣本和細胞中miR-9-5p和TIMP2表達 每個樣本加50 μL Trizol，提取總RNA，PrimeScriptTM RT試劑盒合成cDNA，以此為模板檢測miR-9-5p、TIMP2表達。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。[基因名稱 引物序列（5'→3'） 產物大小/bp miR-9-5p 上游：GCCCGCTCTTTGGTTATCTAG 95 下游：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT TIMP2 上游：AGCACCACCCAGAAGAAGAG 183 下游：GTGACCCAGTCCATCCAGAG U6 上游：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 113 下游：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT GAPDH 上游：TGGAGAAACCTGCCAAGTATG 120 下游：GGAGACAACCTGGTCCTCAG ][Tab.1 Primer sequence

1.5 免疫熒光實驗分析TIMP2對U266自噬的作用 轉染48 h后，300×g離心5 min收集細胞，用0.5% Triton X-100處理以及4%多聚甲醛固定，最后用DAPI在室溫下暗染5 min，通過倒置共聚焦熒光顯微鏡獲得圖像。

1.6 流式細胞術檢測miR-9-5p和TIMP2對U266細胞凋亡的作用 轉染48 h后，300×g離心5 min收集細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測自噬蛋白MAP1LC3B、SQSTM1、TIMP2的表達水平 轉染48 h后，300×g離心5 min收集細胞，并使用細胞裂解液RIPA進行裂解，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質沉淀在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉移到PVDF上，在5%BSA中封閉后，將膜與1∶1 000稀釋的一抗（MAP1LC3B、SQSTM1、TIMP2、GAPDH抗體）在4 ℃下孵育過夜，然后使用相應的1∶10 000稀釋的二抗孵育，最后用ECL試劑顯色，使用Image J進行灰度分析。

1.8 雙螢光素酶鑒定miR-9-5p與TIMP2的靶向位點 使用miRNA數據庫PITA（http：//www.pictar.org/）預測miR-9-5p和TIMP2的結合位點。將miR-對照+TIMP2 WT、miR-9-5p+TIMP2 WT、miR-對照+TIMP2 MUT以及miR-9-5p+TIMP2 MUT模擬物轉染HEK-293T細胞，在轉染后24 h收集并裂解細胞，使用雙螢光素酶報告基因檢測系統測量相對螢光素酶活性。

1.9 回復實驗驗證miR-9-5p與TIMP2的靶向作用 使用Western blot和流式細胞術驗證miR-9-5p與TIMP2的靶向作用關系。將miR-對照、miR-9-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-TIMP2、miR-9-5p+pcDNA3.1、miR-9-5p+pcDNA3.1-TIMP2轉染U266細胞，在轉染后48 h收集并裂解細胞，使用Western blot和流式細胞術測定不同分組自噬相關蛋白的表達及凋亡水平。

1.10 統計學方法 采用Graphpad prism 8.0軟件分析數據。計量資料以[[x] ±s]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗。相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人骨髓樣本、MM細胞系中miR-9-5p和TIMP2的表達水平 復發MM患者骨髓miR-9-5p表達水平明顯高于初診MM患者（5.14±2.19 vs. 1.05±0.11，t=3.231，P＜0.05），TIMP2明顯低于初診MM患者（0.65±0.19 vs. 1.02±0.07，t=3.165，P＜0.05）；Pearson分析顯示，骨髓樣本中miR-9-5p與TIMP2的表達呈負相關（r=-0.223，P＜0.05）。與正常淋巴細胞GM50113相比，3種人MM細胞系中miR-9-5p均上調，TIMP2均下調，見表2。后續實驗在差異最為顯著的U266細胞中進行。

2.2 過表達miR-9-5p抑制U266細胞的自噬和凋亡 與miR-對照組相比，miR-9-5p組MAP1LC3B-Ⅰ、SQSTM1的表達水平增加，MAP1LC3B-Ⅱ的表達水平和細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖1、2，表3。

2.3 雙螢光素酶報告基因實驗結果 PITA數據庫預測結果顯示，miR-9-5p與TIMP2的3′-UTR靶向結合，見圖3A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-對照+TIMP2 WT組相比，miR-9-5p+TIMP2 WT組螢光素酶活性降低（1.14±0.03 vs. 1.96±0.02， n=3，t=34.431，P＜0.01）；與突變型miR-對" " " " " " " 照+TIMP2 MUT相比，miR-9-5p+TIMP2 MUT組螢光素酶活性無明顯變化（1.95±0.04 vs. 2.00±0.05，n=3，t=1.507，P＞0.05）。qRT-PCR和Western blot結果顯示，與miR-對照相比，miR-9-5p組TIMP2的mRNA和蛋白表達水平下調（P＜0.05），見圖3B、表4。

2.4 過表達TIMP2對U266細胞自噬和凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TIMP2組細胞GFP熒光的表達量增加（18.33±1.32 vs. 2.05±0.23，t=21.045，P＜0.05），見圖4；Western blot實驗結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TIMP2組MAP1LC3B-Ⅰ、SQSTM1表達水平降低，MAP1LC3B-Ⅱ表達水平增加，見圖5、表5；凋亡實驗結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TIMP2組細胞的凋亡率增加，見圖6、表5。

2.5 回復實驗驗證miR-9-5靶向TIMP2抑制U266細胞的自噬和凋亡 回復實驗中，Western blot和流式凋亡實驗結果顯示，與前面miR-9-5p和TIMP2的功能實驗一致，過表達miR-9-5p抑制U266細胞的自噬和凋亡；過表達TIMP2促進U266細胞的自噬和凋亡。與miR-9-5p+pcDNA3.1組相比，當在U266細胞中同時過表達miR-9-5p和TIMP2時，自噬蛋白MAP1LC3B-Ⅱ的表達水平升高、細胞凋亡水平增加，MAP1LC3B-Ⅰ和SQSTM1的表達水平降低，見圖7、表6。

3 討論

MM是一種無法治愈的漿細胞惡性腫瘤，患者表現出非特異性癥狀，如疲勞、貧血和骨痛。在確診MM時，患者一般處于腫瘤晚期。該病病因較為復雜，深入了解其發病機制至關重要。因此，鑒定一些參與MM發病的新分子有助于更好地了解MM的發病機制和一些新的治療策略。MiR-9位于染色體1q22/5q14.3/15q26.1，在人類癌癥中作為癌基因或抑癌基因起作用。例如，miR-9通過與異黏蛋白（MTDH）靶向結合調節乳腺癌對吉西他濱的敏感性［9］。有研究顯示，過表達miR-9靶向FOXO1可抑制急性淋巴細胞白血?。ˋLL）細胞的增殖并促進ALL細胞凋亡，從而抑制ALL的進展，作為抑癌基因發揮作用［10］。據報道，來自MM患者骨髓CD138+細胞中miR-9的表達顯著增加［11］，這表明miR-9可能在MM的診斷和發病機制中起重要作用。

本研究發現，與正常淋巴細胞相比，miR-9-5p在MM細胞系中的表達水平顯著升高，復發MM患者的表達水平高于初診患者，在MM患者中與TIMP2呈負相關。進一步通過體外實驗證實過表達miR-9-5p抑制了U266細胞的自噬和凋亡，與以往的研究結果一致［4］，提示miR-9-5p在MM中是一個促癌因子。

本研究通過螢光素酶報告基因和qRT-PCR、Western blot實驗鑒定出腫瘤基因TIMP2是miR-9-5p的直接靶標。TIMP2是金屬肽酶組織抑制劑家族的成員，可通過與活性位點以1∶1的化學劑量結合來抑制基質金屬肽酶的活性［12］。據文獻［13-14］報道，TIMP2可抑制乳腺癌、胃癌和結腸癌等腫瘤細胞的增殖和轉移。近年來，TIMP2被證明受多種miRNA的調控。Liu等［15］觀察到miR-106a-5p通過調控TIMP2抑制破骨細胞的分化和活性，從而影響破骨細胞的生成。MiR-106b-5p通過靶向結合TIMP2促進宮頸鱗狀細胞癌細胞的惡性增殖［16］。本研究發現，與初診MM患者相比，TIMP2在復發性MM患者骨髓樣本中的表達水平降低；與正常淋巴細胞GM50113相比，TIMP2在MM細胞系中的表達水平顯著降低，提示TIMP2低表達可能在MM的發生發展中發揮重要作用。體外實驗進一步證實過表達TIMP2可促進U266細胞自噬，Western blot實驗再次驗證了過表達TIMP2促進MAP1LC3B-Ⅰ向MAP1LC3B-Ⅱ的轉換，MAP1LC3B-Ⅰ表達水平降低，MAP1LC3B-Ⅱ表達水平增加，這與以往的研究結果相符［17］。流式凋亡實驗結果顯示，過表達TIMP2促進U266細胞的凋亡。上述結果提示過表達TIMP2可能是通過促進MM細胞的自噬和凋亡從而抑制MM的發生發展。在回復實驗中，與miR-9-5p組相比，miR-9-5p+pcDNA3.1-TIMP2組細胞的自噬和凋亡水平增加，即pcDNA3.1-TIMP2緩解了miR-9-5p對U266細胞自噬和凋亡的抑制，再次證明了miR-9-5p對TIMP2的調控作用。

綜上所述，MM細胞系中miR-9-5p顯著上調，TIMP2顯著下調。此外，miR-9-5p可能通過靶向TIMP2抑制U266細胞的自噬和凋亡，miR-9-5p可能在MM中發揮促癌基因的作用。

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（2024-01-12收稿 2024-04-11修回）

（本文編輯 胡小寧）