中美食品中金黃色葡萄球菌檢驗標準的異同

關鍵詞：食品，金黃色葡萄球菌菌，檢驗，標準，比較

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.011.030

0引言

金黃色葡萄球菌，革蘭氏染色呈陽性，是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于肉類、禽類、蛋類、乳制品等食品中。在適當的條件下，金黃色葡萄球菌能夠產生腸毒素，引起食物中毒。由金黃色葡萄球菌引發的食物中毒事件時有發生，據統計，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件占食源性微生物總食物中毒事件的25%左右，僅次于沙門氏菌和副溶血桿菌，是第三大食源性致病菌。考慮到金黃色葡萄球菌感染的嚴重性，對金黃色葡萄球菌進行準確地鑒定就顯得非常重要了。對于食品中金黃色葡萄球菌的檢驗，科研人員開發了不少新型的檢驗方法，但當前最權威的檢驗方法仍是國家檢驗標準。不同國家采用了不同的檢驗標準。中國所采用的檢驗標準為GB 4789.10—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》。美國所采用的檢驗標準為美國食品藥品監督管理局（FDA）所制定的細菌分析學手冊（Bacteriological Analytical Manual，簡稱BAM）第八版，其最新版本為2019年12月份修訂版本。

FDA所制定的食品標準以科學、嚴謹與細致在世界范圍內廣受認可，對FDA制定的食品金黃色葡萄球菌檢驗標準與我國現行標準進行深入分析對比對我國食品中金黃色葡萄球菌的檢驗及食品安全水平的提升具有重要的意義。本文從異同兩方面對中美兩國食品中金黃色葡萄球菌的檢驗標準進行了比較分析，以期未來對我國食品中金黃色葡萄球菌檢驗標準的修訂做出貢獻。

1兩種檢驗標準的相同之處

兩種檢驗標準所包含的檢驗方法中都有平板計數法與MPN（Most Probable Number，最大可能數）計數法。其中，平板計數法都適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數，MPN計數法都適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品中金黃色葡萄球菌的計數。雖然兩種標準中平板計數法與MPN計數法的具體操作有所不同，但其鑒定的原理及步驟大致相同，都是先進行培養，后依賴形態觀察、生化試驗等手段對可疑菌落進行鑒定。

兩種檢驗標準中，都選擇了Baird-Parker平板作為分離平板，并且都規定Baird-Parker平板上生長的典型可疑菌落的表型需要滿足以下條件：呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，菌落直徑為2～3mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色（非白色）的邊緣，周圍繞以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰帶，當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。兩種檢驗標準對非典型菌株的規定也相同：有時可見到不分解脂肪的菌株，除沒有不透明圈和清晰帶外，其他外觀與常見典型菌落外觀基本相同；從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，且外觀可能較粗糙，質地較干燥。兩種檢驗標準中，對可疑菌落進行鑒定的最關鍵生化試驗均為血漿凝固酶試驗。進行血漿凝固酶試驗時，兩種標準中都規定，要同時用血漿凝固酶試驗確證陽性和陰性的菌株進行對照試驗。

2兩種檢驗標準的不同之處

2.1檢驗標準中方法數量的不同

GB 4789.10—2016除了平板計數法與MPN計數法外，還有一種金黃色葡萄球菌的定性檢驗方法，這個方法在FDA標準中是沒有的。

此方法的具體操作步驟為先將樣品進行處理，再取處理后的25g（mL）樣品置于盛有225 mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶中進行培養。增菌后的培養物分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板進行再培養，根據兩種平板上的菌落特征進行初步鑒定后，再利用染色鏡檢、血漿凝固酶試驗等方式對可疑菌落進行確證鑒定。

2.2檢驗標準適用范圍的不同

GB 4789.10—2016中既有金黃色葡萄球菌的定性檢驗方法，也有金黃色葡萄球菌的定量檢驗方法，因此其既適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗，也適用于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢驗。FDA的檢驗標準中只有定量檢驗方法，因此其只能適用于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢驗。

2.3平板計數法的不同之處

GB 4789.10-2016規定涂布后的Baird-Parke平板倒置后于36±1℃培養24～48 h。FDA的標準則規定平板倒置后要在35～37℃培養45～48 h。

GB 4789.10—2016要求從典型菌落中至少選5個可疑菌落（小于5個全選）進行鑒定試驗。分別做染色鏡檢，血漿凝固酶試驗；同時劃線接種到血平板36±1℃培養18～24h后觀察菌落形態，金黃色葡萄球菌菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。

FDA的標準也要求對可疑菌落進行鑒定，規定血漿凝固酶試驗特別明顯，試管傾斜或倒置時也能形成牢固且完整的凝塊才能被認為是金黃色葡萄球菌陽性?？梢删溲獫{凝固酶試驗中導致部分凝血的，以前被認定是2+和3+凝固酶反應的，必須進行輔助試驗，輔助試驗的內容包括過氧化氫酶試驗、葡萄糖厭氧利用試驗、甘露醇厭氧利用試驗、金葡溶菌酶敏感性試驗、耐熱核酸酶試驗（輔助）。進行輔助實驗的目的主要是為了排除與金黃色葡萄球菌親緣關系相近的表皮葡萄球菌及微球菌。FDA還規定，如果需要進行更快速的鑒定，可以用膠乳凝集試驗（AUREUS TESTTM，Trisum Corp.，Taipei，臺灣）代替凝固酶試驗。

血漿凝固酶試驗是金黃色葡萄球菌可疑菌落確證的最關鍵生化試驗，兩種標準中血漿凝固酶試驗的具體操作步驟也有所不同。GB 4789.10—2016中的具體操作步驟為：（1）挑取可疑菌落，分別接種到5 mL BHI和營養瓊脂小斜面，36±1℃培養18～24 h。（2）取新鮮配制兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI培養物0.2～0.3 mL，振蕩搖勻，置36±1℃溫箱或水浴箱內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊或凝固體積大于原體積的一半），被判定為陽性結果。（3）結果如可疑，挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5 mLBHI，36±℃培養18～48 h，重復試驗。FDA標準中此試驗的具體操作步驟則為：（1）將可疑的金黃色葡萄球菌菌落轉移到含有0.2～0.3 mLBHI肉湯的小管中，并徹底乳化。（2）用合適的維持培養基（如TSA）的瓊脂斜面接種一圈BHI懸浮液。在35～37℃培養BHI懸浮液和瓊脂斜面18～24 h。將瓊脂斜面保持在室溫下進行輔助或重復測試，以防凝固酶測試結果有問題。（3）向BHI培養物中加入0.5 mL含有EDTA的重組凝固酶兔血漿，并充分混合。在35～37℃下培養，并在6h內定期檢查血栓形成情況。

對于平板上可疑菌落的計數，GB 4789.10—2016考慮到了5種不同的具體情況，并規定了具體運算規則。這5情況分別為：（1）若只有一個稀釋度平板的典型菌落數在20～200 CFU之間，計數該稀釋度平板上的典型菌落；（2）若最低稀釋度平板的典型菌落數小于20 CFU，計數該稀釋度平板上的典型菌落；（3）若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200 CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；（4）若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200 CFU，而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20～200 CFU范圍內，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；（5）若2個連續稀釋度的平板典型菌落數均在20～200 CFU之間，需按標準中規定的公式計算。FDA的標準對可疑菌落計數方面的規定包括以下三點內容：（1）選擇含有20～200個菌落的平板，除非只有稀釋度較低（gt;200個菌落）的平板具有金黃色葡萄球菌的典型菌落；（2）當最低稀釋度的平板含有lt;20個典型菌落時，計數該稀釋度的平板；（3）如果含有gt;200個菌落的平板具有金黃色葡萄球菌的典型菌落，并且在較高稀釋度下沒有出現典型菌落，則使用此稀釋度的平板計數金黃色葡萄球菌，但不計算非典型菌落。與GB 4789.10—2016相比，FDA的計數規定不夠細致具體。

2.4 MPN計數法的不同之處

兩國標準中樣品稀釋液接種的培養基及培養條件有所不同。GB 4789.10—2016規定，根據對樣品污染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別接種1 mL樣品勻液至7.5%氯化鈉肉湯管（如接種量超過1 mL，則用雙料7.5%氯化鈉肉湯），每個稀釋度接種3管，將上述接種物36±1℃培養18～24 h。FDA的標準則規定，將樣品進行10倍梯度稀釋，分別接種不同濃度的1mL梯度稀釋液至3管含有10%NaCl和1%丙酮酸鈉的TSB液體培養基。其中最高稀釋度必須給出負終點。將試管在35～37℃培養48±2 h。

3結語

從當前來看，農殘、有機物、獸殘、重金屬、食品添加劑等因素對我國食品安全的威脅仍然很大，但從發達國家的經驗來看，隨著經濟社會水平的迅速發展，這些因素對我國食品安全的影響會越來越小，微生物在食品安全中所占的比重會越來越高。做好食品中微生物的檢測，既是立足當下，又是放眼未來。從這個角度來講，制定更科學嚴格的檢測標準不斷提高食品微生物檢測水平就顯得特別重要。要想制定更科學的標準，既要進行深入的科學研究，廣泛征求一線檢測人員的意見建議，還要借鑒其他國家及國際組織檢驗標準中的先進之處。

從中美食品中金黃色葡萄球菌的對比分析中可以看出，兩國檢驗標準的原理是相似的，但在具體操作步驟上有所不同。對于這些不同點，需要用科學實驗去進行研究，比較下哪國的檢驗方法更科學。對于美國標準中更科學的地方，可以在將來我國標準的修訂過程中予以吸收，以提高我國的食品安全標準水平。兩國檢驗標準的不同之處有以下三點值得特別注意：一是血平板使用的必要性。在中國的檢驗標準中，血平板是一種重要的金黃色葡萄球菌可疑菌落鑒別手段，但在美國的檢驗標準中此方法并未提及。二是血漿凝固酶試驗結果不明顯時進一步測試的必要性。美國對于可疑菌落的血漿凝固酶試驗結果進行了分級，規定血漿凝固酶試驗結果等級較低的需要做輔助試驗進行驗證，這在我國的檢驗標準中未有提及。三是關鍵培養基的效果。兩國在有些具體試驗中選用的培養基品種有所不同，如在MPN計數法中，我國用到的增菌培養基為7.5%氯化鈉肉湯，美國用到的增菌培養基為含有10%NaCl和1%丙酮酸鈉的TSB液體培養基。增菌培養基對檢驗效果有直接的影響，需要進行更細致的研究以挑選出增菌效果更好的培養基。

作者簡介

楊金眾，本科，工程師，研究方向為食品檢驗檢測。

丁衛平，碩士研究生，高級工程師，研究方向為食品檢驗檢測。

潘艦，碩士研究生，工程師，研究方向為食品檢驗檢測。

（責任編輯：袁文靜）