生物脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫構建與鑒定

摘要以黃瓜抗病高代自交系D9320為試驗材料，采用Gateway技術構建了黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫。結果表明：酵母文庫克隆數為350個，文庫滴度為3.5×107CFU/mL，重組率達到100%，插入片段長度在750～2000bp，平均片段長度超過1000bp。文庫容量和重組率及插入片段大小均說明霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫構建成功，可用于黃瓜雙抗機制互作蛋白的篩選。

關鍵詞黃瓜霜霉病；黃瓜棒孢葉斑病；cDNA文庫；酵母雙雜交

中圖分類號S432.1"文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2025）02-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

ConstructionandIdentificationofCucumberYeastTwo-hybridcDNALibraryUnderBiologicalStress

LIUDong，PANChun-qing，ZHANGYan-ju

（CollegeofPlantProtection，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin，Heilongjiang，150030）

AbstractAyeasttwo-hybridcDNAlibraryofcucumberwasconstructedbyGatewaytechnologyunderthestressofPseudoperonosporacubensisandCorynesporacassiicolausingthediseaseresistantinbredlineD9320.Theresultsshowedthatthenumberofyeastlibrarycloneswas350，thetiteroflibrarywas3.5×107CFU/mLandtherateofrecombinationwas100%.Thelengthofallthefragmentswas750-2000bp.Theaveragelengthwasmorethan1000bp.TheyeasttwohybridcDNAlibraryofcucumberunderthestressofPseudoperonosporacubensisandCorynesporacassiicolawasconstructedsuccessfully，whichcouldbeusedforscreeninginteractionproteinsofthedouble-diseaseresistancemechanismincucumber.

KeywordsCucumberdownymildew;Cucumbertargetleafspot;cDNAlibrary;Yeasttwo-hybrid

黃瓜（CucumissativusL.）是重要的蔬菜作物之一，在我國主要以保護地栽培為主。黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病是黃瓜生產中的重要病害，傳播流行速度快，一旦發生難以控制，嚴重影響黃瓜產量及品質。化學藥劑雖能短期快速控制病害使其發展緩慢，但長期用藥必然會造成污染、殘留以及病原菌耐藥性等問題。因此，選育雙抗品種是防治黃瓜病害最安全和高效的方法之一。

常規育種周期長，利用分子生物學技術進行雙抗品種的培育可大大縮短育種周期。黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗分子機制研究還不深入，單一病害的抗性遺傳規律研究結果仍不一致。國外學者Abul-Hayja等^［1］將棒孢葉斑病抗、感親本進行雜交，發現1對參與調控黃瓜對棒孢葉斑病的顯性抗病基因Cca。國內學者與國外學者研究結果相反，2010 年王惠哲等^［2］研究結果顯示，黃瓜棒孢葉斑病的抗性并非由顯性基因控制，而是由隱性基因調控，感病性狀與抗病性狀相比，感病性狀呈顯性且為不完全顯性。2015年Wen等^［3］利用 D31（抗病親本）與 D5（感病親本）雜交獲得隱性抗病基因Cca-3。1990年至今，大部分霜霉病抗性遺傳規律研究結果顯示抗性是由多個基因控制^［4-5］，少數研究顯示抗性是由單一基因控制^［6］。

隨著黃瓜遺傳轉化技術體系的建立與優化，使霜霉病和棒孢葉斑病抗病基因的研究不僅僅局限在遺傳規律分析及定位，Wang等^［7］使用抗、感材料，多時間點接種進行轉錄組測序分析，發現了146個差異基因，其中包括轉錄因子、激素、Ca²⁺代謝通路和防御類基因等多種類型。新鑒定出7個與抗黃瓜棒孢葉斑病相關的miRNAs，在黃瓜植株內過表達CsNAC、CsAPE、Cs4CL 和 CsPAL 能增強黃瓜植株對棒孢葉斑病的抗病性。2017年以來，劉東等^［8-12］對黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病雙抗機制進行品種抗病性、組織病理學觀察及分子雙抗機理研究。利用轉錄組測序技術挖掘到了雙抗相關基因CsERF004、CsCBS和CsGASA4，過表達CsERF004的株系對黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病的抗病性明顯增強，CsCBS和CsGASA4能夠積極響應2種病原菌的脅迫。目前，已明確CsERF004與黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病有關，但與其相關的互作蛋白尚不清楚，黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗反應的調控網絡不清晰。

酵母雙雜交cDNA文庫是研究蛋白互作的方法之一。通過構建酵母雙雜交cDNA文庫，可以用來篩選目標基因的互作蛋白，對研究基因調控網絡將有很大幫助。酵母雙雜交技術應用于不同脅迫下的多種作物。在番茄作物中，構建了生物脅迫（葉霉菌侵染）和非生物脅迫（干旱脅迫）下的酵母雙雜交cDNA文庫^［13-14］；青枯病菌脅迫下的茄子酵母雙雜交文庫被構建^［15］；大麗輪枝菌生物脅迫下和激素非生物脅迫下的棉花酵母雙雜交文庫被構建等^［16］。黃瓜酵母雙雜交文庫的構建僅見在黃瓜發育性狀上^［17］，缺乏病原菌生物脅迫下的黃瓜酵母雙雜交文庫的構建。

筆者采用Gateway技術，以黃瓜抗病高代自交系D9320為試驗材料，構建霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫。文庫的構建將為解析黃瓜對霜霉病和棒孢葉斑病雙抗反應中的調控網絡奠定基礎，為深入研究黃瓜雙抗分子機制及品種培育提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗病黃瓜高代自交系D9320由東北農業大學園藝園林學院黃瓜課題組提供。黃瓜棒孢葉斑病菌由天津科潤黃瓜研究所贈予。

黃瓜霜霉病菌采集自東北農業大學園藝試驗站。載體：購自Invitrogen公司的pDONR222及pGADT7-DEST。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌脅迫處理。

黃瓜材料的準備：播種前先進行種子表面消毒，消毒使用3%次氯酸鈉溶液。用準備好的消毒液浸泡黃瓜種子10min進行種子表面消毒。消毒后使用無菌水清洗種子，洗去殘留的消毒液，提前準備好裝有濾紙的培養皿，將消毒好的種子擺放在培養皿內，加入無菌水保濕。28℃避光催芽1d，0.5cm胚根長出后即可進行播種。播種后將其置于設置好溫度及光照（26℃/18℃、16h/8h光周期）的人工氣候箱中培養。

孢子懸浮液的配制：①棒孢葉斑病，使用PDA培養基培養黃瓜棒孢葉斑病菌，28℃培養箱內培養7d后，無菌水沖洗培養基表面菌絲，用3層滅菌紗布對沖洗液進行過濾，過濾后在顯微鏡下將孢子懸浮液濃度調至1×105個孢子/mL。②霉病：用毛刷將采集到的病葉上的孢子囊刷到裝有無菌水的燒杯中，將孢子懸浮液濃度調至5×103個孢子囊/mL。

接種處理：待黃瓜植株第1片真葉展平時，采用點滴法將2種配制好的孢子懸浮液交叉點滴各15滴，每滴20L。接種后至少保濕24h。

取材時間：接種12、24、48、72、96h后，使用手術剪剪下第1片真葉，錫紙包裹好樣品立即置于液氮中冷凍，冷凍后在-80℃冰箱保存，為后續RNA提取作準備。

1.2.2RNA提取、mRNA分離及純化。

采用Trizol 法進行黃瓜植物葉片總RNA的提取^［18］。mRNA分離的具體操作步驟則按照Invitrogen公司的產品Oligotex mRNA Midi Kit說明書進行分離。mRNA的純化需要用到糖原、NH4OAC及無水乙醇，所用體積分別為2 L、0.5倍體積和2.5倍體積。mRNA與3種藥品混勻，最后通過無水乙醇進行清洗則獲得純化的mRNA。

1.2.3病原菌脅迫下黃瓜cDNA初級文庫的構建。

病原菌脅迫下黃瓜cDNA初級文庫構建的具體操作按照CloneMiner試劑盒（Invitrogen公司）說明書進行，依次完成cDNA第1鏈和第2鏈的合成，cDNA與三框attB1重組接頭連接，cDNA分級分離及收集，BP重組反應和電轉化大腸桿菌DH10B。最終將電轉物移至新的15mL離心管中。培養條件為37℃，225～250r/min培養1h，使用涂布棒將培養的菌液涂布于含有Kan抗性的LB培養基平板上進行庫容量的鑒定；剩余培養物按照1∶1的體積加入50%甘油存于-80℃，即為初級文庫菌液。

1.2.4病原菌脅迫下黃瓜cDNA次級文庫的構建。

提取初級文庫的質粒，進行LR重組反應體系的建立。反應體系中包括初級文庫質粒、pGADT7-DEST、LRClonaseⅡMix和ddH2O，所用體積分別為1μL（300ng/L）、1μL（300ng/L）、4和14μL；反應條件：25℃，16～20h。將LR重組反應的產物通過電轉化法將其轉入大腸桿菌DH10B菌株中。最終將電轉物移至新的15mL離心管中。培養條件為37℃，225～250r/min培養1h，使用涂布棒將培養的菌液涂布于含有Amp抗性的LB培養基平板上進行庫容量的鑒定；剩余培養物按照1∶1的體積加入50%甘油存于-80℃，即為次級文庫菌液。

1.2.5初級文庫和次級文庫的鑒定。

通過計算文庫總CFU、重組率和插入片段長度對初級文庫和次級文庫的質量進行鑒定。將2個文庫的菌液分別進行稀釋，每個文庫取稀釋好的100倍菌液50L。使用涂布棒在含有Kan抗性和Amp抗性的LB平板上分別進行涂布。觀察平板上的克隆數量，根據如下公式計算文庫總CFU。隨機選取平板上的克隆，選取24個進行菌落PCR，通過凝膠電泳結果對重組率和插入片段長度進行鑒定。

CFU/mL=平板上的克隆數/50μL×100倍×1×103μL

文庫總CFU=CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）

1.2.6病原菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交文庫構建與鑒定。

次級文庫質粒的提取使用諾維贊試劑盒，操作流程參照說明書。將次級文庫質粒轉入酵母Y187菌株中，完成酵母工作液的制備。使用涂布棒將酵母菌液（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋液）涂布在SD/-Leu平板上，每個平板涂布100L稀釋液。培養條件為30℃培養3～6d，檢測轉化效率。按照“1.2.5”中的公式進行庫容量的計算。隨機選取平板上的克隆，選取24個進行菌落PCR，通過凝膠電泳結果對重組率和插入片段長度進行鑒定。

2結果與分析

2.1mRNA與dscDNA的檢測

黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫后的12、24、48、72和96h，將黃瓜葉片混合進行RNA的提取并進行mRNA分離。1%瓊脂糖凝膠檢測mRNA，結果如圖1所示，mRNA在250～2000bp彌散均勻，質量好。檢測dscDNA顯示，彌散區間較大，質量好。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結果說明dscDNA可以用于后續的黃瓜酵母cDNA文庫的構建。

2.2初級文庫構建與鑒定

將構建好的初級文庫菌液稀釋100倍后，使用涂布棒將50L菌液涂布于含有Kan抗性的LB培養基平板上進行庫容量的鑒定。如圖2所示，在LB平板上共長出了1300個克隆。通過“1.2.5”中的公式進行初級文庫庫容量的計算，結果為1.04×107CFU。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，每個克隆均有條帶，結果顯示，重組率達到100%（圖2），PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，片段在500～2000bp，平均片段長度大于1000bp，在500～750bp的片段僅1個。根據文庫容量和重組率以及插入片段大小均說明構建的初級文庫質量較好，可以進行次級文庫的構建。

2.3次級文庫構建與鑒定

將構建好的次級文庫菌液稀釋100倍后，使用涂布棒將50L菌液涂布于含有Amp抗性的LB培養基平板上進行庫容量的鑒定。如圖3所示，在LB平板上共長出了1500個克隆。根據“1.2.5”中的公式計算初級文庫容量為1.20×107CFU。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR，每個克隆均有條帶，重組率達到100%（圖3）。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，平均片段長度大于1000bp，無低于500bp的條帶。文庫容量和重組率及插入片段大小均說明次級文庫質量較好，成功構建了次級文庫。

2.4病原菌脅迫下黃瓜酵母cDNA文庫鑒定

將構建好的次級文庫菌液提取質粒后轉化到酵母菌中，酵母菌液進行稀釋（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋液），取10000倍稀釋液100L用涂布棒涂布在SD/-Leu平板上，30℃培養3～6d，檢測文庫滴度。如圖4所示，克隆數為350個，根據“1.2.5”中的公式計算文庫滴度為3.5×107CFU/mL。隨機對24個克隆進行菌落PCR，每個克隆均有條帶，重組率達到100%，所有片段長度大于750bp，24個克隆中23個克隆片段大于1000bp。文庫容量和重組率及插入片段大小均說明病原菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫構建成功。

3討論與結論

黃瓜棒孢葉斑病是由多主棒孢霉死體寄生的病原菌侵染引起的一種真菌病害。黃瓜霜霉病是一種由藻物界卵菌門古巴假霜霉菌活體寄生的病原菌侵染引起的卵菌病害。當環境條件適宜時2種病害發生嚴重，且流行速度極快。植物在自然條件下會遭受多種病原物的侵染，但其對大多數病原物侵染都會呈現出不同的抗性策略。病原物為了能夠成功侵染宿主就會分泌毒素，突破一系列物理屏障，使植物對該病原物表現為感病，正是由于這種病原物與植物之間的相互作用形成了植物的先天免疫系統^［19］。

有研究發現，過表達CsERF004能夠增強黃瓜對霜霉病和棒孢葉斑病的抗性，同時增加了水楊酸和乙烯的含量，且使CsPR1和CsPR4上調表達^［20］。關于ERF轉錄因子的互作蛋白的研究，有文獻顯示STK 能夠通過磷酸化增強 ERF 的活性，使 ERF 表達，同時增強ERF激活PR蛋白表達的活性。Gu等^［21］通過酵母雙雜交的試驗發現 ERF 轉錄因子 Pti4 編碼蛋白與 STK 類抗病基因 Pto 編碼蛋白互作，過表達 Pto 能夠使 Pti4 上調表達，同時激活 PR 基因 GluB 和Osm 的表達。Song 等^［22］研究結果表明，AtERF7 能夠被絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶 PKS3 磷酸化。

酵母雙雜交cDNA文庫是一種很好的挖掘互作蛋白，探究調控網絡及解析分子機理的技術手段^［23］。黃瓜作物缺乏病原菌脅迫后的酵母雙雜交文庫的構建，進行文庫構建將為黃瓜抗霜霉病與棒孢葉斑病雙抗分子機理的研究奠定基礎。利用Gateway技術構建酵母雙雜交cDNA文庫對RNA質量的要求高，但在后續篩選互作蛋白過程中既可以使用Mating法又可以使用共轉法，有利于互作蛋白篩選的順利進行。由于Smart技術后續篩庫中只能利用Mating的方法，對于篩庫的成功率不敢保證，因此筆者選用Gateway方法進行文庫的構建^［14］。通過對高代抗病自交系D9320接種黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌后的黃瓜葉片不同時間點進行取材，混合樣品進行RNA的提取、mRNA分離。mRNA和ds cDNA電泳結果彌散均勻，質量好。初級文庫庫容量為1.04×107 CFU，次級文庫庫容量為1.20×107 CFU，且重組率均達到100%，插入片段均大于1 000 bp。轉化酵母菌后，100 μL 10 000倍酵母稀釋液克隆數為350個，文庫滴度為3.5×107 CFU/mL，重組率達到100%，所有片段長度大于750 bp，24個克隆中23個克隆片段大于1 000 bp。這說明該研究中構建的霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫質量高。

該研究完成了黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫的構建，下一步將進行互作蛋白的篩選，研究抗病基因調控網絡，解析黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗分子機理，為黃瓜抗病育種提供理論基礎。

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