紅大戟根腐病病原鑒定及其生物學特性

摘要［目的］分離、鑒定紅大戟根腐病的病原菌及掌握該病原菌的生物學特性。［方法］根據病原菌形態特征，結合ITS-5.8SrDNA、tub2和ACT序列分析，依據柯赫氏法則進行致病性試驗。［結果］從接種植株中重新分離出形態一致的病原菌，并將其鑒定為大豆莖點霉（Boeremiaexigua）。生物學特性研究表明，病原菌最適生長培養基為PDA培養基，最適生長溫度為20℃或25℃，最適培養的pH為5；最適碳源是乳糖，最適氮源是硝酸鉀。［結論］這是B.exigua在中國引起紅大戟根腐病的首次報道；掌握其生物學特性，為紅大戟根腐病的防治奠定理論基礎。

關鍵詞紅大戟；根腐病；大豆莖點霉；鑒定；生物學特性

中圖分類號S435.672"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2025）02-0178-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.035

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

IdentificationandBiologicalCharacteristicsoftheRootRotPathogenofKnoxiaroxburghii

LIUChun-juZHANGLei"LIHeng3etal

（1.CollegeofTraditionalChineseMedicine，YunnanUniversityofChineseMedicine，Kunming，Yunnan650500;2.CollegeofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201;3R＆DCenterofYunnanYuntianhuaCo.，Ltd.，Kunming，Yunnan650228）

Abstract［Objective］InordertoisolateandidentifythepathogenofrootrotofKnoxiaroxburghiiandmasterthebiologicalcharacteristicsofthepathogen.［Method］Accordingtothemorphologicalcharacteristicsofthepathogen，combinedwithITS-5.8SrDNA，tub2andACTsequenceanalysis，thepathogenicitytestwascarriedoutaccordingtoKoch’sRule.［Result］Themorphologicallyconsistentpathogenwasre-isolatedfromtheinoculatedplantsandfinallyidentifiedasBoeremiaexigua.ThestudiesofbiologicalcharacteristicsshowedthattheoptimumgrowthmediumofpathogenwasPDA，theoptimumgrowthtemperaturewas20℃or25℃，andtheoptimumpHwas5.Theoptimumcarbonsourcewaslactose，andtheoptimumnitrogensourcewaspotassiumnitrate.［Conclusion］ThisisthefirstreportofB.exiguacausingrootrotofK.roxburghiiinChina.MasteringitsbiologicalcharacteristicswilllayatheoreticalfoundationforthepreventionofrootrotofK.roxburghii.

KeywordsKnoxiaroxburghii;Rootrot;Boeremiaexigua;Identification;Biologicalcharacteristics

紅大戟［Knoxia roxburghii（Sprengel）M.A.Rau］為茜草科（Rubiaceae）紅芽大戟屬（Knoxia）植物，為多年生草本^［1-2］，其主要化學成分有蒽醌及三萜類，蒽醌類也是抗腫瘤藥物的重要來源，可用于治療癌癥，具有瀉水逐飲、消腫散結等功效^［3］，因其療效顯著，在臨床上得到大量廣泛應用，是紫金錠（散）、骨通貼膏等上百種上市中成藥的原料^［4-5］。隨著紅大戟塊根需求量的增長，供不應求的市場業績激發了農民的種植熱情，紅大戟在野生引種馴化過程中病害問題也頻繁發生，以根部病害尤為突出，這嚴重阻礙了紅大戟產業的健康發展。2021年云南省大理白族自治州祥云縣紅大戟種植示范基地紅大戟根腐病發病情況嚴重，該病田間發病率為15%～30%，對紅大戟的產量和品質影響較為嚴重。目前，紅大戟的根腐病病原菌及發病原因尚不清楚。為此，該研究擬采用形態學和分子生物學的方法，對所分離的病原菌進行鑒定，并對其致病性進行驗證，開展病原菌的生物學特性研究，為該類病害的防治奠定一定的基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

2022年8月，以云南省祥云縣紅大戟種植示范基地的紅大戟根腐樣品為研究對象，對其進行病原菌的分離和鑒定。一年生長勢良好的紅大戟（云戟1號）進行后續的接種試驗^［6］。

1.2菌株分離與純化

將腐爛的紅大戟病根用流動的自來水沖洗干凈，用解剖刀將病健交界部位切成0.5 cm×0.5 cm的薄片，75%乙醇和1% NaClO滅菌后用無菌水漂洗3～5次。采用無菌濾紙吸干水分后轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，在25～28 ℃下進行3 d的培養得到純化菌株^［7］。

1.3形態學鑒定

將純化后的菌株接種于PDA培養基、燕麥瓊脂（OA）培養基上，25～28 ℃暗培養10 d后觀察菌落形態。載玻片上滴入無菌水后挑取小黑點及菌絲放入，利用顯微鏡觀察孢子及菌絲形態，顯微鏡拍照后孢子大小用ImageJ軟件測量^［7］。

1.4DNA提取與分子鑒定

簡化的CTAB法用于提取病原菌菌絲DNA，用引物ITS1/ITS4^［8］、Bt2a/Bt2b^［9］和ACT-512F/ACT-783R^［10］分別擴增核糖體內源ITS-5.8S rDNA、tub2和ACT區域。組裝后的核苷酸序列，經NCBI中的Blastn比對后，利用軟件MEGA-X中的鄰接法構建近緣菌株的系統發育樹^［7］。

1.5致病性驗證

采用菌絲塊接種方法進行致病性檢測，無菌土種植的一年生紅大戟幼苗，將在PDA培養基上培養10d的病原菌，用無菌手術刀切成5mm×5mm，每株根邊接種10塊，以無菌未接種病原菌菌絲的PDA培養基為對照。每個處理10株，重復3次。置于25℃、相對濕度70%條件下培養40d，統計植株的發病情況。從感病的紅大戟根上再次進行病原菌的分離與鑒定，以驗證柯赫氏法則。

1.6病原菌的生物學特性

1.6.1

病原菌最適培養基的篩選。選取實驗室常用的5種培養基（PDA、PSA、MEA、CMD、WA）。病原菌在PDA培養基上培養10 d后，打取直徑為5 mm的邊緣菌餅接種到以上5種培養基上，用封口薄膜密封。每個處理重復3次。在25 ℃黑暗條件下，以十字形交叉法測定各病原菌在不同培養基上的生長情況，直至有處理長滿培養皿（90 mm）后停止記錄^［11］。

1.6.2溫度對病原菌生長的影響。選取PDA培養基作為基礎培養基，5mm的病原菌接種到PDA培養基中心，封口膜密封后做好標記，放置于15、20、25、30℃的恒溫培養箱中培養，每個處理重復3次，菌落測量方法同“1.6.1”。

1.6.3初始pH對病原菌生長的影響。選取PDA培養基作為基礎培養基，用0.1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液配制相應濃度的培養基（pH4～pH14），共計11個濃度。平板制好后接入5mm的病原菌邊緣菌餅，置于25℃培養箱中暗培養，處理重復和菌落測量方法同“1.6.1”。

1.6.4不同碳氮源對病原菌生長的影響。選取PDA培養基作為基礎培養基，分別用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸鉀、氯化銨作為氮源，以未加碳源和氮源的培養基作為對照（CK）。選取等摩爾的碳原子和氮原子代替基礎培養基中的碳源和氮源，培養皿平板制好后，接種及測量方法同“1.6.1”。

2結果與分析

2.1紅大戟根腐病田間癥狀

患病的紅大戟根部為褐色至深褐色，葉片伴有枯萎癥狀，莖基為褐色，根部內部病斑切面呈紅棕色（圖1）。綜合發病特點及癥狀，將該病稱為紅大戟根腐病。

2.2病原菌的形態特征

從典型的根腐病癥狀的發病紅大戟上分離獲得與Boeremia spp.菌落形態結構相似的菌株有10株。菌落在PDA培養基上培養初期為灰白色，之后變成淡橄欖綠色，氣生菌絲發達，菌絲表面有無色透明小水珠，邊緣呈白色的耦節狀，背面黑褐色（圖2A、B）。在OA培養基培養 30 d 后有分生孢子基質產生（黑色小點）（圖2C）。分生孢子橢圓到長圓，單孢無隔膜，大小（2.6～6.9）μm×（1.5～3.1）μm（圖2D）；無厚垣孢子^［12］。

2.3病原菌的分子生物學鑒定

隨機挑選3株病原菌，單孢分離純化后，提取菌絲DNA后用ITS、tub2和ACT 3對引物進行擴增測序。結果顯示，組裝后的3株病原菌的核苷酸序列是一致的。選擇一株具有代表性的序列上傳至NCBI。ITS序列（OR142417）與Boeremia exigua（MT154624）相似性為100%（518/533 bp）；tub2序列（OR146750）與B.exigua（OP611567）相似性為100%（316/335 bp）；ACT序列（OR146751）與B.exigua（OP611566）相似性為100%（231/247 bp）。以ITS、tub2和ACT 3對引物序列構建系統發育樹結果顯示（圖3），該菌株與B.exigua聚在同一分支上，其分支的自舉值為99%。根據該菌的形態學和分子生物學鑒定結果，將該病原菌鑒定為大豆莖點霉（B.exigua）^［13］，命名為ByF12。

2.4病原菌的致病性

將一年生紅大戟幼苗（云戟1號）根部接種病原菌ByF12（5mm2）菌絲塊10塊于25℃光照培養箱（70%相對濕度，12h光照/黑暗）中培養，每個處理10株，3次重復，以接種無病原菌的PDA培養基為對照，接種40d后，所有接種植株根部均出現了黑褐色的腐爛癥狀，而對照無病狀（圖4）。從再次感病的紅大戟根中能重新分離得到形態學和測序結果與前面保持一致的病原菌，以驗證柯赫氏法則，由此證明B.exigua是引起紅大戟根腐病的病原菌。

2.5病原菌的生物學特性

2.5.1最適培養基的篩選。由圖5可知，病原菌在5種培養基上均可生長，其中在CMD培養基上生長較快，前4d生長緩慢，之后呈直線生長；PDA培養基次之；在CMD培養基上菌絲蓬松且稀釋，PDA培養基上菌絲致密且發達。從日生長變化及菌絲總生長變化來看，病原菌在WA培養基上生長均較為緩慢，原因可能與WA培養基沒有營養有關。由圖6可見，ByF12在CMD培養基上菌落日均生長量顯著高于PDA、PSA、MEA、WA培養基（Plt;0.05），PDA、PSA、MEA這3種培養基之間差異不顯著（Pgt;0.05）。鑒于ByF12在PDA培養基上菌絲致密，形態較好，ByF12最適培養基為PDA培養基。

2.5.2不同溫度對病原菌菌絲生長的影響。由圖7可知，病原菌在15、20、25、30℃溫度下均可生長，其中在20、25℃生長較快，兩者相比差別不大，30℃時生長最慢；在不同溫度下的前2d生長速度幾乎重疊，6d之后逐漸分開。由圖8可知，ByF12菌絲日均生長在30℃時最低，隨著溫度的升高，菌絲日均生長量先增加后降低，20℃與25℃之間差異不顯著（Pgt;0.05），但兩者與15℃和30℃之間差異顯著（Plt;0.05）。綜上所述，ByF12的最適培養溫度是20℃或25℃。

2.5.3初始pH對病原菌菌絲生長的影響。由圖9可知，ByF12在pH4～pH14（11個濃度）上均可生長。在接種2d后，病原菌生長速度均明顯提高。ByF12在pH5和pH11時出現高峰，菌落顏色從pH9時開始變為白色且疏松。由圖10可知，ByF12在pH5時生長量較高，后逐步下降，pH9時再次升高為菌落生長的第2次轉折點。綜上所述，ByF12喜歡偏酸的環境，pH5時長勢較好。

2.5.4不同碳氮源對病原菌菌絲生長的影響。由圖11可知，病原菌ByF12在所有供試的培養基上均可生長，但碳源和氮源在利用方面有一定的差異。ByF12對碳源乳糖利用較好，10d時長滿平板；對氮源氯化銨和蛋白胨利用較差，遠低于CK。由圖12可知，ByF12在碳源乳糖上菌絲日均生長最快，顯著高于其他碳源培養基（Plt;0.05），其余4組處理間差異不顯著（Pgt;0.05）。ByF12對碳源的利用優于氮源，其最適碳源是乳糖，最適氮源是硝酸鉀。由此可見，病原菌對硝酸鉀的利用有一定的偏好。

3結論與討論

根腐病是紅大戟的主要病害，發病時根部表皮先變黑最后全根腐爛^［14］，其病因復雜多變，嚴重影響了紅大戟的產量和品質；已有報道指出引起紅大戟根腐病的病原菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和亞紅青霉（Penicillium subrubescens）^［15-16］。該研究表明紅大戟根腐病的致病菌為大豆莖點霉（B.exigua）。

B.exigua為多主寄生真菌，無寄主專化現象^［17］。B.exigua一般引起植物葉斑病^［18-19］，但也可導致植物根腐病^［20-21］。菌株ByF12可造成紅大戟根部的維管束壞死，進而引發根腐病的發生，這與B.exigua引起的根部危害癥狀尤為相似。莖點霉屬（Boeremia）侵染紅芽大戟屬植物目前還鮮見報道，該研究為B.exigua引起紅大戟根腐病的首次報道。

除此之外，該研究對該菌株進行了系統的生物學特性研究。病原菌在5種常用的培養基中均可生長，生長的培養基范圍較廣，即使在沒有任何營養物質的WA培養基上均可生長，具有較強的適應能力。莖點霉屬（Boeremia）的寄主范圍較廣，王夢奇^［22］采集了東北地區的莖點霉真菌，發現25 ℃、pH為7的PDA培養基上菌落生長直徑最大，這一研究結果與該研究類似。由此看來，紅大戟根腐病原菌喜歡偏中性的環境，因此在進行人工種植的過程中，也應持續關注田地土壤的酸堿平衡，并通過調整土壤pH來實現預防和控制根腐病的目標。云南祥云在歷史上的全年平均溫度是11～23 ℃，從2020年記錄以來，其最低氣溫為0 ℃，最高氣溫達到了34 ℃，該溫區內，病原菌ByF12均能存活，特別是6—8月份，隨著氣溫的升高和降雨量的增多，為這些病原菌提供了一個適宜的生長環境。

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