超高效液相色譜-串聯質譜法測定新鮮水果中10種食品添加劑

摘要［目的］建立超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定楊梅、桑葚等新鮮水果中多種添加劑的方法。［方法］樣品前處理采用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）作為提取試劑，經振蕩及超聲提取后，用純水稀釋及定容，經0.22μm濾膜過濾后，用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法在多反應監測模式（MRM）下分析檢測，采用WatersAtlantisT3C18色譜柱（2.1mm×150mm，5μm）作為分析柱，梯度洗脫，外標法定量。［結果］10種添加劑在質量濃度為10.59～3260.67ng/mL線性關系良好（R2≥0.9938），方法檢出限為0.02～1.50mg/kg，定量限為0.25～4.00mg/kg；分別向桑葚和楊梅樣品中添加濃度為2倍、5倍、10倍定量限濃度的10種添加劑標準品，其平均加標回收率為85.21%～108.92%，RSD為0.74%～9.63%。［結論］建立的方法具有前處理簡便、靈敏度高、準確性好、重復性強等優勢，能應用于楊梅、桑葚等水果中添加劑的分析檢測。

關鍵詞食品添加劑；新鮮水果；超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法

中圖分類號TS255.7"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2025）02-0201-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.040

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determinationof10FoodAdditivesinFreshFruitsbyUltraHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

ZHAOChao-qun，TAORui，ZHAOJing-kaietal

（ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl/KeyLaboratoryofStateMarketRegulation（QualityandSafetyofFunctionalFoods）/KeyLaboratoryofZhejiangMarketingBureau（KeyLaboratoryofHealthFoodQualityandSafety），Hangzhou，Zhejiang310052）

Abstract［Objective］Toestablishamethodforthedeterminationofvariousadditivesinfruitssuchaswaxberryandmulberryusingultra-highperformanceliquidchromatographytriplequadrupoletandemmassspectrometry.［Method］Thepre-treatmentofthesamplewascarriedoutusingacetonitrilemethanolwatersolution（V∶V∶V，1∶1∶1）astheextractionreagent.Aftershakingandultrasonicextraction，thesamplewasdilutedandmadetovolumewithpurewater.Using0.22μmfiltermembranefiltersthesamples.Ultra-highperformanceliquidchromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometrywasusedforanalysisanddetectionundermulti-reactionmonitoring（MRM）.TheseparationandanalysiswereperformedonaWatersAtlantisT3C18（2.1mm×150mm，5μm），quantitativewithexternalstandardmethod.［Result］Withintherangeof10.59-3260.67ng/mL，thelinearrelationshipof10additiveswasgood（R2≥0.9938），thedetectionlimitofthemethodwas0.02-1.50mg/kg，andthequantitativelimitwas0.25-4.00mg/kg.Theaveragerecoveryratesof10additiveswere85.21%-108.92%between5and10timestheLOQconcentration，andtheRSDwas0.74%-9.63%.［Conclusion］Theestablishedmethodhastheadvantagesofsimplepretreatment，highsensitivity，goodaccuracyandstrongrepeatability，andcanbeappliedtotheanalysisanddetectionofadditivesinfruitssuchaswaxberryandmulberry.

KeywordsFoodadditives;Freshfruits;Ultra-highperformanceliquidchromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometry

近年來，為了提升新鮮水果的甜度，同時延長其保質期，市面上一些果農及商家會在水果表面噴灑甜味劑和防腐劑，特別是漿果類水果。食品添加劑在改善食品感官品質、保持營養價值、延長食品貨架期、滿足加工工藝需求等方面起著非常重要的作用，防腐劑和甜味劑是常用的2類添加劑^［1］。但食品添加劑的安全使用非常重要，特別是化學合成的食品添加劑大都有一定的毒性，要嚴格控制使用量^［2-3］。我國對在食品中添加甜味劑和防腐劑有嚴格的限制，常用的甜味劑包括安賽蜜、紐甜、甜菊糖苷、甜蜜素、三氯蔗糖、糖精鈉等，常用的防腐劑包括苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸、納他霉素等，《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）^［4］中均有收載，并對其允許使用的食品類型和使用限量作出了明確規定：不得在未處理的新鮮水果中直接使用。目前國標方法包括《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）^［5］、《食品安全國家標準 食品中納他霉素的測定》（GB 5009.286—2022）^［6］、《食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》（GB 5009.298—2023）^［7］、《食品安全國家標準 食品中乙酰磺胺酸鉀的測定》（GB 5009.140—2023）^［8］等，但未有適用的方法可同時檢測新鮮水果中多種防腐劑和甜味劑。

目前文獻報道的針對添加劑的檢測方法主要包括高效液相色譜法^［9-11］，但液相方法的前處理過程、液相色譜檢測條件均不相同，其中三氯蔗糖如果用液相法測定則須用蒸發光散射檢測器或者示差折光檢測器，其余添加劑則使用紫外檢測器在不同波長下測定，因此無法將不同種類的添加劑同時測定。氣相色譜法^［12-13］ 和氣相色譜-質譜聯用法^［14-15］測定添加劑則需要進行衍生化反應。近年來，液相色譜-質譜聯用法^［16-19］因儀器穩定性好、靈敏度高、通用性強，逐漸成為主流檢測儀器。該研究針對幾種不同水果基質，以10種水果中使用可能性較高的食品添加劑為目標化合物，采用優化的前處理方法結合超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法，建立能高通量快速測定楊梅、桑葚等水果中多種添加劑的通用分析方法，并利用該方法分析市場上流通的水果。

1材料與方法

1.1試驗材料

TripleQuad5500三重四極桿/線性離子阱串聯質譜，美國ABSciex公司；LC-30AD超高效液相色譜，日本Shimadiu公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；XPE-205電子天平，瑞士Mettlertoledo公司；KS4000ic低溫搖床，德國IKA公司；MultifugeXIR高速離心機，美國Thermo公司；KH-500DV型超聲波清洗器，民山禾創公司。

甲醇、乙腈，色譜純，德國默克公司；甲酸，質譜純，美國RoeScientificing公司；乙酸銨，質譜純，德國CNW公司。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液均購自中國計量科學研究院，濃度均為1.0mg/mL；脫氫乙酸標準品購自ChemService，純度為99.5%；納他霉素標準品購自Dr.EhrenstorferGmbH，純度為90.41%；甜蜜素標準品購自Dr.EhrenstorferGmbH，純度為99.0%；安賽蜜標準品購自Dr.EhrenstorferGmbH，純度為99.69%；三氯蔗糖標準品購自中國食品藥品檢定研究院，純度為99.9%；紐甜標準品購自Sigmaaldrich，純度為99.4%；甜菊糖苷標準品購自中國食品藥品檢定研究院，純度為100%。

1.2試驗方法

1.2.1標準溶液的配制。

1.2.1.1標準儲備液。購買的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液可直接作為相應的標準儲備液。分別稱取甜蜜素、安賽蜜、三氯蔗糖、脫氫乙酸標準品約10mg置于10mL容量瓶中，加入水超聲溶解，并定容至刻度，配制成濃度為1.0mg/mL的標準儲備液，于4℃下避光保存。分別稱取納他霉素、紐甜、甜菊糖苷標準品約10mg置于10mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1.0mg/mL的標準儲備液，于-18℃下避光保存。

1.2.1.2

混合標準溶液。準確吸取安賽蜜、紐甜、甜菊糖苷標準儲備液各0.1mL，甜蜜素標準儲備液0.2mL，脫氫乙酸、納他霉素標準儲備液各0.8mL，糖精鈉、三氯蔗糖、苯甲酸、山梨酸標準儲備液各1.6mL于10mL容量瓶中，用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）定容至刻度，配制成混合標準溶液，于4℃以下避光保存，有效期90d。

1.2.1.3混合標準系列工作溶液。分別準確吸取上述混合標準溶液0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.15和0.20mL，用相應類別的空白樣品基質液定容至10.0mL，配制成安賽蜜、紐甜、甜菊糖苷質量濃度分別約為10、20、50、80、100、150和200ng/mL，甜蜜素質量濃度分別約為20、40、100、160、200、300和400ng/mL，脫氫乙酸、納他霉素質量濃度分別約為80、160、400、640、800、1200和1600ng/mL，糖精鈉、三氯蔗糖、苯甲酸、山梨酸質量濃度分別約為160、320、800、1280、1600、2400和3200ng/mL的混合標準系列工作溶液。臨用現配。

1.2.2樣品處理。用均質器將樣品充分打碎混勻，放入分裝容器中。稱取2.0g處理好的試樣，置于50mL離心管中，加入30mL乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1），高速振蕩提取10min，超聲10min，5000r/min離心10min，收集上清液至50mL容量瓶中，加入10mL乙腈-甲醇-水溶液重復提取一次，合并上清液至50mL容量瓶，用水定容至刻度，如有需要，則用水稀釋合適倍數。過0.22μm濾膜過濾后上機分析。

1.2.3色譜條件。WatersAcquityUPLCHSST3C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；流動相A為5mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）。流速0.3mL/min；柱溫35℃；進樣量2μL。梯度洗脫程序見表1。

1.2.4質譜條件。

電離方式為電噴霧電離（ESI-）；檢測方式為多反應監測MRM；噴霧電壓（IS）4500V；離子源溫度（TEM）350℃。優化后的母離子、子離子和碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞室射出電壓（CXP）等質譜參數見表2。

2結果與分析

2.1儀器條件的優化

2.1.1質譜條件的優化。使用針泵進樣，分別在正負離子模式下進行Q1掃描，所有化合物在負離子模式下響應較好，因此使用負離子模式確定準分子離子峰，使用產物離子模式掃描，選擇響應最強的2個子離子分別作為定量離子和定性離子，并在MRM模式下優化各質譜參數。去簇電壓（DP）主要是影響離子進入質譜的速度，可消除溶劑離子簇，DP越大，離子速度快，離子損失小，去簇效果越好，檢測靈敏度高，反之則相反。因此理論上DP越高越好，但過高的DP會增加離子間的碰撞，引起較強的源內裂解。試驗過程中發現安賽蜜、脫氫乙酸、苯甲酸、山梨酸等對DP非常敏感，當DP過大時，幾乎監測不到母離子，通過針泵進樣，優化DP，優化后的參數見表2。

2.1.2色譜條件的優化。目標化合物在C18色譜柱上均可保留，WatersAcquityUPLCHSST3C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）相對于其他C18色譜柱對各目標化合物有更好的保留，且無雜峰干擾，分離效果較好，因此選用WatersAcquityUPLCHSST3C18色譜柱作為分析柱。在優化的質譜條件下，比較了乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液、乙腈、甲醇作為有機相的洗脫效果，結果表明乙腈的洗脫能力最強，較甲醇出峰較快，導致多個目標峰重疊，用甲醇作為有機相時，峰形明顯不如乙腈作為有機相時尖銳對稱，使用乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液作為有機相可綜合甲醇和乙腈的優點，各目標化合物峰形對稱且分離效果相對較好。在負離子掃描模式下流動相中加入少量乙酸銨可促進各目標化合物的解離，使響應變好，因此選擇5mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液作為流動相系統。10種添加劑的典型圖譜見圖1。

2.2樣品前處理優化

2.2.1提取溶劑的選擇。10種食品添加劑包括防腐劑和甜味劑，種類不同，性質差異較大，在不同溶液中的溶解性也存在差異性。該試驗中嘗試采用直接提取的方式將不同性質的添加劑提取出來，提取溶劑的選擇較為重要。為了更好地提取樣品中10種食品添加劑，根據其溶解性對提取溶劑進行了考察。對比了乙腈、甲醇、水和乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）對10種添加劑的提取效果。其中納他霉素、紐甜和甜菊糖苷易溶于甲醇等有機試劑，難溶于水。安賽蜜隨有機相比例增加提取效率有所降低，使用純有機相和乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）提取時，安賽蜜在色譜上的峰會出現分裂的現象，但用水稀釋后可重新使色譜峰尖銳對稱。苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖用純水即可完全提取。綜合考慮，最后采用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）作為提取試劑，并用純水定容及稀釋。

2.2.2提取時間的優化。水果樣品基質中含水量較高，含有的蛋白質脂肪等雜質較少，采用直接提取后進樣的方式對色譜柱及質譜檢測器的損害較小。該試驗中采用振蕩提取和超聲的方式從樣品中提取目標化合物。在陽性樣品測定過程中發現，提取時間和方式對苯甲酸、山梨酸的提取效果影響較為明顯，對其他化合物影響不明顯。分別采用振蕩20min、超聲20min、振蕩10min后超聲10min進行提取，結果發現振蕩10min后超聲10min進行提取測得的含量最高，再延長提取時間對結果影響不大，因此選擇振蕩10min后超聲10min進行提取。

2.3線性關系和方法檢出限

根據檢測情況發現桑葚和楊梅是2類添加劑檢出率較高的水果，因此選擇桑葚和楊梅作為目標樣品。在樣品加標試驗過程中發現存在一定的基質效應，因此采用樣品空白基質液配制標準曲線溶液，以抵消基質效應。分別考察其樣品空白基質液中目標化合物的線性關系及方法靈敏度。以相應樣品的空白基質液配制系列濃度混合標準溶液，以待測物質的峰面積為縱坐標（Y）、相應目標化合物的質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線。各目標化合物的線性范圍、線性方程及相關系數（R2）詳見表3。根據3倍信噪比（S/N）及10倍信噪比（S/N）分別確定各目標物的方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果表明，10種添加劑在質量濃度為10.59～3260.67ng/mL線性關系良好（R2≥0.9938），方法檢出限為0.02～1.50mg/kg，定量限為0.25～4.00mg/kg。

2.4精密度和回收試驗

分別選擇桑葚和楊梅樣品進行加標試驗，加標濃度為2倍（低水平）、5倍（中水平）、10倍（高水平）定量限濃度，每個濃度設定6份平行樣，分別考察回收率和相對標準偏差（RSD），結果表明（表4～5），2種基質中各目標化合物的平均回收率為85.21%～108.92%，RSD為0.74%～9.63%。混標工作液重復進樣6次，計算儀器精密度，RSD為0.96%～4.53%。這表明該方法具有較好的準確性和精密度。

2.5實際樣品測定

利用建立的方法檢測市場上購買的24批次桑葚，結果發現（表6），7批次檢出脫氫乙酸，5批次檢出糖精鈉，3批次檢出甜蜜素，2批次檢出紐甜，1批次檢出三氯蔗糖，檢出問題樣品7批次，問題發現率29.2%。檢測20批次楊梅，結果發現（表7），1批次檢出糖精鈉，2批次檢出甜蜜素，4批次檢出脫氫乙酸，檢出問題樣品5批次，問題發現率25.0%。

3結論

該試驗利用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）振蕩和超聲提取，并用純水稀釋定容，結合超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法建立了同時測定桑葚、楊梅水果中10種添加劑的方法，對提取方法、儀器條件進行了優化，確定了一種樣品前處理方法，解決了其他類型儀器難以同時測定多種不同類型添加劑的問題。經方法學驗證，該方法的線性、回收率、重復性、定量限、檢出限等均滿足多種添加劑檢測技術的要求。該方法簡單、快速、可高通量同時檢測10種常用的食品添加劑，大大節省檢測時間，適合大批量樣品的快速篩查；檢測成本低，整個過程對環境污染也較小。建立的方法能廣泛應用于桑葚、楊梅等新鮮水果中添加劑的分析檢測，后續可繼續應用于檢測草莓、藍莓等不易保存的水果中防腐劑及添加劑的情況。

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