潮州市售米粉轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)與分析

摘要為進(jìn)一步了解潮州市售米粉轉(zhuǎn)基因成分的情況，隨機(jī)購(gòu)買潮州城區(qū)主要市場(chǎng)售賣的米粉進(jìn)行檢測(cè)與分析。通過十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取所購(gòu)買的米粉樣品的DNA成分，采用常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)對(duì)外源基因CaMV35S、tNOS進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，有接近50%的檢測(cè)米粉樣品含有轉(zhuǎn)基因成分，且均沒有任何轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)。因此，為了促進(jìn)米粉等大米制品的生產(chǎn)和銷售的規(guī)范化，必須高度重視轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)制度的落實(shí)，建立起有效的轉(zhuǎn)基因大米制品的監(jiān)管體系。

關(guān)鍵詞米粉；轉(zhuǎn)基因成分；外源基因；內(nèi)源基因

中圖分類號(hào)TS212.7"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A"文章編號(hào)0517-6611（2025）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.041

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

DetectionandAnalysisofGeneticallyModifiedIngredientsinRiceNoodlesinChaozhouCity

WANGMao-xian，SHENLin-xin，F(xiàn)URuo-sietal

（SchoolofLifeScienceandFoodEngineering，HanshanNormalUniversity，Chaozhou，Guangdong521041）

AbstractTofurtherunderstandthepresenceofgeneticallymodifiedingredientsinricenoodlesinChaozhouCity，werandomlypurchasedricenoodlesinmajormarketsinChaozhoufortestingandanalysis.TheDNAcomponentsofthericefloursampleswereextractedbythecetyltrimethylammoniumbromide（CTAB）method，andtheexogenousgenesCaMV35SandtNOSweredetectedbyconventionalpolymerasechainreaction（PCR）andreal-timefluorescencePCR.Theresultsshowedthatnearly50%ofthedetectedricenoodlessamplescontainedgeneticallymodifiedingredients，andnoneofthemhadanygeneticallymodifiedfoodlabel.Therefore，inordertopromotethestandardizationoftheproductionandsaleofriceproducts，suchasricenoodles，itisnecessarytoattachgreatimportancetotheimplementationofalabelingsystemforgeneticallymodified（GM）foodproductsandestablishaneffectivesupervisionsystemforGMriceproducts.

KeywordsRicenoodle;Geneticallymodifiedingredient;Exogenousgenes;Endogenousgenes

隨著科學(xué)技術(shù)尤其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷地發(fā)展，1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植規(guī)模迅速擴(kuò)大。轉(zhuǎn)基因食品也在不斷地出現(xiàn)并深入到公眾日常生活的方方面面^［1］。由于轉(zhuǎn)基因食品還沒有在科學(xué)界和公眾之間達(dá)成統(tǒng)一的共識(shí)，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題已經(jīng)成為公眾持續(xù)關(guān)注的焦點(diǎn)。米粉，這里是指以大米為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、壓條等工序制成條狀、絲狀的米制品，而不是詞義上理解的以大米為原料研磨制成的粉狀物料。米粉是我國(guó)的傳統(tǒng)食品，結(jié)構(gòu)柔韌，富有彈性，水煮不糊湯，干炒不易斷，配以各種菜碼或湯料進(jìn)行湯煮或干炒，爽滑入味，深受廣大消費(fèi)者的喜愛^［2］。對(duì)于其食用方法，有研究發(fā)現(xiàn)濕米粉品質(zhì)受大米淀粉凝膠效果的影響^［3］，其中，不僅涉及糊化程度，更關(guān)乎老化效果。

近年來，由于米粉的利潤(rùn)具有很大優(yōu)勢(shì)，大量流入我國(guó)市場(chǎng)，又因?yàn)槠浞N類繁多，人們幾乎可以隨意給米粉命名，導(dǎo)致其類別混亂^［4］。米粉主要的銷售對(duì)象為個(gè)人或者餐飲企業(yè)，為了進(jìn)一步降低成本，或在原料方面把關(guān)不合格，部分售賣者購(gòu)買轉(zhuǎn)基因米粉進(jìn)行售賣，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大量流入市場(chǎng)^［5］。深圳海關(guān)在監(jiān)管過程中發(fā)現(xiàn)，出口大米成品中檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因成分，說明我國(guó)某些地區(qū)在非法銷售未經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因水稻種子并有水稻的種植行為，部分轉(zhuǎn)基因水稻及其大米已經(jīng)流入市場(chǎng)^［6］。在各種品牌米粉中不斷地被檢測(cè)出含有未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分，人們不禁對(duì)自己日常生活中所吃米粉的食品安全問題感到擔(dān)憂。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，常需要檢測(cè)CaMV35S和tNOS基因。在檢測(cè)大米制品的轉(zhuǎn)基因成分時(shí)，除了檢測(cè)外源基因，還需要檢測(cè)內(nèi)源基因SPS的存在情況，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。此外，轉(zhuǎn)基因大米制品的檢測(cè)需要先進(jìn)行高質(zhì)量DNA提取，對(duì)后續(xù)研究至關(guān)重要。提取方法的靈敏度和特異性也會(huì)直接影響后續(xù)試驗(yàn)的成功^［7-8］。由于大米及大米加工品中存在的大量淀粉、蛋白及其他形式的多糖，有可能對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用^［9］。為了解潮州市售米粉的轉(zhuǎn)基因情況，該研究對(duì)潮州市售米粉進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取米粉基因組DNA，并利用常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)米粉樣品中的內(nèi)源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進(jìn)行雙重檢測(cè)，為相關(guān)的研究機(jī)構(gòu)提供一定科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品。

此次試驗(yàn)所采集的樣品來自潮州城區(qū)的楓春市場(chǎng)、南門市場(chǎng)、北門市場(chǎng)、西門市場(chǎng)、民福市場(chǎng)、上東平市場(chǎng)、臥石社光美食城、臥石綜合市場(chǎng)、西新市場(chǎng)共9個(gè)主要市場(chǎng)市售的米粉。米粉待檢樣品來源情況如表1所示。

1.1.2試劑和試劑盒。

Dzup柱式深加工產(chǎn)品基因組DNA抽提試劑盒，SGExcelFastSYBRqPCR預(yù)混液，TaqPCRMix預(yù)混液（2×，含DNA染料），核糖核酸酶A溶液，ProteinaseK，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（25～500bp、100～10000bp），50×TAE緩沖液，4SGreen核酸染色劑，3對(duì)上下游引物（SPSr/f、CaMV35Sr/f、tNOSr/f），瓊脂糖，以上均購(gòu)自生工生物（上海）工程股份有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備。實(shí)時(shí)熒光PCR儀器LightCycler96（瑞士Hoffmann-LaRoche有限責(zé)任公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RadLaboratories，Inc.）；水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；B-500型超微量紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（濟(jì)南福的機(jī)械有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；常溫冰箱（青島Haier公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1米粉基因組DNA提取。

1.2.1.1

樣品預(yù)處理。采用濕的、細(xì)的米粉，對(duì)于干的米粉可采用試驗(yàn)前冷水浸泡30～60min，浸泡的水同樣也倒進(jìn)離心管中進(jìn)行提取。取足量的米粉切碎并稱取200mg的食品粉末至2mL離心管中，每次切完一個(gè)樣品后，需對(duì)刀片進(jìn)行清洗并用干凈的紙巾擦干。

1.2.1.2

樣品基因組DNA抽提。采用Dzup柱式深加工產(chǎn)品基因組DNA抽提試劑盒，具體步驟詳見試劑盒說明書。抽提所得到的DNA溶液置于-20℃保存或者直接用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2米粉基因組DNA純度和濃度的測(cè)定。

用核酸蛋白分析儀測(cè)量OD值，在波長(zhǎng)為260和280nm處對(duì)DNA樣品的吸光度進(jìn)行測(cè)量。純度高的DNA樣品OD260nm/280nm在1.8左右，當(dāng)OD260nm/280nm大于1.8時(shí)，說明樣品中還有部分RNA殘留；若OD260nm/280nm小于1.7，則表明樣品中受到酚或蛋白質(zhì)的污染。倘若OD260nm/280nm為1.8～2.0，DNA質(zhì)量濃度達(dá)到5～80ng/μL，則基本能夠進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測(cè)。為了后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行，通過基因組DNA凝膠電泳，檢測(cè)所提取的基因組DNA的質(zhì)量是否可用于后續(xù)的PCR檢測(cè)。

1.2.3常規(guī)PCR檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳分析。

將已提取到的米粉基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。分別對(duì)內(nèi)源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進(jìn)行擴(kuò)增。常規(guī)PCR擴(kuò)增體系（25μL）：上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、基因組10.5μL、TaqPCRMix預(yù)混液12.5μL。引物序列和反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如表2所示。

瓊脂糖凝膠電泳分析：完成PCR擴(kuò)增后，使用1×TAE電泳緩沖液和瓊脂糖制備3%的瓊脂糖凝膠（等凝膠融化后冷卻到約60℃左右時(shí)，加入4SGreen核酸染色劑）。將10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別加入對(duì)應(yīng)的凝膠孔中，再同時(shí)于凝膠孔中加入2.5μLDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（25～500bp），凝膠電泳的電壓為90V，時(shí)間為45min。用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析并記錄結(jié)果。其中SPS目的基因片段為104bp，CaMV35S目的基因片段為82bp，tNOS目的基因片段為165bp。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

將提取到的米粉基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。首先分別對(duì)內(nèi)源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系（20μL）：基因組6μL、上游引物1μL、下游引物1μL、SGExcelFastSYBRqPCR預(yù)混液10μL，最后再用ddH2O根據(jù)DNA模板量變化補(bǔ)至20μL。空白對(duì)照以超純水代替模板DNA。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以實(shí)測(cè)有效數(shù)值來表示，且均采用相關(guān)分析儀器進(jìn)行記錄處理，對(duì)不同樣本的實(shí)測(cè)有效數(shù)值進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1米粉基因組DNA的OD260nm/280nm及其濃度的測(cè)定

此次試驗(yàn)的檢測(cè)樣品來自市場(chǎng)及其周邊的店鋪，由于米粉有粗有細(xì)，有干有濕，以及米粉屬于加工產(chǎn)品，在制作過程中（研磨、蒸煮等方式）對(duì)于樣品的處理可能已經(jīng)使得部分基因斷裂。前期試驗(yàn)中對(duì)于提取米粉中DNA的方法多次進(jìn)行嘗試探索，例如，將米粉樣品于65℃水浴加熱10min后用研缽研磨，然而得出的核酸濃度為負(fù)值；提前一晚浸泡米粉，浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，抽提的核酸濃度也較低。

經(jīng)過不斷改良摸索得出以下的操作注意事項(xiàng)：首先，在試驗(yàn)前處理樣品要盡量用刀切碎，而不用加熱、研磨等方法處理，防止基因進(jìn)一步斷裂；其次，使用較為濕潤(rùn)的米粉樣品進(jìn)行提取且米粉樣品要切得盡量碎，而且試驗(yàn)結(jié)果也表明細(xì)的米粉提取出來的DNA濃度較高。而干米粉以及較粗的米粉基因組DNA可能在加工過程中耗損較大，因此在提取過程可以適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間，由原本的0.5h延長(zhǎng)至1.0h左右較為適宜。同時(shí)，在整個(gè)過程中一定要嚴(yán)格遵循試驗(yàn)方法中提高DNA得率的措施。

由表3可知，樣品中基因組DNA均已成功提取，OD260nm/280nm為1.7～2.0，說明樣品中還有RNA沒有除盡，依舊有RNA殘留，但影響較小可忽略不計(jì)，且DNA質(zhì)量濃度為5～80ng/μL，基本能夠進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測(cè)。

2.2米粉樣品中提取的基因組DNA電泳結(jié)果

將提取到的米粉基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，均可看到條帶出現(xiàn)，而MF14～MF17米粉中提取的DNA條帶不明顯，亮度很弱，可能因?yàn)楹怂釢舛炔桓撸砻鳂悠返腄NA存在降解，這也說明了商家制作米粉的方法可能會(huì)造成米粉部分DNA斷裂。

2.3常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果分析

共檢測(cè)潮州市售米粉17份，經(jīng)常規(guī)PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。為了得到更加明顯的電泳結(jié)果圖，多次嘗試不同電泳時(shí)間與不同電壓的結(jié)合，最終獲得較為適宜的電泳條件。PCR擴(kuò)增完成后，采用90V的電壓對(duì)其進(jìn)行45min電泳，便能得到較為清晰的條帶，所得米粉外源基因常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。常規(guī)PCR檢測(cè)是常見的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法，通過觀察凝膠成像分析系統(tǒng)，判斷是否存在特異性條帶，從而判斷樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因成分。

根據(jù)常規(guī)PCR結(jié)果（圖2）可知，所有的米粉樣品均可擴(kuò)增出SPS基因104bp的片段，其擴(kuò)增條帶清晰明亮。在17份米粉樣品中，檢測(cè)出外源基因CaMV35S的米粉樣品數(shù)量為7份，檢測(cè)出外源基因tNOS的米粉樣品數(shù)量為0份，因此此次所檢測(cè)的米粉樣品轉(zhuǎn)基因比例為41.20％。

2.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果分析

共檢測(cè)潮州市售米粉17份，通過實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。米粉外源基因的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果如圖3所示，此方法可以較好地克服基因組由于食品加工導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破碎、成分含量低，造成假陰性結(jié)果，進(jìn)而使得試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。試驗(yàn)體系嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)^［10］執(zhí)行，設(shè)置陰性對(duì)照，用于判斷系統(tǒng)是否存在著污染。

在陰性對(duì)照組沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象的前提下，通過用外源基因CaMV35S和tNOS的上下游引物來擴(kuò)增全部樣品，進(jìn)而檢測(cè)與分析。所檢測(cè)的17份樣品中，其中有5份樣品檢測(cè)到含有外源基因CaMV35S，5份樣品檢測(cè)到含有外源基因tNOS，綜合分析可知，所檢測(cè)的17份樣品中共有8份樣品含有轉(zhuǎn)基因成分，即此次隨機(jī)檢測(cè)的米粉的轉(zhuǎn)基因成分比率為47.06%，這與常規(guī)PCR所檢測(cè)出的樣品轉(zhuǎn)基因成分比率（41.20%）以及所檢測(cè)出來的陽(yáng)性樣品有一定的出入。成曉維等^［6］研究表明，在抽檢出口樣品中檢出含轉(zhuǎn)基因成分的有9份，陽(yáng)性率為5%，其中，含大米轉(zhuǎn)基因成分的樣品有6份，占總陽(yáng)性樣品的67%。楊冬燕等^［11］研究發(fā)現(xiàn)，2011—2015年深圳市場(chǎng)的大米及大米制品所檢測(cè)出來的轉(zhuǎn)基因比率為0.74%，說明確實(shí)存在轉(zhuǎn)基因大米違規(guī)進(jìn)入大米制品生產(chǎn)與加工等環(huán)節(jié)的現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象正在呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

3結(jié)論與討論

此次試驗(yàn)對(duì)17份潮州市售米粉樣品進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，樣品米粉中轉(zhuǎn)基因成分陽(yáng)性比率大于40％，可見轉(zhuǎn)基因米粉占比偏高。此次試驗(yàn)樣品均選自潮州市具有代表性的大型市場(chǎng)，但所有米粉均無是否含轉(zhuǎn)基因成分的食品標(biāo)識(shí)。我國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全法規(guī)非常重視，已經(jīng)初步建立了以行政法規(guī)和部門規(guī)章為主的較為嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因食品管制制度^［12］。我國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，轉(zhuǎn)基因水稻相比傳統(tǒng)水稻而言，產(chǎn)量高、價(jià)格低，導(dǎo)致一些地方違規(guī)種植轉(zhuǎn)基因水稻，在市場(chǎng)上存在轉(zhuǎn)基因稻米^［6］。由于人們普遍對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性持有懷疑態(tài)度，很多人拒絕使用轉(zhuǎn)基因食品就是理所當(dāng)然的。在利益的驅(qū)動(dòng)下，有些米粉制造商無視國(guó)家禁止轉(zhuǎn)基因稻米生產(chǎn)和流通等規(guī)定，違規(guī)采用轉(zhuǎn)基因大米作為米粉生產(chǎn)原料，也沒有轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)，這也嚴(yán)重侵犯消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。

隨著人民群眾生活水平和食品安全意識(shí)的提高，轉(zhuǎn)基因水稻及其制品的食品安全問題愈發(fā)引起人們重視。如何尊重消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的知情權(quán)與選擇權(quán)，這是轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)管工作所要面對(duì)的現(xiàn)實(shí)問題^［13］。國(guó)家應(yīng)加大對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的市場(chǎng)監(jiān)管力度，完善市場(chǎng)監(jiān)管機(jī)制，同時(shí)加大對(duì)廣大消費(fèi)者的教育和培訓(xùn)。此外，由于此次研究采用的試驗(yàn)樣品為米粉，屬于加工食品，在試驗(yàn)過程中也需考慮樣品的基質(zhì)效應(yīng)及食品加工過程中帶來的DNA斷裂、降解等產(chǎn)生的不確定度^［14］。在后續(xù)的研究中，將考慮進(jìn)行基因特異性檢測(cè)，合成引物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中除CaMV35S啟動(dòng)子、tNOS終止子之外，還有可能普遍存在的β-葡萄糖苷酸酶基因GUS、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hpt、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）產(chǎn)生的毒蛋白基因BtCry1Ab等外源基因^［15］。與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，超快速PCR方法是一種使用試劑量少、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法，檢測(cè)時(shí)間短，為常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)間的18%，為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)間的23%^［16］。因此，還可以通過構(gòu)建特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)化體特異性等，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行更為全面和有效的檢測(cè)。同時(shí)，隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化等因素，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)采取快速高效的PCR技術(shù)也是勢(shì)在必行的趨勢(shì)。

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