生物輔助發酵對云產雪茄煙葉中性致香成分及感官質量的影響

摘要" 為考察生物輔助發酵對云產雪茄煙葉中性致香成分及感官品質的影響，采用葡糖淀粉酶（GAL型）等9種外源性生物酶制劑及短小芽胞桿菌等3種微生物進行輔助發酵，以無菌水處理為對照（CK），利用氣相色譜-質譜聯用方法（GC-MS）測定其中性致香成分含量，并進行感官質量評價。結果表明，共測定出28種中性致香物質，其中苯丙氨酸轉化產物4種，非酶棕色化反應產物2種，西柏烷類降解產物1種，類胡蘿卜素降解產物8種，葉綠素降解產物1種，其他類別12種，各類成分化合物的含量差異較大。生物輔助發酵處理有利于苯丙氨酸轉化產物、西柏烷類降解產物和葉綠素降解產物的積累，不利于類胡蘿卜素降解產物的積累。感官評價方面，除氨基肽酶、脂肪酶處理外，其余處理樣品感官質量評分均高于CK，以中性蛋白酶和巨大芽胞桿菌處理的樣品感官質量評分較高，主要表現在雪茄香韻豐富性提升、煙氣質感改善、降刺掩雜和余味改善等方面。利用生物技術輔助云產雪茄煙葉發酵對其化學成分改善及感官品質提升潛力巨大，本研究為云產雪茄煙葉人工干預發酵提供參考。

關鍵詞" 生物輔助發酵；云產雪茄煙葉；中性致香物質；感官質量

中圖分類號" S44+4；Q939.99 """文獻標識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）03-0103-07

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.03.023

Effects of bio-assisted fermentation on neutral odorant components and sensory quality of Yunnan cigar tobacco

ZHOU Xiao1 XU Zhengrong1 YANG Kun2 LIU Yanhong3 WANG Bingbing1 LI Tian1 LIU Yan1 LU Xin1

（1Yuxi Agriculture Vocation-Technical College， Yuxi 653100， China;

2Longjia Agricultural Development Services Co.， Ltd.， Yuxi 653200， China;

3Yunnan Shenhui Biotechnology Co.， Ltd.， Yuxi 653100， China）

Abstract" To study the effects of bio-assisted fermentation on neutral odorant components and sensory quality of Yunnan cigar tobacco ， 9 exogenous bioenzyme preparations including glucoamylase （GAL type） and 3 microorganisms including Bacillus pumilus were used for auxiliary fermentation. Using sterile water treatment as a control （CK）， the content of aromatic compounds was determined by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） and sensory quality evaluation was conducted. The results showed that 28 kinds of neutral aroma compounds were determined， including 4 kinds of phenylalanine conversion products， 2 kinds of non-enzymatic brown reaction products， 1 kind of siberane degradation products， 8 kinds of carotenoid degradation products， 1 kind of chlorophyll degradation products and 12 kinds of other kinds of compounds. Bio-assisted fermentation was beneficial to the accumulation of phenylalanine conversion products， siparane degradation products and chlorophyll degradation products， but not conducive to the accumulation of carotenoid degradation products. In terms of sensory evaluation，except for the treatment with aminopeptidase and lipase， the sensory quality scores of the remaining processed samples were higher than CK， and the sensory quality scores of the samples treated with neutral protease and Bacillus subtilis were higher， mainly in the aspects of enhancing the richness of cigar flavor， improving smoke texture， reducing stinging and staining， and improving aftertaste. The use of biotechnology to assist the fermentation of Yunnan cigar tobacco had great potential to improve its chemical composition and sensory quality. This study provides a reference for artificial intervention in the fermentation of cloud cigar tobacco.

Keywords" bio-assisted fermentation; Yunnan cigar tobacco; neutral odorant components; sensory quality

雪茄煙葉含糖量低、煙堿及總氮含量較高，具有香氣馥郁、勁頭較大等特點[1]。其不經過烘烤過程，但需要進行充分的發酵和醇化，方可滿足雪茄制品的使用要求[2]。發酵前的雪茄煙葉一般色澤不均、香韻單調、協調性差、雜氣重和刺激較大[3]，發酵使得糖類、蛋白質等物質進一步降解產生有機酸、揮發性羰基化合物等香氣前體物質，化學成分更加趨于協調穩定，感官品質得以改善[4-5]。因此，發酵是影響雪茄煙葉質量的主要因素之一。

雪茄煙葉發酵方式主要有自然發酵和人工干預發酵，關于雪茄發酵技術研究較多。張彤彤等[6]研究發現，貝萊斯芽孢桿菌對雪茄茄衣具有增香提質的作用；時向東等[7]研究表明，雪茄外包皮煙堆積發酵14～21 d時主要中性香氣物質含量最高；榮仕賓等[8]以雪茄芯葉為材料，研究溫濕度互作對測定樣品發酵前后常規化學成分等的影響，發現在發酵溫度45～48 ℃、發酵濕度90%、煙葉含水率（30.32±2.16）%條件下，煙葉化學成分協調，香氣成分優良；瞿嬌嬌等[9]研究發現，從豆豉中分離的芽孢桿菌對煙葉品質有明顯的改善作用；陳興等[10]研究發現，從醇化煙葉表面分離篩選到的西姆芽孢桿菌V16菌株可有效改善煙葉內在質量；余玉莎等[11]研究發現，米根霉發酵煙末能增加煙葉部分致香成分。目前，利用生物輔助技術進行云產雪茄煙葉發酵的研究有待進一步深入。本文立足煙葉發酵機制[12-14]，采用9種外源性生物酶制劑和3種微生物進行輔助發酵，利用蒸餾萃取法提取揮發性成分，氣相色譜-質譜聯用方法（GC-MS）測定其中性致香成分含量，并進行感官質量評價，為云產雪茄煙葉人工干預發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙葉為云雪36號，中部二級，產地為云南玉溪元江縣。無水硫酸鈉（分析純，四川西隴科學有限公司），乙酸苯乙酯標準品（≥98%，美國Sigma公司）。葡糖淀粉酶（GAL型）（酶活2.6×105 U/mL）、木聚糖酶（XYS型）（酶活2.8×105 U/g）、纖維素酶（酶活1.1×104 U/mL）、氨基肽酶（酶活5 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活5.0×104 U/g）、多酚氧化酶（酶活6 000 U/mL）、脂肪酶（酶活1.0×105 U/mL）、半纖維素酶（酶活5.0×104 U/mL）和果膠酶（酶活6.0×104 U/mL）均購于夏盛酶生物技術有限公司。短小芽胞桿菌（CICC 9014）、巨大芽胞桿菌（CICC 9013）和惡臭假單胞菌（NBRC 14164）均購于北京保藏生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器與試劑

R-220SE旋轉蒸發儀（瑞士Büchi公司），Milli-Q Element型超純水儀（美國Millipore公司），BSA224S-CW電子天平（德國Sartorius公司），7890A/5975C氣質聯用儀（美國Agilent公司）；二氯甲烷（分析純，四川西隴科學有限公司）；培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（BF）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，滅菌條件121 ℃，1.05 kg/cm2，22 min。

1.3 試驗設計

1.3.1 煙葉預處理 取相同品種、等級和晾制水平的雪茄煙葉，采取半葉法[15]進行預處理，煙葉樣品切絲并平衡水分至13%備用。

1.3.2 酶制劑及微生物處理 稱取各種酶制劑1.0 g，分別使用無菌水溶解并定容至100.0 mL容量瓶中，用無菌小型噴霧器將制備好的酶液均勻噴淋在煙絲樣品上，各處理稱取300 g，噴施量0.1 mL/g；對照用無菌水處理，混勻后裝入自封袋備用。將短小芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌和惡臭假單胞菌分別接種于BF斜面，28 ℃恒溫培養，活化2 d后，在各試管中倒入10 mL無菌水將菌苔洗下，將細胞濃度調至108 CFU/mL。以懸浮液1/100的量接種到300 mL液體培養基中，在30 ℃搖床150 r/min培養2 d，將菌懸液于4 ℃、11 000 r/min離心10 min，保留濕菌體，利用30 mL無菌水將其重懸，得到制備好的菌液，后續與酶液處理煙絲樣品一致。將上述各處理樣品置于40 ℃、相對濕度70%的恒溫恒濕箱中進行人工發酵，發酵時間72 h后，置于90 ℃干燥箱中10 min，使酶和微生物在高溫條件下失活。各處理組分別為對照（CK）、葡糖淀粉酶（GAL型）處理（A1）、木聚糖酶（XYS型）處理（A2）、纖維素酶處理（A3）、氨基肽酶處理（A4）、中性蛋白酶處理（A5）、多酚氧化酶處理（A6）、脂肪酶處理（A7）、半纖維素酶處理（A8）、果膠酶處理（A9）、短小芽胞桿菌（CICC 9014）處理（B1）、巨大芽胞桿菌（CICC 9013）處理（B2）和惡臭假單胞菌（NBRC 14164）處理（B3）。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 GC-MS檢測香氣物質含量變化 精密稱量雪茄煙葉絕干質量15.00 g的煙葉樣品進行提取，以乙酸苯乙酯為內標，內標溶液配制以及蒸餾萃取方法參考文獻[16]。色譜柱，HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度，250 ℃；程序升溫，初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；載氣，氦氣；流速，1.0 mL/min；進樣方式，分流進樣；分流比，10∶1；進樣體積，1 μL；離子源，EI；電離能，70 eV；離子源溫度，230 ℃；傳輸線溫度，260 ℃；檢測模式：全離子掃描監測；質量掃描范圍，33～550 amu；溶劑延遲，3.5 min。根據NIST11譜庫檢索，揮發性化合物取正、反匹配度≥800的鑒定結果，GC-MS相對定量法參考文獻[16]，最終組分含量單位換算為μg/g。

1.4.2 感官質量評價 各處理樣品在相對濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃ 環境下平衡48 h，參考YC/T 138—1998《煙草及煙草制品 感官評價方法》[17]，采用相同煙管卷制，由專業評吸人員進行感官質量評價。

2 結果與分析

2.1 生物輔助發酵煙葉中性致香成分含量變化

參考煙草香氣前體物分類方法[18]，將主要中性致香成分進行分類，具體物質分類見表1。利用9種酶制劑和3種微生物輔助云產雪茄煙葉發酵，共測定出28種中性致香物質，其中苯丙氨酸轉化產物4種，非酶棕色化反應產物2種，西柏烷類降解產物1種，類胡蘿卜素降解產物8種，葉綠素降解產物1種，其他類別12種。除其他類別外，各類型香氣成分中，類胡蘿卜素降解產物含量最高，非酶棕色化反應產物含量最低，單體化合物中巨豆三烯酮（1-4）含量最高。A2煙葉中性致香成分含量最高，為291.88 μg/g，B1最低，為172.76 μg/g，不同處理煙葉的各類成分化合物含量差異較大。

2.1.1 苯丙氨酸轉化產物 由圖1可知，除A1、A2、A3和B1外，其余處理煙葉苯丙氨酸轉化產物含量均高于CK，其中A8較CK增加66.76%，B2較CK增加66.29%。各處理樣品中，苯甲醛含量相對差異較小，其余組分含量差異較大，B2煙葉的苯乙醛含量最高，為28.19 μg/g，B1未檢測到苯乙醇。說明生物輔助發酵有利于苯丙氨酸轉化產物的積累。

2.1.2 非酶棕色化反應產物 A1煙葉的非酶棕色化反應產物含量最高，較CK增加19.94%，A5次之，較CK增加13.49%，其余處理均低于CK；各樣品中均檢測到糠醇，僅在CK、A2、A3、A4、A5、A9和B1樣品中檢測到糠醛，各處理對非酶棕色化反應產物積累存在差異（圖2）。

2.1.3 西柏烷類降解產物 由圖3可知，各處理樣品中均檢測到茄酮，且含量均高于CK，其中B3煙葉的茄酮含量最高，為18.28 μg/g，較CK增加58.27%。整體上看，生物輔助發酵有利于西柏烷類降解產物的積累，以B3茄酮含量最高。

2.1.4 類胡蘿卜素降解產物 由圖4可知，A2的類胡蘿卜素降解產物含量最高，為81.57 μg/g，其余處理樣品均低于CK。其中，A5的突厥烯酮和4-羥基-β-二氫大馬酮含量均最高，分別為6.77和2.85 μg/g；B2的香葉基丙酮含量較高，為1.18 μg/g；A2的大馬士酮含量較高，為8.59 μg/g；B1的4-氧代異佛爾酮含量較高（12.20 μg/g）。整體上看，生物輔助發酵不利于類胡蘿卜素降解產物的積累。

2.1.5 葉綠素降解產物和其他物質 由表1可知，各處理樣品中均檢測到葉綠素降解產物新植二烯，除A5和B1外，其余處理樣品新植二烯含量均高于CK，以A4含量最高，為57.57 μg/g；其他中性致香成分中，各樣品均檢測出的共性中性成分物質為3-（2，6，6-三甲基-1-環己烯基）-2-丙烯醛、（2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-環十四碳三烯-1，13-二醇和正二十七烷，產生的各類揮發性成分將直接或間接影響雪茄的感官質量。

2.2 生物輔助發酵的云產雪茄感官質量評價

由表2可知，9種酶制劑處理樣品中，除A4和A7感官質量評分低于CK外，其余處理樣品評分均高于CK；3種微生物處理樣評分均高于CK，以B2樣品評分較高，為86.5分，與CK相比，主要表現在煙氣質感和香韻豐富性有所提升，雜氣、刺激和余味均有改善，口腔回甜感較好。A3綜合評分略低于A5，但總體品質較CK有較大提升，主要表現在煙氣細膩、香氣豐富且渾厚、刺激性降低及余味改善。與CK相比，A4雪茄樣品有顆粒感、刺激較明顯及舒適感降低；A7煙氣質感和協調性略有下降，枯焦雜氣較明顯。整體上看，除A4和A7外，其余處理樣品分別在香氣、協調、雜氣和刺激性等方面較CK具有一定提升作用。

3 討論

3.1 生物輔助發酵對中性致香成分的影響

本研究表明，大部分生物輔助發酵處理樣品的苯丙氨酸轉化產物高于CK，說明生物輔助發酵有利于苯丙氨酸轉化產物的積累。生物輔助發酵過程中，苯丙氨酸各單體成分可相互轉化，苯丙氨酸通過Streker降解反應形成苯乙醛，進一步氧化形成苯乙醇，經脫氨形成肉桂酸，后形成苯甲醛，苯甲醛可氧化形成苯甲醇[19]。苯乙醛具有強烈的花香、皂香，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香韻，苯甲醇可提供煙葉弱花香，而B2的苯乙醛含量最高，對其香韻豐富性提升具有促進作用；B1未檢測到苯乙醇，可能與其進一步氧化成苯甲醛有關。

非酶棕色化反應產物含量與煙葉感官質量密切相關[20]。A1非酶棕色化反應產物含量較CK明顯提升，可能是葡糖淀粉酶將煙葉淀粉等物質的非還原糖末端α-1-4葡萄糖苷鍵水解，產生葡萄糖；或者緩慢水解α-1-6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖。A5非酶棕色化反應產物含量較CK提升也較明顯，可能是中性蛋白酶將多肽的游離羧基末端或游離氨基末端的肽鏈逐一水解生成氨基酸，增加了反應底物。蘇宇等[21]研究表明，美拉德反應物煙葉還原糖含量與香氣量、透發性、雜氣以及干燥感呈極顯著正相關，脯氨酸含量與煙氣透發性、雜氣和刺激性呈顯著或極顯著正相關?？反伎少x予樣品谷香、油香，具有一定的苦辣氣味，糠醛有杏仁氣味，部分處理樣品未檢測到糠醛，可能與其進一步氧化代謝有關。

茄酮是煙草中西柏烷類降解產物的代表，也是煙草中含量較為豐富的中性香味成分之一，其轉化產物茄醇、茄尼呋喃和降茄二酮均是重要的煙草香味物質。茄酮本身具有香氣，可增加煙草香韻，改善煙氣質感。各處理樣品中茄酮均高于CK，說明生物輔助發酵有利于提升煙葉質量。

類胡蘿卜素是煙草中重要的萜烯類化合物之一，煙草中性致香成分中，大部分化合物為類胡蘿卜素降解產物，煙葉發酵過程中，類胡蘿卜素持續降解。本研究發現，與CK相比，A2類胡蘿卜素降解產物含量提高；A5突厥烯酮和4-羥基-β-二氫大馬酮含量提升明顯，突厥烯酮具有強烈的花香、果香，可提升煙葉的感官質量；B2香葉基丙酮含量較高，有利于提升煙葉香韻豐富性和改善煙草質感。說明生物輔助發酵不利于類胡蘿卜素降解產物的積累，但有利于提升煙葉香韻和感官質量。

新植二烯在各處理樣品單體物質中屬于含量較高的化合物之一，這與時向東等[7]研究結果一致。新植二烯是煙葉中重要的非色素類萜烯，能增進煙葉的香氣和口感，刺激較小，部分生物輔助發酵的新植二烯含量高于CK，說明生物輔助發酵有利于促進新植二烯含量的積累，提升煙葉的口感和香氣。

3.2 生物輔助發酵對云產雪茄感官質量的影響

生物輔助發酵的各處理樣品中，除A4和A7感官質量評分較CK略有下降，其余處理綜合評分均高于CK，以A5和B2感官評分較高，較CK分別提升15.17%和19.31%；A5感官評分較高，可能是中性蛋白酶促進煙葉蛋白質降解及轉化，避免蛋白質含量過高時產生難聞的氣味，以及形成苦、澀、辛辣等不良口感；同時與對煙氣質量具有正向提升作用的苯乙醇、突厥烯酮和4-羥基-β-二氫大馬酮含量較高也有關。B2香韻的優雅感和豐富性提升較明顯，與苯乙醛、大馬士酮和香葉基丙酮等含量較高有關。

4 結論

（1）本試驗利用外源性的9種生物酶制劑及3種微生物輔助云產雪茄煙葉發酵，通過GC-MS分析發現，生物輔助發酵處理有利于苯丙氨酸降解產物、西柏烷類降解產物和葉綠素降解產物的積累，不利于類胡蘿卜素降解產物的積累。各類型香氣成分同煙葉感官質量密切相關，部分成分含量雖較低，卻對其感官質量產生較大影響，可能與感官閾值有關。

（2）除氨基肽酶、脂肪酶處理后的煙葉感官評分略有下降，其余生物酶輔助處理綜合評分均高于CK，說明外源性生物酶制劑和微生物輔助發酵均有利于煙葉感官質量的提升。酶作為特殊蛋白質可直接參與煙葉發酵過程香氣前體物質的降解及轉化，也可起到催化發酵的作用，間接影響煙葉發酵進程；煙葉發酵過程中，微生物生長繁殖將消耗煙葉中的大分子物質，如蛋白質、纖維素及淀粉等，可改善煙草香氣與口感；部分微生物代謝產物本身是香氣物質，或對煙葉化學成分變化起催化作用，間接促進大分子物質的分解、轉化和增香化合物的產生。

本研究分析了外源性生物酶制劑、微生物等生物技術輔助云產雪茄煙葉發酵過程中各類型香氣前體物質及感官質量變化情況，為云產雪茄煙葉人工干預生物輔助發酵及規?；a提供參考。

參考文獻

[1] SMYTH E M，CHATTOPADHYAY S，BABIK K，et al. The bacterial communities of little cigars and cigarillos are dynamic over time and varying storage conditions[J]. Frontiers in microbiology，2019，10：2371.

[2] CHOPYK J，CHATTOPADHYAY S，KULKARNI P，et al. Temporal variations in cigarette tobacco bacterial community composition and tobacco-specific nitrosamine content are influenced by brand and storage conditions[J]. Frontiers in microbiology，2017，8：358.

[3] WANG F，ZHAO H W，XIANG H Y，et al. Species diversity and functional prediction of surface bacterial communities on aging flue-cured tobaccos[J]. Current microbiology，2018，75（10）：1306-1315.

[4] VIGLIOTTA G，DI GIACOMO M，CARATA E，et al. Nitrite metabolism in Debaryomyces hansenii TOB-Y7，a yeast strain involved in tobacco fermentation[J]. Applied microbiology and biotechnology，2007，75（3）：633-645.

[5] 周錦龍，湯珍瑤. 雪茄煙發酵技術進展與展望[J]. 農技服務，2009，26（11）：119-120，127.

[6] 張彤彤，趙君，余君，等. 貝萊斯芽孢桿菌提升雪茄茄衣煙葉發酵品質機制研究[J]. 輕工學報，2023，38（6）：93-101.

[7] 時向東，王旭鋒，林開創，等. 雪茄外包皮煙堆積發酵中主要中性香氣物質的變化[J]. 西北農業學報，2013，22（7）：114-119.

[8] 榮仕賓，李晶晶，趙園園，等. 雪茄芯葉人工發酵溫濕度控制對化學成分和香味品質的影響[J]. 中國煙草學報，2021，27（2）：109-116.

[9] 瞿嬌嬌，施鳴，張慶明，等. 食品微生物對發酵煙葉品質的影響[J]. 貴州農業科學，2012，40（3）：136-138.

[10] 陳興，張天棟，黨立志，等. 利用西姆芽孢桿菌改善煙葉品質的研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學），2016，31（2）：322-327.

[11] 余玉莎，孫媛，李祖紅，等. 米根霉發酵對煙葉常規成分及主要致香成分的影響[J]. 云南農業大學學報（自然科學），2017，32（2）：379-385.

[12] 田麗君，劉佳琪，單玉靜，等. 微生物在雪茄煙葉發酵中的應用研究進展[J]. 農技服務，2024，41（8）：30-36.

[13] 宮長榮于建軍. 煙草原料初加工[M]. 北京：中國輕工業出版社，1993.

[14] 李梅云，高家合，王革，等. 微生物對煙葉蛋白質含量的影響[J]. 生物技術通報，2006，22（增刊1）：376-380.

[15] 趙銘欽，李芳芳，李曉強，等. 不同生物制劑處理對發酵烤煙香氣物質含量的影響研究[J]. 云南農業大學學報，2007，22（4）：519-524.

[16] 鄭建宇，劉晶，周桂園，等. 超濾膜組合技術對煙草提取物化學成分的影響[J]. 煙草科技，2019，52（12）：70-78.

[17] 國家煙草專賣局. 煙草及煙草制品 感官評價方法：YC/T 138—1998[S]. 北京：中國標準出版社，1998.

[18] 史宏志，劉國順. 煙草香味學[M]. 北京：中國農業出版社，1998.

[19] 莊以彬，吳鳳禮，殷華，等. 芳香族香料化合物生物合成研究進展[J]. 生物工程學報，2021，37（6）：1998-2009.

[20] 陳頤，韓香，楊彥明，等. 變黃期烘烤參數優化對加熱卷煙煙葉美拉德反應物的影響[J]. 云南農業大學學報（自然科學），2023，38（6）：980-986.

[21] 蘇宇，王玉平，楊虹琦，等. 不同香型烤煙主要美拉德反應物與感官評吸指標的相關性分析[J]. 中國農學通報，2016，32（7）：179-184.

（責任編輯：吳思文）