藍莓果實野生酵母菌株的分離鑒定及發酵性能研究

摘要" 為篩選用于藍莓果酒發酵的酵母菌，本研究利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法和杜氏小管發酵法對藍莓果實表面的酵母菌進行篩選，將篩選得到的菌株進行分子生物學鑒定以及生長曲線測定，以培養溫度、初始pH、葡萄糖、乙醇和二氧化硫（SO2）為影響因素，考察其發酵性能。結果表明，從藍莓果實表面共分離純化得到16株酵母菌株，篩選得到1株適用于后續試驗的酵母菌株ZL01；通過分子生物學鑒定和系統發育樹分析，確定菌株ZL01為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；發酵性能結果顯示，菌株ZL01的最佳培養溫度和pH分別為28 ℃和5，能夠在pH 2或38 ℃的環境下生長，且能耐受250 g/L葡萄糖、9%乙醇和250 mg/L SO2。綜上，菌株ZL01具有應用于藍莓果酒發酵的潛力。

關鍵詞" 藍莓；野生酵母；葡萄有孢漢遜酵母；發酵性能

中圖分類號" S663.9；TS201.3 """文獻標識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）03-0110-06

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.03.024

Isolation， identification and fermentation performance of wild yeast strains in blueberry fruit

LIU Xi SI Shengli YANG Kunfan

（College of Life and Health Science， Kaili University， Kaili 556011， China）

Abstract" In order to screen the yeast used for fermentation of blueberry wine， TTC staining method and Duchenne tubule fermentation method were used to screen the yeast on the surface of blueberry fruits in this study， the screened bacterial strains were identified by molecular biology and their growth curves were determined. Culture temperature， initial pH， glucose， ethanol and sulfur dioxide （SO2） were used as influencing factors. The fermentation performance was investigated. The results showed that 16 yeast strains were isolated and purified from the surface of blueberry fruit， and 1 yeast strain ZL01 was selected， which was suitable for the subsequent tests. The strain ZL01 was identified as Hanseniaspora uvarum by molecular biological identification and phylogenetic tree analysis. The fermentation performance results showed that the optimum growth temperature and pH of strain ZL01 were 28 ℃ and 5， respectively. The strain could grow at pH 2 or 38 ℃， and could tolerate 250 g/L glucose， 9% ethanol， and 250 mg/L SO2. In conclusion， strain ZL01 has the potential to be applied to the fermentation of blueberry wine.

Keywords" blueberry; wild yeast; Hanseniaspora uvarum; fermentation performance

藍莓是杜鵑花科越橘屬落葉叢生灌木植物，在我國主要分布于東北、西南和華南等地[1]。藍莓果實果肉細膩，富含維生素、花青素和多酚類化合物等物質，同時具有改善視力、增強免疫力等功效[2]，可作為鮮食水果，也適合用于生產加工。由于藍莓果實質地柔軟且含水量較高，不易貯存[3]，可經加工制成藍莓汁、藍莓果醬和藍莓果酒等易于貯存和運輸的產品。

藍莓果酒是以藍莓為原料，經酵母菌發酵而成的一種酒精飲料，酒精含量較低，口感風味俱佳。酵母菌尤其是野生酵母具有來源廣泛、種類豐富和代謝途徑多樣等特點，一定程度上影響發酵果酒的營養品質與風味[4]。藍莓果酒可通過自然發酵或人工添加酵母等方式發酵，目前用于藍莓果酒釀造的酵母菌多為商用釀酒酵母。蓋禹含等[5]研究發現，不同酵母發酵的藍莓酒含有相同的香氣成分；嚴紅光等[6]利用氣相色譜離子遷移譜技術在藍莓樣酒中檢出35種風味物質成分，利用氣質聯用技術檢出15種成分；陽志銳等[7]研究指出，異常威克漢姆酵母和葡萄酒釀酒酵母混合發酵的藍莓酒DPPH和ABTS自由基清除率均較高；李丹等[8]從藍莓中分離篩選出1株產酒性能優良、產品感官評分較高的菌株，經鑒定將其命名為粟酒裂殖酵母Y201505（Schizosaccharomyces pombe Y201505）；伍鶴等[9]從藍莓成熟果實、葉片及果園土壤中篩選得到最優菌株BBF-17，經鑒定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。關于野生酵母發酵的研究有待進一步探討，本研究利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法和杜氏小管發酵法對藍莓果實表面的酵母菌進行篩選，對確定進行后續試驗的菌株進行分子生物學鑒定以及生長曲線測定，同時從培養溫度、初始pH等方面對其發酵性能進行研究，為篩選藍莓果酒發酵專用酵母提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試驗試劑

藍莓果實采集自貴州省麻江縣宣威鎮生態藍莓種植基地。YPD培養基和TTC上層培養基參照佀勝利等[10]的方法進行配制。葡萄糖（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；TTC（分析純），福晨（天津）化學試劑有限公司；乙醇和硫酸（分析純），成都金山化學試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨和瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器設備

MJ-150-I霉菌培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；SHZ-82氣路恒壓振蕩器，邦西儀器科技（上海）有限公司；V-1100D可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；LC20液相色譜儀和RID-20A示差折光檢測器，島津企業（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化 稱取5 g藍莓果實，將其置于裝有45 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養24 h，得到藍莓果實表面微生物懸液。用無菌水將菌懸液梯度稀釋至10-6濃度，分別取10-4、10-5和10-6 濃度100 μL稀釋液涂布在YPD平板上，28 ℃培養24 h，挑選菌落形態與酵母菌較為一致的單菌落，經多次轉接純化后，將菌株編號保存備用。

1.3.2 酵母菌的篩選 （1）初篩：將純化得到的菌株接種在YPD平板，培養24 h后在平板上緩慢傾倒一層2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養基，之后置于28 ℃下遮光培養3 h，觀察菌落顏色變化。酵母菌株產酒精能力越強，菌落顏色越紅，選取紅色較深的菌株進行復篩。（2）復篩：取初篩得到的酵母菌株，用牙簽接種至裝有杜氏小管的YPD液體培養基中，28 ℃下靜置培養，間隔一段時間觀察杜氏小管內的氣體積存量。48 h后取發酵液在4 000 r/min轉速下離心10 min，用微孔濾膜過濾上清液，利用高效液相色譜法（HPLC）測定發酵液中葡萄糖和乙醇濃度。選取發酵液產氣較快、葡萄糖含量較低且乙醇含量較高的菌株進行后續試驗。采用HPLC測定各菌株發酵液中葡萄糖和乙醇含量，液相色譜條件：色譜柱為Shedox Sugar SH1011（8 mm×300 mm），流動相為5 mmol/L H2SO4，洗脫方式為等梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，柱溫65 ℃，檢測器為示差折光檢測器。

1.3.3 酵母菌的分子生物學鑒定 將篩選得到的酵母菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司，以引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）進行26S rDNA D1/D2區的擴增，并對PCR產物進行純化和測序，得到PCR擴增片段的原始序列。根據測序結果，利用BLAST軟件從GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列比對，利用MEGA X軟件選取相似度較高的酵母菌株核酸序列進行多序列對位排列，并構建系統發育樹。

1.3.4 酵母菌的生長曲線測定 將復篩得到的菌株接種于YPD液體培養基，28 ℃、150 r/min振蕩培養12 h，得到種子培養基。將種子培養基按5%接種量接種到新的YPD培養基中，28℃、150 r/min振蕩培養，在發酵0、2、4、8、12、24和48 h后分別取培養液，以未接種YPD培養基為對照，測定各培養液在600 nm處的吸光值，以取樣時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制酵母菌生長曲線。每個試驗設3次重復。

1.3.5 酵母菌的發酵性能研究 （1）培養溫度對酵母菌生長的影響：以5%接種量將種子培養基接種于YPD培養基中，分別在23、28、33、38和43 ℃條件下靜置培養48 h，培養結束后，測定各培養液在600 nm處的吸光度值。每個試驗設3次重復。（2）初始pH對酵母菌生長的影響：利用1% HCl調節YPD培養基pH至2、3、4、5和6，按照5%接種量接種種子培養基，28 ℃下靜置培養48 h，培養結束后，測定培養液在600 nm處的吸光度值。每個試驗設3次重復。（3）酵母菌的糖耐受性試驗：配制葡萄糖濃度分別為100、150、200、250和300 g/L的YPD液體培養基，后續操作與初始pH對酵母菌生長的影響試驗一致。（4）酵母菌的乙醇耐受性試驗：在YPD培養基中加入不同體積無水乙醇，將乙醇濃度（v/v）設定為3%、6%、9%和12%，后續操作與初始pH對酵母菌生長的影響試驗一致。（5）酵母菌的二氧化硫（SO2）耐受性試驗：在YPD培養基中加入不同質量的焦亞硫酸鉀，將SO2濃度設定為100、150、200和250 mg/L，后續操作與初始pH對酵母菌生長的影響試驗一致。

1.4 數據處理

使用Excel軟件進行數據處理，并使用Origin進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 野生酵母菌的篩選

經過增殖培養、分離純化，從藍莓果實表面共分離得到16株菌落形態類似酵母菌的菌株，編號ZL01～ZL16。16個菌株的顯色情況如表1所示，共得到深紅色菌株2株、紅色菌株3株、淺紅色菌株3株以及顏色不明顯菌株8株。

選擇TTC顯色為深紅色和紅色的5株菌株（ZL01、ZL13、ZL14、ZL15和ZL16）進行復篩，發酵過程中，5株菌株發酵液的杜氏小管均能在發酵18 h內充滿氣體。發酵結束后，對發酵液中的葡萄糖和乙醇含量進行測定，結果如圖1所示。其中，ZL01發酵液中的乙醇含量最高，葡萄糖含量最低，選擇該菌株進行后續試驗。

2.2 菌株ZL01的分子生物學鑒定

根據菌株ZL01的26S rDNA D1/D2區測序結果在NCBI數據庫中的比對信息，該菌株與葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似性在99%以上，選取有孢漢遜酵母屬相關菌株與ZL01進行系統發育樹構建，如圖2所示。ZL01與葡萄有孢漢遜酵母相似性達99%，因此確定ZL01為葡萄有孢漢遜酵母。

2.3 酵母菌株ZL01的生長曲線

將菌株ZL01振蕩培養48 h，定期測定培養液的吸光度值，以取樣時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制生長曲線，如圖3所示。發酵0～2 h，菌體數量增長緩慢，此階段為菌株ZL01的遲緩期；發酵2～8 h，菌體數量快速增加，為對數生長期；8～48 h菌體增長速度減緩并趨于穩定，為穩定期。

2.4 菌體ZL01的發酵性能

2.4.1 培養溫度 菌株ZL01在不同溫度下培養48 h，培養結束后測定各菌液在600 nm處的吸光度值，結果如圖4所示。隨著培養溫度的升高，培養液的OD600值呈先升高后降低的趨勢，在28 ℃時達到最高值，說明菌株ZL01的最適培養溫度為28 ℃；培養溫度為38 ℃時，將該溫度條件下的培養液涂布于YPD平板上，培養24 h有菌落生成。說明菌株ZL01能在38℃下生長，28 ℃下菌液濃度較高。

2.4.2 初始pH 將菌株ZL01放在不同初始pH的YPD培養基中培養48 h，培養結束后測定菌液在600 nm處的吸光度值，結果如圖5所示。隨著pH的增加，培養液的OD600值逐漸升高，在pH 5時達到最大值，pH 6時略有降低，說明pH 5接近菌株ZL01的最適生長環境。將初始pH 2的培養液涂布于YPD平板，24 h后有少量單菌落生成。說明菌株ZL01可在初始pH 2的環境下生長，在初始pH 5的環境下生長較旺盛。

2.4.3 菌株ZL01的糖耐受性 將菌株ZL01接種到含有不同濃度葡萄糖的YPD培養基中，培養48 h后測定菌液在600 nm處的吸光度值，結果如圖6所示。隨著葡萄糖濃度的增加，培養液的OD600值呈下降趨勢，其中葡萄糖濃度由100 g/L升高至150 g/L時，培養液的OD600值下降速度較快，葡萄糖濃度從200 g/L升高至250 g/L時，培養液吸光度值基本無變化。將250 g/L葡萄糖濃度培養液涂布于YPD平板上，24 h后有菌落生成，說明菌株ZL01能夠耐受250 g/L葡萄糖。

2.4.4 菌株ZL01的乙醇耐受性 將菌株ZL01接種到含有不同濃度乙醇的YPD培養基中，培養48 h后測定菌液在600 nm處的吸光度值，結果如圖7所示。隨著乙醇濃度的增加，培養液的OD600值呈下降趨勢。將乙醇濃度9%和12%的培養液涂布于YPD平板上，24 h后含9%乙醇培養液涂布的平板有少量菌落生成，而含12%乙醇培養液涂布的平板無菌落生長。說明菌株ZL01不能在12%乙醇溶液中生長，其最大耐受乙醇濃度接近9%。

2.4.5 菌株ZL01的SO2耐受性 將菌株ZL01接種到含有不同濃度SO2的YPD培養基中，培養48 h后測定菌液在600 nm處的吸光度值，結果如圖8所示。隨著SO2濃度的增加，培養液的OD600值呈下降趨勢，其中SO2濃度從100 mg/L升高至150 mg/L時，培養液的OD600值下降較快。將250 mg/L SO2的培養液涂布于YPD平板上，24 h后有菌落生成，說明菌株ZL01能夠耐受250 mg/L SO2。

3 結論與討論

為篩選出適用于藍莓果酒發酵的微生物菌株，本研究通過分離純化、兩級篩選、生物學鑒定、生長曲線繪制和發酵性能評價，從藍莓果實表面得到可用于藍莓果酒發酵的潛在酵母菌株1株，經鑒定為葡萄有孢漢遜酵母。該菌株的最佳生長溫度28 ℃，最佳生長pH 5，能耐受23 ℃低溫、38 ℃高溫、pH 2、250 g/L葡萄糖、9%乙醇和250 mg/L SO2。

葡萄有孢漢遜酵母是一種常用于果酒發酵的非釀酒酵母，在產β-葡萄糖苷酶和果酒增香上較釀酒酵母更有優勢[11-12]。馮文倩等[13]從葡萄篩選獲取了4株有孢漢遜酵母菌株，發現其耐受400 g/L糖、300 mg/L SO2、pH 2.8、10 ℃低溫、40 ℃高溫；劉曉柱等[14]從刺梨中分離得到1株葡萄有孢漢遜酵母，該菌株具有較好的檸檬酸耐受性，耐受300 mg/L SO2。本試驗與以上結果存在差異，可能與試驗設置的濃度梯度不一致有關。Li等[15]研究發現，從藍莓果實上分離到的葡萄有孢漢遜酵母對藍莓采后病害有較好的生防作用；Huang等[16]利用釀酒酵母和從刺梨中分離得到的葡萄有孢漢遜酵母對藍莓等水果進行混合發酵果酒，發現混合發酵可提高果酒香氣成分的復雜性，并賦予其獨特風味，同時該藍莓果酒在香氣物質的種類和含量上均優于其他兩種果酒。本試驗暫未測定該野生酵母菌株釀造的果酒風味物質等含量，后續可聚焦此方面開展研究。

酒類釀造過程中，酵母菌發揮了主要作用，商用酵母具有耐高酒精、高溫和較強的競爭優先營養物質的能力，使生產過程更簡單可控，產品安全性和穩定性更好，風味更有保障，但也存在典型性不足等問題[17-18]。野生酵母存在于藍莓的生長環境如土壤、植株表面，以及自然發酵液中，本文通過對野生酵母進行分離純化，從生長、生理生化與發酵特性等方面對野生酵母菌株進行篩選評價，為果酒發酵提供微生物資源，對提高果酒感官復雜性、賦予果酒獨特風味具有重要作用[19]。

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（責任編輯：吳思文）