生物活性玻璃45S5 通過細(xì)胞自噬促進(jìn)根尖牙乳頭細(xì)胞成牙本質(zhì)方向分化

[摘要] 目的 45S5 促進(jìn)根尖牙乳頭細(xì)胞（APCs） 成牙本質(zhì)方向分化作用機(jī)制仍不明確，本研究旨在探討細(xì)胞自噬參與生物活性玻璃45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化的作用。方法 體外分離培養(yǎng)APCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞組織來源。配置1 mg/mL 45S5 浸提培養(yǎng)液，檢測(cè)pH和離子濃度。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、45S5 組和3-甲基腺嘌呤（3-MA） 45S5 組，45S5 組為1 mg/mL 45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)APCs，3-MA 45S5 組為1 mg/mL 45S5 中加入自噬抑制劑（3-MA）。免疫印跡法（Western blot） 檢測(cè)各組誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3β （LC3B） 和P62 的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后骨涎蛋白（BSP）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runx2）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP） 和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1 （DMP-1） 的表達(dá)，細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP） 染色分析誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 細(xì)胞ALP 活性，茜素紅染色分析誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 礦化結(jié)節(jié)形成。結(jié)果 45S5 浸提培養(yǎng)液的pH為8.65±0.01，與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液的硅離子濃度為（1.56±0.07） mmol/L，高于對(duì)照組（0.08±0.01） mmol/L （Plt;0.05）；45S5 浸提培養(yǎng)液的鈣離子濃度為（1.57±0.15） mmol/L，與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，45S5 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值升高、P62 表達(dá)降低（Plt;0.05）；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低、P62 表達(dá)升高（Plt;0.05）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，45S5 組BSP、Runx2、DMP-1 和DSPP 表達(dá)增加；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組BSP、Runx2、DMP-1 和DSPP 表達(dá)降低（Plt;0.05）。ALP 染色和茜素紅染色分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，45S5 組ALP 活性增強(qiáng)，礦化結(jié)節(jié)形成增多；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組ALP 活性降低，礦化結(jié)節(jié)形成減少。結(jié)論 1 mg/mL 45S5 體外通過細(xì)胞自噬促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化。

[關(guān)鍵詞] 成牙本質(zhì)分化； 根尖牙乳頭細(xì)胞； 自噬； 生物活性玻璃45S5

[中圖分類號(hào)] Q254 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2025.2024177

生物活性玻璃45S5 因具有良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能，被廣泛用于骨組織再生[1-2]。近年來，生物活性玻璃類材料逐漸應(yīng)用于牙髓?牙本質(zhì)復(fù)合體再生。研究[3-6]表明，生物活性玻璃45-S5 可促進(jìn)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)方向分化、血管生成和小管樣牙本質(zhì)形成。年輕恒牙未閉合的根尖孔外獲取的根尖牙乳頭組織中能夠分離培養(yǎng)出具有多向分化潛能的干細(xì)胞，即根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cell from the apical papilla，SCAP），其與同一組織來源的牙髓干細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的端粒酶活性和形成牙本質(zhì)能力[7]，是牙髓?牙本質(zhì)復(fù)合體再生重要的細(xì)胞來源。45S5 體外可促進(jìn)根尖牙乳頭細(xì)胞（apical papilla cells，APCs） 的增殖、成牙本質(zhì)方向分化基因的表達(dá)和體外礦化結(jié)節(jié)的形成，但其作用機(jī)制仍未明確[8]。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞利用溶酶體對(duì)自身細(xì)胞器和大分子物質(zhì)進(jìn)行降解的過程，在細(xì)胞代謝、更新細(xì)胞器和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用[9]。與生物活性玻璃45S5 化學(xué)組成相似的硅酸鹽材料，如iRoot BP、MTA，均由SiO2 和CaO 等基本成分組成，iRoot BP 通過細(xì)胞自噬參與促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成牙本質(zhì)方向分化[10]，MTA 通過細(xì)胞自噬參與牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)方向分化[11]。本研究提出假設(shè)細(xì)胞自噬參與生物活性玻璃45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化，旨在明確45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化的作用機(jī)制，為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

45S5 生物活性玻璃（B139900，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胎牛血清（安徽康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司），茜素紅、BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），氯化十六烷基吡啶、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC） 水、BCIP/NBT 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），10×洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）、10×蛋白電轉(zhuǎn)移緩沖液、10×SDS-PAGE 電泳緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），一步法PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒（蘇州新賽美生物科技有限公司），高血糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胰酶（Gibco 公司，美國(guó)），β-甘油磷酸鈉、維生素C、噻唑藍(lán)、地塞米松、二甲基亞砜（Sigma 公司，美國(guó)），微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3β （microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B） 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)），SYBRgreen 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液、TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國(guó)）， Premix 型反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa 公司， 日本）， 3- 甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）（Apexbio 公司，美國(guó)），P62 抗體（Proteintech 公司，美國(guó)），Ⅰ型膠原蛋白酶（Wotthington 公司，美國(guó)）， CD29、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146 （BD公司，美國(guó)）。

pH儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），高溫高壓蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），超純水（ultrapure water，UP 水） 機(jī)（青島富勒姆科技有限公司），恒溫水浴箱（嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司），玻璃板、制膠器、半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、梳子（BIORAD 公司，美國(guó)），CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)），恒溫混勻儀、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國(guó)），倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)所，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 APCs 的獲得、培養(yǎng)和鑒定

本實(shí)驗(yàn)根尖牙乳頭組織取自濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科門診12～18 歲因正畸需要拔除的患者的前磨牙，患者及家屬知情同意，實(shí)驗(yàn)方案通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理批號(hào)：2019-G036-01）。離體牙立即放入無菌培養(yǎng)液中，超凈臺(tái)內(nèi)PBS 沖洗牙齒表面的血液及雜質(zhì)，4 h 內(nèi)完成原代培養(yǎng)。無菌刀片切下牙齒根尖部牙乳頭組織，眼科剪修剪組織至1 mm3大小，漂洗離心， 組織塊中加入1 mLⅠ型膠原蛋白酶，37 ℃水浴消化至組織塊完全消失，離心后棄上清液，加入2 mL 含20%DMEM培養(yǎng)液，接種于6 孔板37 ℃、5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%后進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第2 和第4 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第2 代APCs，消化離心后制備5.0×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，依次取200 μL 加入EP 管中，避光加一抗（CD29 20 μL，CD34 20 μL，CD45 20 μL，CD90 10 μL，CD105 10 μL，CD14620 μL；陰性對(duì)照為用PBS 代替一抗孵育），避光冰上孵育30 min，PBS 漂洗離心2 次，細(xì)胞懸液通過200 目細(xì)胞篩過濾收集于流式管內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowing Software 2.5.1 分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 生物活性玻璃45S5誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配置和pH、離子濃度檢測(cè)

電子天平稱量生物活性玻璃45S5 粉末，錫箔紙包裹后于180 ℃干熱滅菌4 h，冷卻至室溫備用。將45S5 按照1 mg/mL 加入DMEM培養(yǎng)液，封口膜封口后置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h，離心取上清經(jīng)0.22 μm 無菌針頭式過濾器過濾，即1 mg/mL 的45S5 浸提培養(yǎng)液；不加入45S5 的DMEM培養(yǎng)液37 ℃浸提24 h，離心后上清經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾，即DMEM浸提培養(yǎng)液。向上述各浸提培養(yǎng)液內(nèi)分別加入10%胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素混合液，即45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液和DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

取45S5 浸提培養(yǎng)液和DMEM 浸提培養(yǎng)液各5 mL，使用pH 儀測(cè)定溶液pH，離子體發(fā)射光譜測(cè)定浸提培養(yǎng)液硅離子及鈣離子的濃度（由上海薈銘檢測(cè)設(shè)備有限公司測(cè)定）。

1.2.3 免疫印跡法（Western blot） 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、45S5 組和3-MA 45S5組，對(duì)照組為DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液，45S5 組為1 mg/mL 的45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液，3-MA 45S5 組為1 mg/mL 的45-S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入5 mmol/L 3-MA。取第4 代APCs 以2.0×104個(gè)/mL將細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)記為第0 天。加入各組誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說明書提取總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定盒測(cè)定蛋白樣品濃度，加入U(xiǎn)P 水將蛋白樣品濃度稀釋為1.25 μg/μL 的中間液，加入中間液體積1/5 的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，配置為1 μg/μL 的蛋白樣品，金屬浴95 ℃，5 min，使蛋白充分變形，?20 ℃冷凍保存。蛋白電泳，一抗稀釋比例GAPDH 為1∶2 000，P62 為1∶50 000，LC3 為1∶1 000，二抗稀釋比例為1∶10 000，曝光條帶。使用ImageJ 軟件計(jì)算條帶灰度值，以自噬相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)、組別為橫坐標(biāo)，繪制直方圖。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR） 檢測(cè)細(xì)胞自噬對(duì)45S5 誘導(dǎo)APCs 成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、45S5 組和3-MA 45S5 組，同1.2.3。取第4 代APCs 以1.5×105 個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)記為第0 天。加入各組誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度，按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，結(jié)束后?20 ℃保存。RT-qPCR 檢測(cè)骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx-2）、牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白1 （dentin matrix protein1，DMP-1）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP） 的表達(dá)。反應(yīng)條件為50 ℃2 min，95 ℃ 10 min （1 個(gè)循環(huán)，預(yù)變性）；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s （40 個(gè)循環(huán)，PCR 反應(yīng)）；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s （溶解階段）。BSP、Runx2、DMP-1、DSPP 及內(nèi)參的引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線，驗(yàn)證引物特異性及產(chǎn)物是否單一。以GAPDH為內(nèi)參，用定量的2?△△CT 法計(jì)算相對(duì)mRNA 表達(dá)水平，以細(xì)胞因子為橫坐標(biāo)、RNA含量為縱坐標(biāo)，繪制直方圖。

1.2.5 細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色及BCA半定量檢測(cè)細(xì)胞自噬對(duì)45S5 誘導(dǎo)APCs ALP 活性的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、礦化誘導(dǎo)（OM） 組、45S5組和3-MA 45S5 組，對(duì)照組為DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液（即陰性對(duì)照組），OM組為DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、10 nmol/L 地塞米松和50 mg/mL 抗壞血酸（即陽(yáng)性對(duì)照組），45S5組為1 mg/mL 的45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液，3-MA 45S5 組為1 mg/mL 的45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入5 mmol/L 3-MA。取第4 代APCs 以1.5×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于12 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)，記為第0天。分別加入各組誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，每48 h更換培養(yǎng)液。按照BCIP/NBT顯色試劑盒說明書染色，顯微鏡下觀察拍照。提取單層貼壁細(xì)胞總蛋白，BCA半定量檢測(cè)蛋白濃度，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)至562 nm，測(cè)定光密度（optical density，OD） 值。

1.2.6 茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶半定量分析細(xì)胞自噬對(duì)45S5 誘導(dǎo)APCs 礦化能力的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、OM 組、45S5 組和3-MA45S5 組，對(duì)照組為DMEM 誘導(dǎo)培養(yǎng)液（即陰性對(duì)照組），OM 組為DMEM 誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、10 nmol/L 地塞米松和50 mg/mL 抗壞血酸（即陽(yáng)性對(duì)照組），45S5 組為1 mg/mL的45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、10 nmol/L地塞米松和50 mg/mL抗壞血酸，3-MA 45S5 組為1 mg/mL 的45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入5 mmol/L 3-MA、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、10 nmol/L 地塞米松和50 mg/mL 抗壞血酸。取第4代APCs 以1.5×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于12 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)，記為第0 天，分別加入各組誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)至21 d，每孔加入1 mL4%多聚甲醛固定液固定30 min，0.1%茜素紅染色液室溫下染色30 min，UP 水輕柔漂洗3 次，顯微鏡下觀察并拍照記錄。每孔加入100 mmol/L 氯化十六烷基吡啶溶液1 mL，室溫下放置30 min 使待測(cè)孔底色完全溶解，反復(fù)吹打充分混勻后，每孔吸取120 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔板，每孔3 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)至496 nm處，測(cè)定各組OD值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。浸提液pH、離子濃度的差別經(jīng)正性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。各組基因、蛋白、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)半定量分析的差別，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)方差齊后，采用單因素方差進(jìn)行分析。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。雙側(cè)檢驗(yàn)Plt;0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APCs 的培養(yǎng)及鑒定

在連續(xù)培養(yǎng)過程中，第1 代至第3 代APCs 均保持間充質(zhì)細(xì)胞的典型的長(zhǎng)梭形形態(tài)特點(diǎn)（圖1A、B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，APCs 陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD146、CD29和CD105，陰性表達(dá)造血系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45 （圖1C～H）。

2.2 45S5 浸提培養(yǎng)液的pH及離子濃度

45S5 浸提培養(yǎng)液與DMEM浸提培養(yǎng)液的pH及離子濃度見表2。統(tǒng)計(jì)分析表明，45S5 浸提培養(yǎng)液的pH、鈣離子濃度與DMEM浸提培養(yǎng)液相比，二者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。45S5 浸提培養(yǎng)液的硅離子濃度高于DMEM浸提培養(yǎng)液，二者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.3 45S5 體外促進(jìn)APCs 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

免疫印跡法檢測(cè)45S5 體外對(duì)APCs自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比，45S5組P62 相對(duì)表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組P62 相對(duì)表達(dá)增加，但仍低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與對(duì)照組相比，45S5 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與45S5組相比，3-MA 45S5 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低，但仍高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)果表明：45S5 增強(qiáng)APCs 的自噬水平，3-MA抑制45S5 促進(jìn)自噬的作用。

2.4 45S5 體外通過細(xì)胞自噬促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞自噬對(duì)45S5 誘導(dǎo)APCs 成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果見圖3。與對(duì)照組相比，45S5 組BSP、Runx2、DMP-1 和DSPP 表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組BSP、Runx2、DMP-1和DSPP 基因表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)果表明：45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因BSP、Runx2、DMP-1 和DSPP 的表達(dá)，3-MA抑制45S5 的促進(jìn)作用。

2.5 45S5 體外通過細(xì)胞自噬促進(jìn)APCs ALP 活性

細(xì)胞自噬對(duì)45S5 誘導(dǎo)APCs ALP 活性的影響見圖4。培養(yǎng)7 d 后，對(duì)照組、OM組與45S5 組藍(lán)染，3-MA 45S5 組藍(lán)染較弱。BCA 半定量檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OM組和45S5 組OD值升高，3-MA 45S5 組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與OM組相比，45S5 組OD值變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3-MA 45S5 組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）； 與45S5 組相比， 3-MA45S5 組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)果表明：45S5 促進(jìn)APCs ALP 活性，3-MA抑制45S5 的促進(jìn)作用。

2.6 45S5 體外通過細(xì)胞自噬促進(jìn)APCs 礦化結(jié)節(jié)的形成

茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶半定量分析結(jié)果見圖5。茜素紅染色顯示，對(duì)照組紅染不明顯，OM組與45S5 組均有紅染，3-MA組可見少量紅染。氯化十六烷基吡啶半定量分析顯示，培養(yǎng)21 d 后，與對(duì)照組相比，OM組、45S5 組和3-MA45S5 組OD 值均升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與OM組相比，45S5 組OD值升高，3-MA45S5 組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與45S5 組相比，3-MA 45S5 組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)果表明：45S5 促進(jìn)APCs礦化結(jié)節(jié)形成，3-MA抑制45S5 的促進(jìn)作用。

3 討論

45S5 的主要成分構(gòu)成為Na2O （24.5%）、CaO（24.5%）、P2O5 （6.0%） 和SiO2 （45%）。45S 是指45%的SiO2，5 表示Ca 和P 的摩爾比為5∶1。本研究使用的45S5 是粒徑為20～50 μm的不規(guī)則顆粒。生物活性玻璃中，Na+和K+等與溶液中H+迅速交換形成OH?，導(dǎo)致pH升高。本研究中，DMEM浸提培養(yǎng)液和45S5 浸提培養(yǎng)液的pH 分別為8.60±0.03和8.65±0.01，與細(xì)胞活躍增殖的7.58～8.55 pH范圍接近。0.5～4 mmol/L 的硅離子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成骨方向分化[8]，本研究中45S5組硅離子濃度為（1.56±0.07）mmol/L，促進(jìn)APCs 的分化。本研究發(fā)現(xiàn)45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化有細(xì)胞自噬的參與。細(xì)胞成牙本質(zhì)方向分化的相關(guān)基因主要是DSPP 和DMP-1，其中DSPP 是成牙本質(zhì)分化的特異性標(biāo)志物[12]，主要在成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。DMP-1 是一種細(xì)胞外非膠原基質(zhì)蛋白，廣泛存在于牙本質(zhì)與骨骼中[13]。DMP-1 與DSPP 具有協(xié)同關(guān)系，是DSPP 的下游因子，對(duì)牙本質(zhì)礦化及成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化有著重要作用[14]。本研究中1 mg/mL 45S5 體外培養(yǎng)7 d 后，DSPP 和DMP-1 等成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因表達(dá)水平上升，45S5體外促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化；加入3-MA后DSPP 和DMP-1 表達(dá)水平下降，表明45S5 促進(jìn)APCs成牙本質(zhì)方向分化有細(xì)胞自噬的參與。

本研究發(fā)現(xiàn)，45S5 體外促進(jìn)APCs 礦化結(jié)節(jié)形成和ALP 活性升高。細(xì)胞基質(zhì)中鈣鹽沉積的情況能直觀反映細(xì)胞成骨分化水平，礦化是成牙本質(zhì)分化的晚期標(biāo)志。茜素紅可與鈣鹽反應(yīng)形成紅色沉積物，定性分析細(xì)胞的成骨分化情況可通過觀察不同組之間紅色深淺的差異以及顯微鏡下紅色沉積物的情況來完成。通過表面活性劑氯化十六烷基吡啶來溶解紅色沉積物，可半定量分析細(xì)胞的成骨分化情況[15]。本研究中1 mg/mL 45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后，相比OM組產(chǎn)生更多的礦化結(jié)節(jié)，加入3-MA后礦化結(jié)節(jié)減少，表明45S5 促進(jìn)APCs 體外礦化能力有細(xì)胞自噬的參與。ALP 在牙齒形成的多種細(xì)胞中表達(dá)，組織非特異性ALP 突變引起的低磷酸酯酶癥表現(xiàn)為骨骼與牙齒的牙本質(zhì)礦化異常[16]。在礦化過程中無機(jī)磷酸鹽（Pi） 與鈣離子結(jié)合生成羥磷灰石，核苷酸焦磷酸/磷酸二酯酶1和進(jìn)行性強(qiáng)直蛋白同源物的產(chǎn)物無機(jī)焦磷酸（PPi） 會(huì)抑制羥磷灰石的形成，ALP 可以水解PPi并將其分解為Pi 促進(jìn)羥磷灰石形成[17]。本研究中1 mg/mL 45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后，APCs ALP 活性升高，加入3-MA 后ALP 活性降低，表明45S5 促進(jìn)APCs ALP 活性有細(xì)胞自噬的參與。

本研究發(fā)現(xiàn)45S5 促進(jìn)APCs 自噬水平上升，加入3-MA后，45S5 對(duì)APCs 自噬水平的促進(jìn)作用被抑制。細(xì)胞自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，第一步高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，即為吞噬泡；第二步吞噬泡的膜延伸，將細(xì)胞質(zhì)包入其中形成具有完整囊泡結(jié)構(gòu)的自噬體；第三步溶酶體與自噬體融合，被包圍的細(xì)胞質(zhì)成分降解，回到細(xì)胞質(zhì)繼續(xù)發(fā)揮作用[18]。評(píng)價(jià)自噬水平的黃金標(biāo)準(zhǔn)是LC3 和P62。蛋白酶ATG4 裂解LC3，在自噬小泡形成過程中生成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，并定位于自噬小體的內(nèi)外膜上，在自噬體膜形成中起著重要作用。LC3-Ⅱ作為連接蛋白可以與P62 蛋白結(jié)合，使自噬體與溶酶體融合并吞噬底物。因此在自噬體與溶酶體融合過程中，LC3 是關(guān)鍵因子。LC3-Ⅱ的數(shù)量可以反映自噬體和自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)的數(shù)量，因此采用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值檢測(cè)自噬水平的變化，自噬水平越高，比值越高[19-20]。P62 蛋白是細(xì)胞自噬過程中的重要受體，在自噬過程中結(jié)合自噬體膜上的ATG8 與LC3-Ⅱ蛋白，并被整合到自噬體中，參與自噬體與溶酶體結(jié)合轉(zhuǎn)化為自噬溶酶體的過程，是被溶酶體降解的底物。因此P62 表達(dá)與自噬呈反比，自噬被抑制則P62 作為底物積累而表達(dá)增加，自噬激活則P62 表達(dá)降低。3-MA抑制自噬泡形成，抑制自噬的位點(diǎn)位于LC3 和P62 的上游，因此，加入3-MA，會(huì)在降低LC3-Ⅱ的數(shù)量同時(shí)增加LC3-Ⅰ的數(shù)量，并抑制P62 的消耗，導(dǎo)致P62 堆積，數(shù)量上升。

Vitapex 在激活SCAPs 自噬的同時(shí)，促進(jìn)成牙與成骨方向分化。0.5 mmol/L氟化鈉體外促進(jìn)SCAPs礦化能力提升，成牙本質(zhì)分化標(biāo)志物基因和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5 和Beclin1 表達(dá)上升，沉默ATG5 阻斷自噬后，成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)降低，表明自噬參與NaF 促進(jìn)SCAPs 成牙本質(zhì)方向分化的過程[21]。20 μmol/L 的原硅酸通過促進(jìn)細(xì)胞自噬促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化和礦化[22]，提示硅離子通過自噬促進(jìn)細(xì)胞成骨方向分化的可能。本研究通過檢測(cè)45S5 誘導(dǎo)培養(yǎng)后APCs 中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及P62 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)45S5 組的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，P62 蛋白表達(dá)下降，表明45S5 能夠促進(jìn)APCs 的自噬水平。進(jìn)一步檢測(cè)成牙本質(zhì)方向分化相關(guān)基因DSPP 和DMP-1 等的表達(dá)情況、45S5對(duì)APCs ALP 活性的影響以及礦化結(jié)節(jié)的形成情況，發(fā)現(xiàn)45S5 組中DSPP 和DMP-1 等的表達(dá)水平上升，ALP 活性增加，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，表明45S5 體外促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化；為了驗(yàn)證細(xì)胞自噬在這一過程中的作用使用了自噬抑制劑3-MA，加入3-MA 后DSPP 和DMP-1 等的表達(dá)水平下降，ALP 活性降低，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，表明45S5 促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化中有細(xì)胞自噬參與。

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)45S5 可能通過溶解釋放適宜濃度的硅離子，促進(jìn)APCs 成牙本質(zhì)方向分化，且細(xì)胞自噬參與該過程。盡管本研究在探索45S5 對(duì)APCs 成牙本質(zhì)方向分化的影響以及細(xì)胞自噬在這一過程中的作用方面取得了初步成果，但仍存在一些不足。雖然研究中觀察到了45S5 促進(jìn)APCs 細(xì)胞自噬水平上升的現(xiàn)象，并通過抑制劑3-MA驗(yàn)證了細(xì)胞自噬在成牙本質(zhì)分化中的參與，但對(duì)于自噬如何具體促進(jìn)細(xì)胞分化，以及45S5 如何調(diào)控自噬的分子機(jī)制，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和深入解析。目前的研究主要集中在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，雖然這些結(jié)果為45S5 的生物學(xué)效應(yīng)提供了初步證據(jù)，但體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性意味著需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證45S5 促進(jìn)APCs成牙本質(zhì)方向分化的效果，以及細(xì)胞自噬在其中的作用。未來尚需要設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估45S5 在體內(nèi)對(duì)APCs 成牙本質(zhì)方向分化的影響以及細(xì)胞自噬在這一過程中的作用，為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生和修復(fù)提供新的策略。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 李彩）

[基金項(xiàng)目] 山東省自然科學(xué)基金（ZR2019PH083）