circPRMT5靶向miR-376a-3p調控膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的作用機制

摘要""目的：探討circPRMT5對膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響及分子機制。方法：選取2020年5月—2022年5月我院腦膠質瘤組織和顱腦外傷病人腦組織標本各37例；膠質瘤細胞U251分為si-NC組、si-circPRMT5組、pcDNA組、pcDNA-circPRMT5組、miR-NC組、miR-376a-3p組、si-circPRMT5＋anti-miR-NC組及si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測circPRMT5和miR-376a-3p表達水平；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞增殖活性；流式細胞儀檢測細胞凋亡；蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞增殖及凋亡相關蛋白表達。雙熒光素酶報告實驗檢測circPRMT5和miR-376a-3p的靶向調控關系。結果：與顱腦外傷病人腦組織比較，膠質瘤組織中circPRMT5表達水平（2.55±0.18與1.00±0.07）升高，miR-376a-3p表達水平（0.42±0.05與1.00±0.06）］降低（P＜0.05）。抑制circPRMT5表達后，細胞活性（0.32±0.03與0.74±0.06）降低，細胞凋亡率［（22.37±1.83）%與（7.47±0.62）%］升高，周期蛋白D1（CyclinD1）及B細胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）蛋白相對表達量降低，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）及Bcl-2相關x蛋白（Bax）相對表達量升高（P＜0.05）。過表達miR-376a-3p后，細胞活性（0.41±0.04與0.76±0.07）降低，細胞凋亡率［（19.51±1.40）%與（7.37±0.53）%］升高，CyclinD1及Bcl-2蛋白相對表達量降低，p21及Bax蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。miR-376a-3p組轉染WT-circPRMT5的細胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC組（0.59±0.04與1.03±0.07，P＜0.05），而轉染MUT-circPRMT5的細胞熒光素酶活性無顯著變化（1.00±0.05與1.02±0.08，P＞0.05）。結論：抑制circPRMT5表達可能通過靶向上調miR-376a-3p抑制膠質瘤U251細胞增殖，促進細胞凋亡。

關鍵詞""膠質瘤；增殖；凋亡；circPRMT5；miR-376a-3p；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.04.008

circPRMT5 Targets miR-376a-3p to Regulate Proliferation and Apoptosis of Glioma U251 Cells

HUANG Chao， FANG Xinggang， CHEN Lu

Taihe Hospital， Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China

Corresponding Author "FANG Xinggang， E-mail： 957336859@qq.com

Abstract "Objective：To explore the effect and molecular mechanism of circPRMT5 on the proliferation and apoptosis of glioma U251 cells.Methods：A total of 37 specimens of brain glioma tissues and 37 specimens of brain tissues from patients with craniocerebral trauma were selected from May 2020 to May 2022.U251 glioma cells were divided into si-NC group，si-circPRMT5 group，pcDNA group，pcDNA-circPRMT5 group，miR-NC group，miR-376a-3p group，si-circPRMT5+anti-miR-NC group，and si-circPRMT5+anti-miR-376a-3p group.Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） was used to detect the expressions of circPRMT5 and miR-376a-3p.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） was used to detect cell activity.Flow cytometry was used to detect apoptosis.The expression of proteins related to cell proliferation and apoptosis was detected by Western Blot.The dual luciferase reporter assay was used to detect the relationship between circPRMT5 and miR-376a-3p.Results：Compared with the brain tissue of patients with traumatic brain injury，the expression level of circPRMT5 in glioma tissue was increased（2.55±0.18 vs 1.00±0.07，P＜0.05），and the expression level of miR-376a-3p was decreased（0.42±0.05 vs 1.00±0.06，P＜0.05）.After inhibiting the expression of circPRMT5，cell viability （0.32±0.03 vs 0.74±0.06） was decreased，cell apoptosis rate [（22.37±1.83）% vs （7.47±0.62）%] was increased，the expression levels of CyclinD1 and B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2） were decreased，and the expression levels of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A（p21） and Bcl-2 related X（Bax） protein were increased（P＜0.05）.After overexpression of miR-376a-3p，cell viability（0.41±0.04 vs 0.76±0.07） was decreased，and cell apoptosis rate[（19.51±1.40）% vs （7.37±0.53）%] was increased，the expression levels of CyclinD1 and Bcl-2 were decreased，and the expression levels of p21 and Bax were increased（P＜0.05）.Compared with the miR-NC group，the luciferase activity of cells transfected with WT-circPRMT5 in the miR-376a-3p group was decreased（0.59±0.04 vs 1.03±0.07，P＜0.05），while the luciferase activity of cells transfected with MUT-circPRMT5 was no significant change（1.00±0.05 vs 1.02±0.08，P＞0.05）.Conclusion：Inhibition of circPRMT5 expression may inhibit the proliferation of glioma U251 cells and promote apoptosis by targeting up-regulation of miR-376a-3p.

Keywords""glioma; proliferation; apoptosis; circPRMT5; miR-376a-3p; experimental research

膠質瘤屬于顱內惡性腫瘤，傳統治療方法效果有限，分子靶向治療作為一種新的方法在治療膠質瘤中逐漸得到認可^［1-2］。環狀RNA（circular RNA，circRNA）在癌癥中起著重要作用，可作為分子治療的靶點^［3］。circPRMT5與許多惡性腫瘤的進展有關。研究報道，circPRMT5參與結直腸癌、非小細胞肺癌、膀胱上皮癌等腫瘤的調控^［4-7］。目前膠質瘤中circPRMT5表達及其對膠質瘤細胞生物學行為的影響尚無相關報道。研究顯示，微小RNA（miRNA）參與惡性腫瘤的發病機制^［8］，過表達miR-376a-3p可抑制骨肉瘤細胞的增殖^［9］。miR-376a-3p過表達抑制了膠質瘤細胞的增殖和轉移能力^［10］。本研究前期通過生物學在線軟件預測發現circPRMT5與miR-376a-3p存在結合位點，推測circPRMT5可能對miR-376a-3p具有靶向調控作用。本實驗探討circPRMT5對膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月—2022年5月本院經病理組織學確診為腦膠質瘤37例病人組織標本，男17例，女20例；年齡（35±2）歲；世界衛生組織（WHO）分級標準：Ⅰ級4例，Ⅱ級15例，Ⅲ級12例，Ⅳ級6例。另選擇37例顱腦外傷病人為對照，包括男19例，女18例；年齡（31±2）歲。病人及家屬知情并同意本研究。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準（倫理批號：科研快審〔2020KS31〕號）。

1.2 細胞與主要試劑

膠質瘤細胞株U251、胎牛血清、RPMI-1640培養基購自武漢普諾賽公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒購自武漢愛博泰克公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒、蛋白質提取及檢測相關試劑盒購自武漢賽維爾公司；膜凋亡檢測相關試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京義翹神州公司。

1.3 細胞處理與分組

膠質瘤細胞株U251完全培養基為10%胎牛血清＋90%RPMI-1640培養液，培養條件為37 ℃培養箱、5% CO₂，取對數生長期細胞，將si-NC、si-circPRMT5、pcDNA、pcDNA-circPRMT5、miR-NC及miR-376a-3p分別轉染至U251細胞（分別標記為si-NC組、si-circPRMT5組、pcDNA組、pcDNA-circPRMT5組、miR-NC組、miR-376a-3p組）。分別將si-circPRMT5與anti-miR-NC、anti-miR-376a-3p共轉染至U251細胞中（分別記為si-circPRMT5＋anti-miR-NC組、si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組）。另選擇未行任何處理的U251細胞為對照（Con組）。周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X（Bcl-2 associated X，Bax）蛋白等一抗購自北京天根公司。上述各組細胞處理24 h后培養24 h行后續檢測。

1.4 circPRMT5和miR-376a-3p表達檢測

qRT-PCR檢測circPRMT5和miR-376a-3p表達。提取各組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA擴增檢測，circPRMT5正向引物序列：5′-GTACCGTTATGGGCTGCTGT-3′，反向引物序列：5′-TATGCATTTCCCTCCCTCTG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物序列：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；miR-376a-3p正向引物序列：5′-ATCATAGAGGAAAATCCACGT-3′，反向引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6正向引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。具體檢測步驟參考文獻［5］。采用2^－△△Ct法計算circPRMT5和miR-376a-3p的相對表達量。

1.5 細胞增殖活性檢測

采用MTT法檢測細胞增殖活性，采用酶標儀檢測490 nm下吸光度（OD）值，計算細胞增殖活性。

1.6 CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白表達檢測

采用蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白表達。提取各組細胞總蛋白，電泳顯像后拍照，選擇GAPDH為內參，計算CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白相對表達量。

1.7 細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。收集上述各組細胞并制作成細胞懸液，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡并計算凋亡率。

1.8 檢測circPRMT5和miR-376a-3p的靶向調控關系

構建circPRMT5野生型（WT-circPRMT5）和突變型（MUT-circPRMT5）熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miRNA共轉染至U251細胞中，檢測熒光素酶活性。

1.9 統計學處理

采用Medcalc 22.8行數據整理及統計學分析。定量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析（組間兩兩比較采用SNK檢驗）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circPRMT5和miR-376a-3p在膠質瘤病人及顱腦外傷病人中的表達比較

與對照組比較，膠質瘤組織中circPRMT5表達水平升高（t=48.818，P＜0.05），miR-376a-3p表達水平降低（t=－45.171，P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 抑制circPRMT5表達時U251細胞增殖改變

與si-NC組比較，si-circPRMT5組circPRMT5表達水平降低（t=－14.298，P＜0.05），細胞活性降低（t=－18.783，P＜0.05），CyclinD1表達降低（t=－27.504，P＜0.05），p21表達水平升高（t=24.820，P＜0.05）。詳見圖2～圖4。

2.3 抑制circPRMT5表達時U251細胞凋亡改變

si-circPRMT5組凋亡率及Bax蛋白表達升高，明顯高于Con組及si-NC組，Bcl-2蛋白表達明顯低于Con組及si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖5～圖8。

2.4 circPRMT5靶向調控miR-376a-3p檢測

circPRMT5與miR-376a-3p互補的核苷酸序列提示circPRMT5對miR-376a-3p存在靶向調控可能，見圖9。miR-376a-3p組轉染WT-circPRMT5的細胞熒光素酶活性明顯低于miR-NC組（t=16.373，P＜0.05），詳見圖10。pcDNA-circPRMT5組miR-376a-3p表達水平低于pcDNA組（t=－19.181，P＜0.05）；si-circPRMT5組miR-376a-3p表達水平高于si-NC組（t=21.441，P＜0.05）。詳見圖11。

2.5 上調miR-376a-3p表達時U251細胞增殖和凋亡改變

miR-376a-3p組miR-376a-3p表達、細胞凋亡率、p21、Bax表達明顯高于miR-NC組，細胞活性、CyclinD1、Bcl-2表達明顯低于miR-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖12～圖14及表1

2.6 下調miR-376a-3p表達逆轉抑制circPRMT5表達對U251細胞增殖和凋亡的影響

si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組miR-376a-3p表達、細胞凋亡率、p21、Bax表達低于si-circPRMT5＋anti-miR-NC組，細胞活性、CyclinD1、Bcl-2表達高于si-circPRMT5＋anti-miR-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖15～圖17及表2。

3 討論

本研究結果顯示，膠質瘤組織中circPRMT5表達水平升高，提示circPRMT5可能在膠質瘤中有促癌基因作用。下調circPRMT5表達后U251細胞活性、CyclinD1及Bcl-2蛋白表達降低，細胞凋亡率、p21及Bax表達升高，提示下調circPRMT5表達時可抑制膠質瘤細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能與調控細胞增殖及凋亡相關蛋白表達有關。研究報道circPRMT5在乳頭狀甲狀腺癌組織和細胞系中上調表達，敲低circPRMT5可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導細胞凋亡^［11］。circPRMT5可通過調控不同miRNA促進胃癌、結直腸癌、肝癌細胞的進展^［12-14］。表明circPRMT5在多種腫瘤中可能作為促癌基因起作用，與本實驗circPRMT5在膠質瘤中起促癌作用的結果一致。本研究報道了circPRMT5在膠質瘤中的作用，不僅進一步揭示了膠質瘤的可能發病機制，還為其靶向治療提供了可能的分子靶點。

circRNA可充當具有基因調控潛力的高效microRNA的海綿，為研究circPRMT5影響膠質瘤的可能作用機制，本研究通過StarBase在線軟件預測circPRMT5可能結合的miRNA，發現circPRMT5與miR-376a-3p存在可能結合位點，進一步雙熒光素酶報告實驗表明，circPRMT5對miR-376a-3p具有靶向調控作用。本研究還發現膠質瘤組織中miR-376a-3p表達水平降低，與研究中miR-376a-3p在神經膠質瘤組織中低表達的結果^［10］一致。且本實驗過表達miR-376a-3p后可抑制膠質瘤U251細胞的增殖，誘導細胞凋亡；進一步證明了過表達miR-376a-3p可抑制膠質瘤細胞增殖，且新發現過表達miR-376a-3p可誘導膠質瘤細胞凋亡。miR-376a-3p可影響結直腸癌的進展^［15］。說明miR-376a-3p在結直腸癌中也起抑癌基因作用，本實驗結果與其一致。本研究結果發現下調miR-376a-3p表達后，抑制circPRMT5表達對U251細胞增殖和凋亡的影響得到逆轉，這些證據表明circPRMT5調控U251細胞的增殖和凋亡的分子機制可能與靶向調控miR-376a-3p有關。

綜上所述，circPRMT5對U251細胞增殖及凋亡具有調控作用，其分子機制可能與靶向調控miR-376a-3p有關。然而本研究目前僅在體外細胞層面研究circPRMT5對膠質瘤細胞的影響，有一定的局限性。下一步將在小鼠中進行相關體內實驗，以進一步證實其在體內腫瘤中的作用。

參考文獻：

［1］ 趙艷紅，徐保鋒，游洪，等.高度惡性膠質瘤治療的研究進展［J］.癌癥進展，2019，17（9）：1008-1010.

［2］ 韓碩.基于膠質瘤分子分型的靶向治療［J］.國際神經病學神經外科學雜志，2018，45（1）：83-86.

［3］ 王華麗，王心曉，程守斌，等.hsa_circ_0082374靶向miR-4428調控非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的分子機制［J］.河北醫藥，2021，43（21）：3210-3214.

［4］ 王洪偉，王琳琳，張翼飛，等.結直腸癌患者血漿circPRMT5表達水平及臨床意義［J］.中華結直腸疾病電子雜志，2019，8（4）：390-394.

［5］ 謝津璧，郭潤生，王善娟，等.環狀蛋白質精氨酸甲基轉移酶5在結直腸癌細胞增殖、遷移中的作用和機制［J］.中華消化雜志，2019，39（3）：173-180.

［6］ WANG Y，LI Y，HE H Y，et al.Circular RNA circ-PRMT5 facilitates non-small cell lung cancer proliferation through upregulating EZH2 via"sponging miR-377/382/498［J］.Gene，2019，720：144099.

［7］ CHEN X，CHEN R X，WEI W S，et al.PRMT5 circular RNA promotes metastasis of urothelial carcinoma of the bladder through sponging miR-30c to induce epithelial-mesenchymal transition［J］.Clinical Cancer Research，2018，24（24）： 6319-6330.

［8］ 陳照亮，劉紅，楊會利，等.微小核糖核酸592調控神經膠質瘤細胞株U251細胞凋亡［J］.中國神經精神疾病雜志，2017，43（4）：234-238.

［9］ FELLENBERG J，LEHNER B，SAEHR H，et al.Tumor suppressor function of miR-127-3p and miR-376a-3p in osteosarcoma cells［J］.Cancers，2019，11（12）： 2019.

［10］ CHEN L，JING S Y，LIU N，et al.miR-376a-3p alleviates the development of glioma through negatively regulating KLF15［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2020，24（22）：11666-11674.

［11］ XUE C，CHENG Y，WU J Y，et al.Circular RNA circPRMT5 accelerates proliferation and invasion of papillary thyroid cancer through regulation of miR-30c/E2F3 axis［J］.Cancer Management and Research，2020，12：3285-3291.

［12］ DU W B，LI D，GUO X M，et al.Circ-PRMT5 promotes gastric cancer progression by sponging miR-145 and miR-1304 to upregulate MYC［J］.Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2019，47（1）：4120-4130.

［13］ YANG B R，DU K，YANG C H，et al.CircPRMT5 circular RNA promotes proliferation of colorectal cancer through sponging miR-377 to induce E2F3 expression［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2020，24（6）：3431-3437.

［14］ DING Z H，GUO L，DENG Z M，et al.Circ-PRMT5 enhances the proliferation，migration and glycolysis of hepatoma cells by targeting miR-188-5p/HK2 axis［J］.Annals of Hepatology，2020，19（3）：269-279.

［15］ WANG Y H，JIANG F，XIONG Y，et al.LncRNA TTN-AS1 sponges miR-376a-3p to promote colorectal cancer progression via upregulating KLF15［J］.Life Sciences，2020，244：116936.

（收稿日期：2023-05-01）

（本文編輯"王麗）