刺五加內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces amritsarensis 13-85的次級代謝產(chǎn)物研究

摘要：目的 研究刺五加內(nèi)生鏈霉菌（Streptomyces amritsarensis）13-85的次級代謝產(chǎn)物。方法 采用大孔吸附色譜、葡聚糖凝膠柱色譜、半制備高效液相等方法分離純化菌株13-85的次級代謝產(chǎn)物，結(jié)合質(zhì)譜和核磁共振波譜等方法確定化合物的結(jié)構(gòu)；最后采用倍比稀釋法評價化合物抗菌活性。結(jié)果 從鏈霉菌Streptomyces amritsarensis 13-85中分離得到2個新化合物和14個已知化合物，分別為：溶藻鏈霉苷A（1）、溶藻鏈霉苷B（2）、omicsynin A4（3）、環(huán)（L-脯?L-酪）（4）、環(huán)（D-脯?L-酪）（5）、環(huán)（L-酪?L-酪）（6）、環(huán)（L-酪?L-纈）（7）、N?乙酰色氨酸（8）、環(huán)（甘?L-色）（9）、環(huán)（L-色?L-丙）（10）、（1S，3S）?1?甲基?1，2，3，4?四氫?咔啉?3?羧酸（11）、（1R，3S）?1?甲基?1，2，3，4?四氫?咔啉?3?羧酸（12）、環(huán)（L-異亮?L-脯）（13）、環(huán)（L-異亮?D-脯）（14）、環(huán)（L-亮?L-脯）（15）、環(huán)（L-亮?D-脯）（16）。其中化合物3對枯草芽孢桿菌的MIC為50 μg/mL。結(jié)論 從Streptomyces amritsarensis 13-85中發(fā)現(xiàn)了兩個新的鼠李糖酯苷，該研究結(jié)果豐富了鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型。

關(guān)鍵詞：鼠李糖苷；溶藻鏈霉菌；刺五加；內(nèi)生放線菌

中圖分類號：R978 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Secondary metabolites of endophytic Streptomyces amritsarensis 13-85

from Acanthopanax senticosus

Liang Guodong1， Su Bingjie2， Chen Yuchuan2， Liu Aihua1， Wang Bin1， Qian Ye1， Si Shuyi2，

Chen Minghua2， and Yuan Lijie1

（1 Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Disease， Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases， School of Basic Medical Science， North China University of Science and Technology， Tangshan 063210; 2 Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050）

Abstract Objective To study the secondary metabolites of endophytic Streptomyces amritsarensis 13-85 isolated from Acanthopanax senticosus. Methods The secondary metabolites of strains 13-85 were isolated by separation techniques such as column chromatography over macroporous adsorbent resin， Sephadex LH-20， and semi-preparative high-performance liquid chromatography. Their structures were determined by MS and NMR analysis. Finally， the antibacterial activity of the compounds was evaluated by a double dilution method. Results Two new rhamnosides， strepamrisides A and B （1 and 2）， together with fourteen known compounds， omicsynin A4 （3）， cyclo（L-Pro-L-Tyr） （4）， cyclo（D-Pro-L-Tyr） （5）， cyclo（L-Tyr-L-Tyr） （6）， cyclo（L-Tyr-L-Val） （7）， N-acetyl-L-tryptophan （8）， cyclo（Gly-L-Trp） （9）， cyclo（L-Ala-L-Tyr） （10）， （1S，3S）-1-methyl-1，2，3，4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid （11）， （1R，3S）-1-methyl-1，2，3，4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid （12）， cyclo（L-Ile-L-Pro） （13）， cyclo（L-Ile-D-Pro） （14）， cyclo（L-Leu-L-Pro） （15）， and cyclo（L-Leu-D-Pro） （16） were isolated from the strain. Compound 3 displayed weak antibacterial activity against Bacillus subtilis with a MIC value of 50 μg/mL. Conclusion Two new rhamnosides were discovered in Streptomyces sp. 13-85， which expanded the structural diversity of secondary metabolites of Streptomyces sp.

Key words Rhamnosides; Streptomyces amritsarensis; Acanthopanax senticosus; Endophytic actinomycetes

植物內(nèi)生放線菌是一類長期定殖于宿主植物組織內(nèi)部，但不會對宿主造成病害的微生物[1]。內(nèi)生菌與植物的互利共生使微生物從宿主中獲取其所需的營養(yǎng)物質(zhì)，也可以產(chǎn)生一些活性次級代謝產(chǎn)物防御外界環(huán)境菌蟲等對宿主的侵害[2]。相較于土壤來源放線菌，內(nèi)生放線菌在次級代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)及藥物開發(fā)方面還屬于一個尚待充分挖掘的資源。目前從植物內(nèi)生放線菌中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物類型包括聚酮類、肽類、生物堿類和萜類等，但數(shù)目不超過200個[3-4]。其中比較有代表性的聚酮類化合物tripmycin A能顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖[5]；borrelidin具有顯著的抗植物病原菌作用[6]；環(huán)八肽類化合物zelkovamycin E具有較強(qiáng)的抑制H1N1病毒作用[7]；吡咯類生物堿endostemonines A-J對棉蚜（Aphis gossypii）表現(xiàn)出很強(qiáng)的致死活性[8]；而倍半萜類化合物kandenol E是一類很重要的抗生素[9]。

刺五加（Acanthopanax senticosus）屬于五加科五加屬植物，主要分布在中國東北、華北地區(qū)，具有抗菌、抗衰老、抗炎、抗疲勞及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[10]。目前對刺五加內(nèi)生放線菌的化學(xué)研究報道較少，僅有2篇文獻(xiàn)報道。研究者分別從刺五加內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces tauricus和S. melanosporofaciens中分離得到顯著抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）活性的糖基化蒽醌類化合物cinerubin B[11]和具有細(xì)胞毒性的elaiophylin類化合物[12]。為了從刺五加內(nèi)生放線菌中獲得更多的次級代謝產(chǎn)物，本文從野生刺五加根部分離到一株溶藻鏈霉菌S. amritsarensis 13-85，綜合利用各種色譜、波譜學(xué)方法對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，從中得到2個新的鼠李糖酯苷類化合物（1和2）、1個擬四肽類化合物以及二酮哌嗪類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

儀器：超凈工作臺（BCM-1000A，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI R-300，瑞士Buchi公司）；冷卻水循環(huán)裝置（EYELA CA-1116A，上海愛朗儀器有限公司）；循環(huán)水式真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；超聲清洗機(jī)（KQ-800B，昆山市超聲儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（GR60DA，美國ZEALWAY公司）；冷凍干燥機(jī)（德國Chris公司）；恒溫?fù)u床（ZWY-3723B，上海智誠分析儀器制造有限公司）；低溫高速離心機(jī)（20PR-52D，Hitachi公司）；高效液相色譜儀（Shimadzu LC-20AT，日本Shimadzu公司）；制備型液相色譜（LC-52，北京賽譜銳思科技有限公司）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MSD-Trap/SL，美國Agilent公司）；核磁共振（NMR）波譜儀（Bruker AVIIIHD-600 MHz，美國Bruker公司）；高分辨質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS Qtof，上海沃特世科技有限公司）。

分離填料及試劑：大孔吸附樹脂HP-20（日本三菱化學(xué)）；微孔吸附樹脂MCI gel（CHP20/P120，日本三菱化學(xué)）；十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（ODS

50 μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）；反相C18分析型色譜柱（Capcell Pak AQ， 5 μm， 4.6 mm×150 mm，

日本大阪曹達(dá)（Osaka Soda）株式會社）；反相C18半制備型色譜柱（Capcell Pak AQ， 5 μm， 10 mm× 250 mm; Capcell Pak MGII， 5 μm， 10 mm× 250 mm; Capcell Pak ADME， 5 μm， 10 mm × 250 mm; Capcell Pak PFP， 5 μm， 10 mm× 250 mm，日本大阪曹達(dá)（Osaka Soda）株式會社）；分析純乙醇、甲醇等（北京通廣精細(xì)化工廠）；HPLC級乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆浑状?、DMSO（德國Merck公司）；實驗用蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

培養(yǎng)基：YM培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；LB肉湯培養(yǎng)基L8291（北京索萊寶科技有限公司）；A2液體培養(yǎng)基（葡萄糖10 g/L、可溶性淀粉30 g/L、

棉籽粉20 g/L、酵母膏3 g/L、（NH4）2SO4 3 g/L、MgSO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 1 g/L、CaCO3 5 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.2，121℃，0.1 MPA高壓滅菌

15 min）。

1.1.2 發(fā)酵菌株和檢定菌

發(fā)酵菌株13-85分離自野生刺五加植物根部。檢定菌為大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae ATCC700603）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis ATCC6633），以上菌株均25%甘油-80 ℃保藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥技術(shù)研究所，國家新藥（微生物）篩選實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌株分子學(xué)測定

將菌株在YM固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)接至YM固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，挑取生長好的菌落，冷凍放置，后續(xù)送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA測序。對測序結(jié)果進(jìn)行拼接校對，并將拼接后的序列結(jié)果提交至Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，下載相似菌株16S rRNA序列，采用鄰接法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹；并將16S rRNA序列上傳至NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 菌株發(fā)酵

配制種子液：將復(fù)蘇活化后的菌株Streptomyces amritsarensis 13-85挑取單菌落至含有20 mL YM液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，共50瓶，180 r/min，

28 ℃培養(yǎng)3 d。

擴(kuò)大發(fā)酵：配制20 L A2液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至2 L錐形瓶中，每瓶400 mL，高壓滅菌（121℃，

15 min），以5% （20 mL）的接菌量接種，180 r/min，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d。

1.2.3 分離純化

發(fā)酵5 d后，將發(fā)酵液進(jìn)行離心，6000 r/min，

30 min，取上清液。上清液經(jīng)大孔樹脂吸附柱層析，依次用去離子水（A）和20% EtOH （B）、50% EtOH（C）及100% EtOH（D）進(jìn)行梯度洗脫，得到4個組分（A～D）。

組分C（15.68 g）與MCI樹脂按質(zhì)量比1：1.5拌樣，干法上樣進(jìn)行MCI柱層析。用10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%及100% EtOH梯度洗脫，利用HPLC分析，將相似流出組分合并，減壓濃縮得到22個亞組分（S1～S22）。S17（420 mg）采用反相ODS柱層析，用10%、15%、25%、30%、35%、40%、50%及100%EtOH梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析合并，減壓濃縮得到3個組分（S17-1～S17-3）。S17-2（108 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell Pak AQ 10 mm×250 mm；

27% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；3 mL/min）制備得到化合物3（11.12 mg）。

S3和S4（共540 mg）經(jīng)HPLC分析相似，合并后采用反相ODS柱層析，濕法上樣，用0、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%及100% EtOH梯度洗脫，流出液經(jīng)HPLC分析，相似組分合并，減壓濃縮得到6個組分（S3-1～S3-6）。S3-5（60.5 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell PaK AQ 10 mm × 250 mm；7%ACN-含0.1%TFA的H2O等度洗脫；3mL/min）制備得到化合物4（12.6 mg）。S3-2（20.7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell PaK MGII 10 mm × 250 mm；10% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；3 mL/min）制備得到化合物8（0.50 mg）。

S5（550 mg）先采用反相ODS柱層析，濕法上樣，用5%、7.5%、10%、12.5%、15%及100% EtOH梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析合并，減壓濃縮為3個組分（S5-1～S5-3）；然后S5-2（408 mg）采用Sephadex LH-20柱層析，MeOH/H2O（V：V 1：1）等度洗脫，經(jīng)HPLC分析合并，減壓濃縮得到14個組分（S5-2-1～S5-2-14）。S5-2-13（11.2 mg）經(jīng)高效液相色譜（Capcell PaK MGII 10 mm×

250 mm；14% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；

1.5 mL/min）制備得到化合物6（4.10 mg）和9（1.85 mg）。

S6（550 mg）組分使用Sephadex LH-20凝膠柱層析，MeOH/H2O（V：V， 1：1）等度洗脫，經(jīng)HPLC分析后合并，得到17個組分（S6-1～S6-17）。S6-3（62.5 mg）經(jīng)高效液相色譜（Capcell PaK PFP 10 mm × 250 mm；16% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；1.5 mL/min）制備得到化合物1（1.16 mg）、2（0.73 mg）、13（13.7 mg）

和15（17.16 mg）。S6-2（36.8 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell PaK PFP 10 mm × 250 mm；11% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；3 mL/min）制備得到化合物14（1.05 mg）和16（2.23 mg）。S6-7（7.3 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell PaK MGII 10 mm×

250 mm；11% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；

3 mL/min）制備得到化合物7（1.65 mg）、11（1.33 mg）和12

（0.77 mg）。S6-10（7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（Capcell PaK PFP 10 mm×250 mm；9% ACN-含0.1% TFA的H2O等度洗脫；2.5 mL/min）制備得到化合物10

（0.38 mg）。

1.2.4 衍生化方法確定糖構(gòu)型[13-14]

取0.2 mg化合物加入到3 mL濃度為2 mol/L的HCl中，90 ℃下水解5 h，真空干燥；然后向水解產(chǎn)物中加入2 mg 2，3?萘二胺、1 mg I2與3 mL AcOH，室溫攪拌5 h；真空干燥后溶解于1 mL MeOH中，通過HPLC?MS分析（Chiral CD?Ph 5 μm 10 mm×

250 mm；10%～80% ACN-含0.1% FA的H2O梯度洗脫，流速：0.5 mL/min），提取離子m/z 303，比較衍生化的標(biāo)準(zhǔn)品與化合物水解產(chǎn)物的出峰時間，確定其構(gòu)型；其中標(biāo)準(zhǔn)品2，3?萘二胺衍生物的保留時間為：D-鼠李糖18.99 min，L-鼠李糖20.55 min；化合物水解產(chǎn)物衍生物保留時間為20.55 min。

1.2.5 抗菌活性檢測

將制備得到的化合物溶于DMSO，配制成10 mg/mL

的溶液。參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[15]，采用倍比稀釋法測定各化合物抗菌活性。在無菌的96孔板中，加入200 μL培養(yǎng)體系：LB液體培養(yǎng)基、化合物、待測菌株（濃度：105 CFU/mL），使得化合物終濃度為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1和0.05 μg/mL。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果，無菌生長的孔中，化合物的濃度即為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC），同時設(shè)多黏菌素作為抗革蘭陰性菌陽性對照，設(shè)萬古霉素作為抗革蘭陽性菌對照。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

通過對菌株13-85的16S rRNA基因測序，EzbioCloud數(shù)據(jù)庫比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株13-85與Streptomyces amritsarensis MTCC11845T（MQUR01000179）相似度為100%，初步鑒定該菌株為溶藻鏈霉菌Streptomyces amritsarensis 13-85（Genbank No. PP291839）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定及波譜數(shù)據(jù)

化合物1為白色無定形粉末，HR-ESI-MS m/z 247.1195 [M+H]+提示其分子組成為C11H18O6 （calcd for C11H19O6， 247.1176），不飽和度為3。化合物1的1H NMR譜（600 MHz， DMSO-d6）顯示1個三取代的雙鍵[δH 6.84 （1H， q， J=7.2 Hz， H-3）]、2個甲基[δH 1.77 （3H， br s， H3-5）， 1.80 （3H， d， J=7.2 Hz， H3-4）]的氫共振信號，以及1個α-鼠李糖基的特征氫信號[δH 5.82 （1H， d， J=2.4 Hz， H-1'）， 1.13 （3H， d， J=6.6 Hz， H3-6'）， 3.64 （1H， dd， J=2.4， 2.4 Hz， H-2'）， 3.51 （1H， overlapped， H-3'）， 3.27 （1H， dd， J=9.0， 9.0 Hz， H-4'）， 3.52 （1H， overlapped， H-5'）]。在13C NMR和DEPT譜中，一共顯示11個碳共振信號，除了顯示出上述單元對應(yīng)的碳信號外，還有1個羰基碳的共振信號δC 165.2。為了確定化合物1的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了2D NMR實驗，通過HSQC譜解析，對化合物1中的1H以及對應(yīng)的13C共振信號進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬（表1）?；衔?的1H-1H COSY譜除顯示α-鼠李糖基的氫依次偶合相關(guān)的交叉峰外，還顯示出H-3/H3-4的鄰位質(zhì)子偶合自旋體系。HMBC譜顯示出H-3與C-1、C-4和C-5，以及H3-5與C-1、C-2和C-3的異核遠(yuǎn)程相關(guān)信號，說明化合物1含有一個2-甲基丁-2-烯酸單元。同時，H-1'與C-1的異核遠(yuǎn)程相關(guān)信號說明α-鼠李糖氧基與2-甲基丁-2-烯酸脫水形成酯苷，化合物1平面結(jié)構(gòu)被確定。在ROESY譜中，H-3與H-5的交叉峰（圖2）表明三取代雙鍵為順式（Z），苷元片段為當(dāng)歸酸（angelic acid）?；衔?用2 mol/L鹽酸水解，經(jīng)aldose-naphthimidazole衍生化[13-14]，與D-和L-鼠李糖對照品的衍生物進(jìn)行手性HPLC-MS比較分析，確定1中的鼠李糖單元具有L-構(gòu)型（圖4）。因此，化合物1被確定為angelic acid 1-O-α-L-rhamnopyranosyl（圖1），命名為溶藻鏈霉苷A（strepamriside A）。

化合物2為白色無定形粉末，HR-ESI-MS m/z 461.1655 [M+H]+提示其分子組成為C20H28O12 （calcd for C20H29O12， 461.1654），不飽和度為7。化合物2的1H NMR譜 （600 MHz， DMSO-d6）顯示1個1，3，4-三取代苯環(huán)[δH 7.59 （1H， dd， J=8.4， 1.8 Hz， H-6）， 7.24 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5）， 7.49 （1H， d， J=1.8 Hz， H-2）]；1個甲氧基[δH 3.84 （3H， s， OMe-3）的氫共振信號，以及2個α-鼠李糖基端基氫[δH 5.99 （1H， d， J=1.8 Hz， H-1'）和5.46 （1H， d， J=1.8 Hz， H-1''）]及其特征甲基氫[δH 1.08 （3H， d， J=6.0 Hz， H3-6''）和1.15 （3H， d， J=6.6 Hz， H3-6'）]的共振信號。在13C NMR和DEPT譜中，一共顯示20個碳共振信號，除了氫譜所述單元外，還有一個酯羰基碳信號δC 163.7。為了確定化合物2的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了2D NMR實驗。HMBC譜中顯示H-2與C-1、C-3和C-4，H-5與C-1、C-3和C-4，H-6與C-1、C-2和C-4，H-2和H-6均與C-7，以及甲氧基質(zhì)子與C-3的異核遠(yuǎn)程相關(guān)信號，表明化合物2含有一個3-甲氧基-4-羥基苯甲酸單元。此外，1H-1H COSY譜顯示出2個α-鼠李糖基氫偶合相關(guān)的交叉峰，即H-1'/H-2'/H-3'/H-4'/H-5'/H3-6'和H-1''/H-2''/H-3''/H-4''/H-5''/H3-6''質(zhì)子偶合系統(tǒng)；同時HMBC譜顯示H-1'與C-7，以及H-1''與C-4的異核遠(yuǎn)程相關(guān)信號，表明一個α-鼠李糖基連接在C-4位，而另一個α-鼠李糖基連接在C-7位形成酯苷。同樣用化合物1中α-鼠李糖基構(gòu)型確定的方法，化合物2中的鼠李糖基也為L型（圖4）。因此，化合物2的結(jié)構(gòu)被確定，并命名為溶藻鏈霉苷B（strepamriside B）。

化合物3為白色無定形粉末，HR-ESI-MS"m/z 598.3390 [M+H]+，分子式為C30H43N7O6。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 7.87 （1H， t， J=9.4 Hz， NH-17）， 7.57 （1H， br s， NH-28）， 7.49 （1H， br s， NH-22）， 7.40 （1H， br s， H-19）， 7.20 （10H， m， Phe-Ar， PheOH-Ar）， 6.62 （1H， d， J=8.0 Hz， NH-12）， 6.43 （1H， d， J=8.0 Hz， NH-10）， 4.31 （1H， dd， J=7.7， 5.1 Hz， H-13）， 4.13 （1H， q， J=6.9 Hz， H-23）， 3.99 （1H， t， J=8.0 Hz， H-3）， 3.88 （1H， m， H-29）， 3.30 （1H， dd， J=10.7， 5.0 Hz， H-30a）， 3.23 （1H， dd， J=10.6， 6.3 Hz， H-30b）， 3.07 （1H， m， H-16a）， 2.98 （1H， dd， J=13.8， 5.3 Hz， H-4b）， 2.84 （2H， m， H-4a， 37a）， 2.62 （1H， dd， J=13.7， 8.3 Hz， H-37b）， 1.87 （1H， m， H-24）， 1.60 （1H， m， H-14a）， 1.42 （3H， m， H-14b，15a，15b）， 0.72 （3H， d， J=6.7 Hz， H-25）， 0.68 （3H， d， J=6.9 Hz， H-26）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 173.6 （C-2）， 172.0 （C-21）， 170.5 （C-27）， 158.2 （C-18）， 158.0 （C-11）， 139.2 （C-5）， 137.4 （C-31）， 129.3 （C-7，9）， 129.2 （C-33，35）， 128.2 （C-6，10）， 128.1 （C-32，36）， 126.46 （C-8）， 125.90 （C-34）， 62.4 （C-37）， 58.4 （C-23）， 54.1 （C-3）， 52.5 （C-13）， 52.4 （C-29）， 40.4 （C-16）， 37.5 （C-4）， 36.4 （C-30）， 30.6 （C-24）， 29.9 （C-14）， 25.0 （C-15）， 19.2 （C-25）， 18.6 （C-26）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為omicsynin A4。

化合物4為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 259.1 [M-H]?，分子式為C14H16N2O3。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 7.85 （s， 1H， -NH）， 7.04 （2H， d， J=8.4 Hz， H-13，15）， 6.63 （2H， d， J=8.5 Hz， H-12，16）， 4.24 （1H， t， J=5.0 Hz， H-3）， 4.04 （1H， t， J=8.4 Hz， H-6）， 3.40 （2H， dt， J=11.7， 8.1 Hz， H-9a）， 3.25 （1H， dt， J=12.1， 6.4 Hz， H-9b）， 2.92 （2H， dd， J=5.4 Hz， H-10）， 2.00 （1H， m， H-7）， 1.71 （2H， m， H-8）， 1.39 （1H， m， H-7）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 168.9 （C-2）， 165.1 （C-5）， 155.9 （C-14）， 130.8 （C-13，15）， 127.0 （C-11）， 114.8 （C-12，16）， 58.4 （C-3）， 56.0 （C-6）， 44.6 （C-9）， 34.7 （C-10）， 27.8 （C-7）， 21.9 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-脯-L-酪）。

化合物5為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 259.1 [M-H]?，分子式為C14H16N2O3。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 8.13 （1H， d， J=3.8 Hz， -NH）， 6.89 （2H， d， J=8.3 Hz， H-12，16）， 6.65 （2H， d， J=8.3 Hz， H-13，15）， 3.93 （1H， m， overlapped， H-3）， 3.40 （1H， m， H-6）， 3.17 （1H， m， H-9a）， 2.92 （1H， m， H-9b）， 2.76 （1H， dd， J=13.8， 4.9 Hz， H-10a）， 2.70 （1H， dd， J=10.2， 6.3 Hz， H-10b）， 1.92 （1H， m， H-7a）， 1.78 （1H， m， H-7b）， 1.53 （2H， m， H-8）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 169.2 （C-2）， 165.8 （C-5）， 156.7 （C-14）， 131.4 （C-13，15）， 126.3 （C-11）， 115.6 （C-12，16）， 58.5 （C-6）， 57.8 （C-8）， 45.6 （C-9）， 38.0 （C-10）， 29.0 （C-7）， 21.7 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（D-脯-L-酪）。

化合物6為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 325.1 [M-H]?，分子式為C18H18N2O4。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 9.22 （2H， s， NH-1，4）， 7.77 （2H， s， OH-1'，1\"）， 6.83 （4H， d， J=8.5 Hz， H-2'，2\"，6'，6\"）， 6.67 （4H， d， J=8.5 Hz， H-3'，3\"，5'，5\"）， 3.85 （2H， s， H-3，6）， 2.52 （2H， d， J=4.8 Hz， H-7'a，7\"a）， 2.10 （2H， dd， J=13.7， 6.6 Hz， H-7'b，7\"b）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 166.3 （C-2，5）， 156.1 （C-1'，1\"）， 130.8 （C-3'，3\"，5'，5\"）， 126.6 （C-4'，4\"）， 115.1 （C-2'，2\"，6'，6\"）， 55.8 （C-3，6）， 40.1 （C-1'，1\"）， 38.8 （C-7'，7\"）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-酪-L-酪）。

化合物7為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 263.1 [M+H]+，分子式為C14H18N2O3。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 7.99 （1H， d， J=2.1 Hz， NH-4）， 7.87 （1H， d， J=2.2 Hz， NH-1）， 6.95 （2H， d， J=8.5 Hz， H-3’，5’）， 6.61 （2H， d， J=8.5 Hz， H-2’，6’）， 4.10 （1H， dt， J=4.8， 2.7 Hz， H-3）， 3.52 （1H， dt， J=3.8， 1.9 Hz， H-6）， 3.01 （1H， dd， J=13.7， 4.5 Hz， H-10a）， 2.76 （1H， dd， J=13.7， 4.9 Hz， H-10b）， 1.76 – 1.70 （1H， m， H-7）， 0.68 （3H， d， J=7.1 Hz， H-8）， 0.34 （3H， d， J=6.8 Hz， H-9）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 166.7 （C-5）， 166.4 （C-2）， 156.1 （C-4’）， 131.2 （2’，6’）， 126.3 （C-1’）， 114.7 （C-3’，5’）， 59.2 （C-6）， 55.3 （C-3）， 37.2 （C-10）， 31.1 （C-7）， 18.3 （C-8）， 16.4 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-酪-L-纈）。

化合物8為無色顆粒狀物，ESI-MS m/z 245.1 [M-H]?，分子式為C13H14N2O3。1H NMR （600 MHz， Methanol-d4） δ 7.56 （1H， d， J=7.9 Hz， H-5）， 7.32 （1H， d， J=8.2 Hz， H-8）， 7.09 （1H， s， H-2）， 7.08 （1H， td， J=8.1， 1.2 Hz， H-6）， 7.01 （1H， td， J=8.0， 1.0 Hz， H-7）， 4.72 （1H， dd， J=8.1， 5.1 Hz， H-11）， 3.34 （1H， dd， J=14.2， 5.1 Hz， H-10a）， 3.15 （1H， dd， J=14.7， 8.1 Hz， H-10b）， 1.90 （3H， s， H-15）；13C NMR （150 MHz， Methanol-d4） δ 175.7 （C-12）， 173.1 （C-14）， 138.1 （C-9）， 128.8 （C-4）， 124.3 （C-2）， 122.4 （C-7）， 119.8 （C-6）， 119.2 （C-5）， 112.3 （C-8）， 54.8 （C-11）， 28.5 （C-10）， 22.4 （C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為N-乙酰色氨酸。

化合物9為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 325.1 [M-H]?，分子式為C18H18N2O4。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 10.93 （1H， s， NH-1）， 8.10 （1H， s， NH-13）， 7.76 （1H， s， NH-16）， 7.54 （1H， d， J=7.9 Hz， H-4）， 7.33 （1H， d， J=8.1 Hz， H-7）， 7.04 （2H， t， J=7.6 Hz， H-6）， 6.95 （1H， t， J=7.4 Hz， H-5）， 4.02 （1H， brs， H-11）， 3.30 （1H， d， J=17.3 Hz， H-14a）， 3.24 （1H， dd， J=14.5， 4.7 Hz， H-10a）， 3.02 （1H， dd， J=14.6， 4.6 Hz， H-10b）， 2.78 （1H， d， J=17.2 Hz， H-14b）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 168.1 （C-12）， 165.8 （C-15）， 136.0 （C-8）， 127.5 （C-9）， 124.7 （C-2）， 121.0 （C-6）， 118.7 （C-4）， 118.5 （C-5）， 111.2 （C-7）， 108.4 （C-3）， 55.5， （C-11） 43.9 （C-14）， 29.2 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（甘-L-色）。

化合物10為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 258.2 [M+H]+，分子式為C14H15N3O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 10.88 （1H， s， NH-1）， 8.00 （1H， s， NH-12）， 7.90 （1H， s， NH-15）， 7.56 （1H， d， J=7.9 Hz， H-5）， 7.30 （1H， d， J=8.0 Hz， H-8）， 7.04 （1H， s， H-2）， 7.03 （1H， t， J=7.5 Hz， H-7）， 6.94 （1H， t， J=7.5 Hz， H-8）， 4.10 （1H， t， J=4.1 Hz， H-14）， 3.59 （1H， q， J=7.3 Hz， H-11）， 3.24 （1H， dd， J=14.4， 4.2 Hz， H-10a）， 3.01 （1H， dd， J=14.5， 4.6 Hz， H-10b）， 0.42 （3H， d， J=7.0 Hz， H-17）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 167.8 （C-13）， 166.8 （C-16）， 135.8 （C-9）， 127.8 （C-2）， 124.6 （C-4）， 120.8 （C-7）， 119.0 （C-6）， 118.4 （C-5）， 111.1 （C-8）， 108.5 （C-3）， 55.4 （C-14）， 49.8 （C-11）， 28.9 （C-10）， 19.5 （C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物環(huán)（L-色-L-丙）。

化合物11為棕色膠狀物，ESI-MS m/z 231.1 [M+H]+，分子式為C13H14N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 11.24 （1H， s， NH-9）， 7.50 （1H， d， J=7.8 Hz， H-5）， 7.37 （1H， d， J=8.1 Hz， H-8）， 7.13 （1H， t， J=7.6 Hz， H-7）， 7.03 （1H， t， J=7.4 Hz， H-6）， 4.73 （1H， d， J=7.1 Hz， H-3）， 4.43 （1H， d， J=6.8 Hz， H-1）， 3.33 （1H， m， overlapped， H-4a）， 2.98 （1H， m， overlapped， H-4b）， 1.68 （3H， d， J=6.9 Hz， H-10）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 170.6 （C-11）， 136.4 （C-8’）， 130.9 （C-9’）， 125.7 （C-4’）， 121.9 （C-7）， 119.3 （C-6）， 118.2 （C-5）， 111.5 （C-8）， 104.8 （C-4”）， 55.0 （C-3）， 49.5 （C-1）， 22.4 （C-4）， 16.5 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為（1S，3S）-1-甲基-1，2，3，4-四氫-咔啉-3-羧酸。

化合物12為棕色膠狀物，ESI-MS m/z 231.1 [M+H]+，分子式為C13H14N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 11.15 （1H， s， NH-9）， 7.49 （1H， d， J=7.9 Hz， H-5）， 7.36 （1H， d， J=8.1 Hz， H-8）， 7.12 （1H， t， J=7.6 Hz， H-7）， 7.03 （1H， t， J=7.5 Hz， H-6）， 4.78 （1H， d， J=7.0 Hz， H-1）， 3.45 （1H， m， overlapped， H-3）， 3.28 – 3.22 （1H， m， overlapped， H-4a）， 3.06 （1H， dd， J=15.9， 8.3 Hz， H-4b）， 1.64 （1H， d， J=6.8 Hz， H-10）；13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 170.3 （C-11）， 136.3 （C-8’）， 131.2 （C-9’）， 125.7 （C-4’）， 121.9 （C-7）， 119.1 （C-6）， 118.2 （C-5）， 111.4 （C-8）， 104.0 （C-4”）， 51.3 （C-3）， 47.2 （C-1）， 22.10 （C-4）， 18.0 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為（1R，3S）-1-甲基-1，2，3，4-四氫-咔啉-3-羧酸。

化合物13為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 209.1 [M-H]?，分子式為C11H18N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 7.94 （1H， s， -NH）， 4.10 （1H， t， J=7.0 Hz， H-6）， 3.94 （1H， m， H-3）， 3.40 （1H， dt， J=11.5， 8.0 Hz， H-9a）， 3.33 （1H， dt， J=11.7， 8.5 Hz， H-9b）， 2.13 （1H， m， H-7a）， 2.02 （1H， m， H-7b）， 1.83 （2H， m， H-8）， 1.78 （1H， m， H-10），1.33 （1H， m， H-11a）， 1.26 （1H， m， H-11b）， 0.97 （3H， d， J=7.1 Hz， H-13）， 0.82 （3H， t， J=7.4 Hz， H-12）; 13C NMR （150 MHz DMSO-d6） δ 170.2 （C-2）， 165.3 （C-5）， 59.3 （C-6）， 58.3 （C-3）， 44.7 （C-9）， 35.0 （C-10）， 28.0 （C-7）， 24.0 （C-8）， 22.1 （C-11）， 15.0 （C-13）， 12.3 （C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-異亮-L-脯）。

化合物14為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 209.1 [M-H]?，分子式為C11H18N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 8.32 （1H， s， -NH）， 4.12 （1H， t， J=8.1 Hz， H-6）， 3.45 （2H， m， overlapped， H-3，9a）， 2.14 （1H， m， H-7a）， 1.83 （2H， m， H-8）， 1.75 （2H， m， H-7b，10）， 1.50 （1H， m， H-11a）， 1.11 （1H， m， H-11b）， 0.88 （3H， d， J=6.9 Hz， H-13）， 0.84 （3H， m， H-12）; 13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 168.7 （C-2）， 164.9 （C-5）， 61.6 （C-3）， 57.7 （C-6）， 45.1 （C-9）， 38.8 （C-10）， 28.9 （C-7）， 24.6 （C-11）， 21.6 （C-8）， 15.3 （C-13）， 11.1 （C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-異亮-D-脯）。

化合物15為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 209.1 [M-H]?，分子式為C11H18N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 8.00 （1H， s， -NH）， 4.18 （1H， t， J=8.1 Hz， H-6）， 4.00 （1H， t， J=6.3 Hz， H-6）， 3.38 （1H， m， H-9a）， 3.33 （1H， m， H-9b）， 2.11 （1H， m， H-7a）， 1.91 （1H， m， overlapped， H-7b），1.88 （1H， m， overlapped， H-8a）， 1.83 （1H， m， overlapped， H-8b）， 1.80 （1H， m， overlapped， H-10a）， 1.76 （1H， m， overlapped， H-10），1.35b （1H， m， H-11）， 0.86 （6H， dd， J=6.6， 5.1 Hz， H-12，13）; 13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 170.4 （C-2）， 166.6 （C-5）， 58.5 （C-6）， 52.6 （C-3）， 44.9 （C-9）， 37.8 （C-10）， 27.5 （C-7）， 24.1 （C-11）， 22.8 （C-8）， 22.5 （C-13）， 21.9 （C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-亮?L-脯）。

化合物16為白色無定形粉末，ESI-MS m/z 209.1 [M-H]?，分子式為C11H18N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ 8.35 （1H， d， J=4.4 Hz， -NH）， 4.17 （1H， t， J=7.6 Hz， H-6）， 3.60 （1H， m， H-3）， 3.42 （1H， m， H-9a）， 3.32 （1H， m， H-9b）， 2.14 （1H， m， H-7a）， 1.85 （1H， m， H-7b）， 1.78 （2H， m， H-8）， 1.69 （1H， m， H-11）， 1.56 （1H， ddd， J=13.7， 9.6， 5.5 Hz， H-10a）， 1.43 （1H， ddd， J=13.7， 8.5， 5.4 Hz， H-10b）， 0.91 （3H， d， J=6.6 Hz， H-12）， 0.87 （3H， d， J=6.5 Hz， H-13）; 13C NMR （150 MHz， DMSO-d6） δ 168.9 （C-2）， 166.1 （C-5）， 57.4 （C-6）， 55.3 （C-3）， 45.1 （C-9）， 42.2 （C-10）， 28.5 （C-7）， 23.9 （C-11）， 22.9 （C-12）， 21.9 （C-8）， 21.6 （C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]中數(shù)據(jù)對照基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（L-亮-D-脯）。

2.3 化合物抗菌活性測定結(jié)果

化合物3對枯草芽胞桿菌有抗菌活性，MIC值為50 μg/mL；陽性對照萬古霉素對枯草芽胞桿菌的MIC值為0.5 μg/mL。其余化合物均未表現(xiàn)出抑制活性。

3 討論

本文對刺五加內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces amritsarensis 13-85的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了研究，分離鑒定了16個化合物，包括兩個新的鼠李糖苷類化合物（1和2）。鼠李糖苷類化合物在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)較少。Kang等[28]從白蟻來源的鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了10個異黃酮鼠李糖苷類化合物，但均無抗菌活性。

Rusman等[29]分離得到6個新的吩嗪鼠李糖苷類化合物solphenazines A～F，其中solphenazines A、B和F對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116具有較弱的抑制活性。Motohashi等[30]從鏈霉菌中獲得兩個蒽環(huán)類鼠李糖苷，未顯示出細(xì)胞毒性。Jang等[31]從Streptomyces sp. RK88-1441中獲得一個benadrostin類鼠李糖苷化合物RK-144171，以及3-indolylcarbonyl α-L-rhamnopyranoside和2-aminobenzoyl α-L-rhamnopyranoside，其中3-indolylcarbonyl α-L-rhamnopyranoside有一定的抗瘧原蟲活性。海洋來源鏈霉菌Streptomyces sp. ZZ446中含有一個罕見的二酮哌嗪鼠李糖苷maculosin-O-α-L-rhamnopyranoside，該化合物有一定抗菌作用，對MRSA、Escherichia coli和Candida albicans的MIC值分別為37.0、28.0和26.0 μg/mL[32]?；衔?為擬四肽omicsynin類化合物，本研究團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)該類化合物具有很強(qiáng)的抗冠狀病毒和抗流感病毒活性，N端的醛基是其關(guān)鍵藥效團(tuán)，也是其不穩(wěn)定基團(tuán)[16]，該類化合物還需完善分離方法才能獲得其較純的單體化合物。本文化合物3末端為苯丙氨醇單元，具有較弱的HIV蛋白酶抑制作用，IC50值為17.8 μmol/L[33]。本文首次發(fā)現(xiàn)其具有較弱的抗枯草芽胞桿菌作用。此外，本研究從菌株中還分離得到了10個環(huán)二肽結(jié)構(gòu)，該類化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化與降血糖、改善神經(jīng)系統(tǒng)等作用[34]。研究顯示，化合物4和10具有抗腫瘤活性[34]；化合物13具有一定的抗MRSA活性，IC50為

6.5 mmol/L[35]；化合物15能夠抑制細(xì)菌生物膜形成[36]；

此外化合物5、13和15具有較好抗鰻弧菌活性，MIC分別為0.07、0.07和0.05 μg/mL[37-38]。因此，鏈霉菌

S. amritsarensis 13-85具有豐富的活性次級代謝產(chǎn)物，本研究僅對代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抗菌活性測試，后續(xù)應(yīng)該采用更多活性評價模型來充分挖掘該菌株的活性分子。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2024-02-07

基金項目：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助（No. 2021-I2M-1-028）；國家自然科學(xué)基金（No. 81302675）；河北省自然科學(xué)基金 （No. H2021209027）

作者簡介：梁國棟，男，生于1998年，在讀碩士研究生，研究方向為放線菌的次級代謝產(chǎn)物分離，E-mail： lgd20201120@163.com

*通信作者：陳明華，E-mail： chenminghua@imb.pumc.edu.cn；袁麗杰，E-mail： yuanlijie1970@163.com