基于斑馬魚模型的多肽LLTRAGL抗異煙肼致肝損傷活性評價及其機制研究

摘要：目的 構建異煙肼（Isoniazid， INH）致肝損傷斑馬魚模型，對多肽LLTRAGL保肝作用及其機制進行初步研究。方法 采用肝臟特異表達綠色熒光的轉基因斑馬魚Tg（L-FABP：EGFP）作為實驗動物模型，設置空白對照組（斑馬魚培養用水）、INH致肝損傷組（INH 6 mmol/L）、陽性藥組（INH 6 mmol/L+GSH 10 μmol/L）和多肽處理組（INH 6 mmol/L+LLTRAGL 25、50、100 μg/mL）。藥物處理48 h后，檢測斑馬肝臟面積和肝臟熒光強度；通過TUNAL染色，觀察斑馬魚肝臟區域細胞凋亡情況。運用轉錄組學、分子對接及RT-qPCR技術測定多肽對差異表達基因的調控情況。結果 與INH致肝損傷組相比，陽性對照組和多肽處理組斑馬魚肝臟面積和肝臟熒光強度均顯著恢復，且肝臟細胞凋亡顯著減少。轉錄組學分析表明GO富集分析涉及包括與細胞凋亡相關在內的64個條目，差異表達基因的KEGG富集分析均涉及MAPK信號通路。分子對接結果表明多肽LLTRAGL與MAPK信號通路上核心靶點EGFRa、FGFR1、PDGFRa、PDGFRb和INSR具有良好對接能。RT-qPCR結果表明，與INH致肝損傷組相比，多肽LLTRAGL顯著下調egfra、fgfr1、map2k2、map3k1、map3k7和mapk12a的mRNA表達水平，以及下調凋亡相關基因caspase1、caspase3、caspase8和caspase9的mRNA表達水平。結論 本研究通過建立斑馬魚INH致肝損傷模型，探究了多肽LLTRAGL的保肝作用并初步闡明其作用機制，其保肝作用可能為通過參與調控MAPK信號通路，降低凋亡因子表達，從而緩解肝臟損傷，為INH致肝損傷的預防與治療提供了新思路。

關鍵詞：多肽LLTRAGL；斑馬魚；保肝；作用機制

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Activity evaluation and mechanistic investigation of the peptide LLTRAGL against isoniazid-induced hepatotoxicity based on the zebrafish model

Zhong Yayun1，2，3， Li Bin2，3， Cao Yongna2，3， Zhang Shanshan2，3， Zhang Yun2，3， and Liu Li1

（1 School of Pharmacy， Changzhou University， Changzhou 213164; 2 Biology Institute， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Scienced）， Ji'nan 250103; 3 Engineering Research Center of Zebrafish Models for Human Diseases

and Drug Screening of Shandong Province， Ji'nan 250103）

Abstract Objective The zebrafish model of isoniazid-induced liver injury （INH-ILI） was established to examine the preliminary investigation of the hepatoprotective effects and underlying mechanisms of the LLTRAGL peptide. Methods Utilizing transgenic zebrafish with liver-specific green fluorescent labeling Tg （L-FABP： EGFP） as the experimental animal model， a blank control group （zebrafish was cultured with water）， an INH-ILI model group （INH 6 mmol/L）， a positive drug group （INH 6 mmol/L+GSH 10 μmol/L）， and a drug administration group （INH 6 mmol/L +LLTRAGL 25， 50， and 100 μmol/L） were established. The hepatic morphology of zebrafish was observed， and both liver area and fluorescence intensity were measured at 48 hours post-fertilization. Cellular apoptosis in the hepatic region of zebrafish through TUNEL staining was also observed. RNA-sequencing， molecular docking， and RT-qPCR techniques to assess the regulatory status of differentially expressed genes were utilized. Results Compared to the INH-ILI model group， both the positive drug group and the drug administration group exhibited significant restoration in zebrafish liver area and fluorescence intensity， accompanied by a notable reduction in hepatic cellular apoptosis. The GO enrichment analysis encompassed 64 terms， including cell death， which was related to apoptosis. KEGG enrichment analysis of DEGs consistently involves the MAPK signaling pathway. The LLTRAGL peptide exhibited favorable binding affinity with the core targets in the MAPK signaling pathway. The molecular docking results indicated that the peptide LLTRAGL had good binding ability with the core targets EGFRa， FGFR1， PDGFRa， PDGFRb， and INSR in the MAPK signaling pathway. The RT-qPCR results indicate that， compared to the INH-ILI model group， the peptide LLTRAGL significantly down-regulated the mRNA expression levels of egfra， fgfr1， map2k2， map3k1， map3k7， and mapk12a， as well as the mRNA expression levels of apoptosis-related factors caspase1， caspase3， caspase8， and caspase9. Conclusion This study investigated the hepatoprotective effects of the LLTRAGL peptide in a zebrafish model of isoniazid-induced liver injury. The mechanism might involve the regulation of the MAPK signaling pathway， reducing the expression of apoptotic factors， and thereby alleviating liver damage. This provided a novel perspective for the prevention and treatment of isoniazid-induced liver injury.

Key words LLTRAGL; Zebrafish; Apoptosis; Mechanism of action

我國是全球結核病負擔第三高的國家，結核病治療的基本方案通常包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等抗結核藥物[1]。其中，異煙肼（isoniazid， INH）作為世界衛生組織推薦的首選抗結核藥，具有療效穩定、有效的特點，但肝損傷是其主要不良反應，占藥物性肝損傷發生率的2.51%[2]。在臨床上，異煙肼單獨或聯合使用可引起肝損傷，導致肝功能衰竭，占急性肝功能衰竭病例的5%～ 22%[3]。大約10%～20%使用INH治療患者的血清谷丙轉氨酶（ALT）水平升高，出現肝炎樣癥狀；大約1%～3%的患者出現嚴重肝損傷，甚至肝功能衰竭[4]。

異煙肼致肝損傷（isoniazid-induced liver injury， INH-ILI）的發生使不可耐受INH-ILI的患者被迫反復停藥，而反復中斷治療導致出現多重耐藥結核桿菌，使抗結核的臨床治療難度增加，對健康安全構成極大威脅[5]。目前，現代醫學在INH-ILI的治療方面并無特異性藥物，大多采用休息、加強營養、補充維生素和對癥治療等方式[6]，因此尋找新的治療靶點和有效肝保護劑成為抗結核治療亟需解決的問題。

海洋生物活性物質已經成為新型藥物的重要資源，因其新穎的化學結構、獨特的生理功效以及相對較高的安全性，具有深入研究的價值[7]。課題組前期研究發現，來源于Neptunea arthritica cumingii（NAC）海螺內臟提取物中的多種短肽具有抗炎、抗氧化等較強的生物活性[8-9]，其中海螺源活性多肽LLTRAGL由Leu-Leu-Thr-Arg-Ala-Gly-Leu組成，分子量為0.74 kDa[10]。該低分子量肽（lt;3 kDa）序列的N端和C端都具有亮氨酸（Leu）以及二肽Gly-Leu結構，可靠的分子結構為發揮生物活性奠定基礎[11-12]。

非必需氨基酸甘氨酸（Gly）主要參與多種生物途徑生成必需分子包括谷胱甘肽（GSH）、嘌呤、血紅素和肌酸，具有降糖/降脂、保肝以及抗炎作用[13]。補充甘氨酸可以促進GSH合成、調節脂肪酸氧化以及減輕肝臟脂肪變性等方式，緩解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發展[14-16]。必需氨基酸亮氨酸可改善胰島素抵抗和脂肪變性，已被探索用于2型糖尿病、肥胖以及NAFLD等的治療[17-18]。Rom等[15]研究表明三肽DT-109（Gly-Gly-L-Leu）可以通過刺激肝臟線粒體脂肪酸β-氧化和GSH合成，減輕NAFLD小鼠模型癥狀。此外，Zhang等[15，19]發現三肽Diapin（Gly-Gly-Leu）強效降糖作用超過游離的甘氨酸、亮氨酸或其二肽組合。因此，推測多肽LLTRAGL具有抗肝損傷活性，并通過斑馬魚模型探究其對異煙肼致肝損傷的影響。

斑馬魚的基因與人類基因的相似度高于87%，在肝臟、腎臟、心血管以及免疫系統等方面都與人類對應的組織具有極其相似的發育機制與特點，結構和功能高度保守[20]。斑馬魚受精后48 h（48 hours post fertilization， 48 hpf）肝臟形態初步形成，在60 hpf-72 hpf肝臟迅速生長直至達到合適比例大小[21]。由于斑馬魚透明、發育可視化，借助活體成像技術，可廣泛應用于保肝藥物的篩選[22]。本實驗采用INH誘導斑馬魚肝臟損傷模型，研究多肽LLTRAGL的保肝活性及作用機制，為治療INH-ILI提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑

多肽LLTRAGL（Leu-Leu-Thr-Arg-Ala-Gly-Leu，純度為95.29%）由合肥賽曼諾生物科技有限公司合成，化學結構式如圖1。異煙肼（isoniazid， INH）（美國Sigma公司）；還原性谷胱甘肽（glutathione， GSH）[默克化工技術（上海）有限公司]；實驗用水為斑馬魚培養用水（5.0 mmol/L NaCl， 0.17 mmol/L KCl， 0.4 mmol/L"CaCl2， 0.16 mmol/L MgSO4）。精密稱取異煙肼粉末219.4 mg，使用蒸餾水進行溶解并定容至2 mL，配制為INH 800 mmol/L儲存液。取INH 800 mmol/L儲存液45 μL，使用斑馬魚培養用水稀釋并定容至6 mL，配制為INH 6 mmol/L工作液。多肽LLTRAGL 10 mg溶解于500 μL蒸餾水，使用斑馬魚培養用水稀釋為所需實驗濃度。

RNA提取試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶試劑盒購于蘇州格瑞思生物科技有限公司。

1.2 儀器

斑馬魚養殖飼養設備（北京愛生科技公司），光照培養箱SPX-280B-G（中國上?；巧锟萍加邢薰荆?，體視熒光顯微鏡SZX16（日本Olympus公司），蔡司熒光顯微鏡AXIO-V16（德國Carl Zeiss光學有限股份公司），梯度PCR儀c1000 Touch（美國Bio-Rad公司），實時熒光定量PCR儀Light Cycler@96（瑞士Roche有限公司）等。

2 方法

2.1 斑馬魚的獲取

本實驗采用綠色熒光標記肝臟的轉基因斑馬魚Tg（L-FABP： EGFP）由山東省科學院生物研究所藥物篩選平臺提供，雌雄斑馬魚在28 ℃、光照14 h/黑暗10 h標準條件下分開飼養。實驗前1 d選取健康性成熟斑馬魚，按照雌：雄為1：1或1：2的數量比放入交配缸內，隔板分開。次日抽板交配，11時至12時收集受精卵，對受精卵進行清洗并消毒后，移入含有0.02%亞甲基藍的斑馬魚培養用水中，28 ℃下控光培養。

2.2 藥物處理與實驗分組

參考課題組前期工作基礎[23]考察了不同濃度INH暴露24、48和72 h對斑馬魚死亡率、畸形率、整體形態和肝臟形態等的影響。其中，在48 hpe，6 mmol/L INH顯著減小斑馬魚肝臟面積和熒光強度顯著減小，提示導致斑馬魚肝損傷，并且6 mmol/LINH暴露24和48 h均未出現死亡。因此，本實驗中以INH 6 mmol/L暴露48 h作為INH致肝損傷組，進行多肽LLTRAGL肝保護的活性評價。根據前期預實驗結果，多肽LLTRAGL 25、50、100、200、300和400 μg/mL劑量下，單獨處理48 hpe均對斑馬魚整體形態和肝臟形態無顯著影響。因此，本實驗中以安全濃度范圍內多肽LLTRAGL 25、50和100 μg/mL為實驗組濃度，進行肝保護的活性評價。

在顯微鏡下隨機挑取發育正常的72 hpf（72 hours post fertilization， hpf）斑馬魚，移入24孔板中，每孔10尾，分別設置空白對照組（斑馬魚培養用水）、INH致肝損傷組（INH 6 mmol/L）、陽性藥組（INH 6 mmol/L+GSH 10 μmol/L）和多肽處理組（INH 6 mmol/L+LLTRAGL 25、50和100 μg/mL）。各實驗組設置3個復孔，每24 h更換藥液。藥物處理后24和48 h（24/48 hours post exposure， 24/48 hpe），在熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚肝臟形態，并統計肝臟面積和肝臟熒光強度。

2.3 斑馬魚肝臟相關酶活性的測定

選取48 hpe各實驗組斑馬魚，每組收集60尾，稱重，按照重量（mg）：體積（μL）為1：7的比例加入提取液，進行破碎勻漿。12000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。使用BCA法測定蛋白質濃度，谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）的測定和分析按說明書方法進行。

2.4 斑馬魚肝臟TUNEL染色

選取48 hpe各實驗組斑馬魚，使用4%多聚甲醛固定，放置在4 ℃冰箱過夜。次日，使用PBS（1×）清洗3次后，30% H2O2和甲醇以1：10的比例稀釋處理15 min；0.3% TritonX-100和檸檬酸鈉抗原修復液（1×）以1：300的比例混勻，放入4 ℃冰箱孵育10 min。將Tdt酶和熒光標記液以1：10的比例混合，每組斑馬魚置于200 μL離心管中，各組加入50 μL的熒光標記混合液，放入37 ℃培養箱中避光孵育1.5 h。

在熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚肝臟區域細胞凋亡情況。

2.5 轉錄組學分析（RNA-seq）

選取48 hpe空白對照組（斑馬魚培養用水）、INH致肝損傷組（INH 6 mmol/L）和多肽處理組（INH"6 mmol/L+LLTRAGL 50 μg/mL）的斑馬魚進行破碎，提取mRNA。使用各組檢測合格的mRNA樣品進行建庫，由青島歐易生物科技有限公司進行轉錄組測序。將表達量變化倍數絕對值大于2倍以上（∣Fold Change∣gt;2），且q值小于0.05（qlt;0.05）的基因作為顯著差異表達基因（DEGs）。對DEGs進行基因本體（GO）分析和京都基因及基因組百科全書（KEGG）富集分析。

2.6 蛋白互作分析和分子對接

對轉錄組學得出核心通路的DEGs運用STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）進行蛋白相互作用（PPI）分析，選擇來源“Danio Rerio”，置信區間為0.700。使用Cytoscape（v.3.10.0）軟件可視化蛋白互作網絡圖（PPI）。此外，使用最大團中心性（MCC）方法篩選高度連接的核心靶點[24-25]。MCC方法在預測PPI網絡核心靶點方面表現出卓越的精確度[26]。

分子對接以核心靶點為受體，多肽LLTRAGL為配體進行對接。從PDB蛋白質結構數據庫（RCSB PDB，https：//www.rcsb.org/）中獲取核心靶點的結構，運用Discovery Stuido 2019，以蛋白晶體結構中原配體定義對接口袋為活性部位中心，進行半柔性對接[27]，設置半徑為20 ?，刪除晶體結構中的水分子和原配體并加氫，使用CDOCKER模塊執行對接任務?；贑HARMm的對接算法CDOCER可以精確預測蛋白-配體相互作用關系，利用CDOCKER能量評分函數來評價配體與受體的結合能力[28-29]。計算原始配體的初始構象和對接構象的均方根偏差（root-mean-sguare deviation， RMSD），RMSD lt; 20 nm表明對接得到的構象能夠再現配體與受體的結合模式，反映了對接模型的可靠性[30]。

2.7 實時熒光定量PCR

選取48 hpe各實驗組斑馬魚，勻漿后使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2試劑盒提取RNA。將各組樣本逆轉錄得到cDNA，使用Light Cycler@96測定凋亡相關基因的相對表達量。實時定量PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性30 s 1個循環；變性 95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1個循環。以β-actin為內參對結果進行相對定量分析。內參基因β-actin以及目的基因的PCR引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成、純化，并經質量檢測。引物序列見表1。

2.8 數據統計

運用軟件GraphPad Prism 9對實驗結果以單因素方差分析法（One-way ANOVA）進行組間比較分析，所有數據結果均以平均值±標準誤（x±s）表示。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

3 結果

3.1 多肽LLTRAGL對斑馬魚肝臟形態的影響

如圖2A～C所示，在24和48 hpe，與空白對照組相比，INH致肝損傷組斑馬魚肝臟面積以及熒光強度顯著減少，INH導致斑馬魚肝臟損傷。與INH致肝損傷組（INH 6 mmol/L）相比，陽性藥組（INH"6 mmol/L+GSH 10 μmol/L）、多肽處理組（INH

6 mmol/L+LLTRAGL 25、50和100 μg/mL）斑馬魚肝臟面積以及熒光強度顯著恢復。本研究考察了多肽不同處理時間對肝臟保護情況，發現多肽處理48 h肝保護效果更為顯著，因此選擇48 hpe進行后續實驗。此外，如圖2D～E所示，多肽LLTRAGL單獨處理48 h對斑馬魚肝臟形態和面積無影響。

3.2 多肽LLTRAGL對INH致肝損傷斑馬魚肝臟ALT、AST活性的影響

如圖3A所示，與空白對照組相比，INH致肝損傷組ALT活性顯著上升，與INH致肝損傷組相比，多肽LLTRAGL顯著降低ALT活性。如圖3B所示，與空白對照組相比，INH致肝損傷組AST活性無統計學差異。

3.3 多肽LLTRAGL對斑馬魚肝臟細胞凋亡的影響

如圖4A～B所示，在48 hpe，與空白對照組相比，INH致肝損傷組斑馬魚肝臟凋亡細胞數量顯著上升。與INH致肝損傷組相比，25、50和100 μg/mL多肽處理組凋亡細胞均顯著減少。

3.4 多肽LLTRAGL抗INH致肝損傷活性的RNA-seq分析

如圖5B所示，INH致肝損傷組與對照組（INH vs. CON）DEGs總計5889個，其中上調基因3485個，下調基因2404個；多肽處理組與INH致肝損傷組（LLTRAGL vs. INH）DEGs總計197個，其中上調基因78個，下調基因119個。

如圖6所示，將多肽處理組與INH致肝損傷組DEGs進行GO富集分析，共得到64個GO條目。GO富集分析共獲得23個生物過程（BP），20個細胞組分（CC），21個分子功能（MF）。由GO分析結果可知，BP主要涉及細胞死亡（cell killing）、應激（response to stimulus）、生物過程的調控（regulation of biological process）、信號（signaling）等；CC主要涉及細胞連接（cell junction）、大分子復合體（macromolecular complex）、細胞膜空腔（membrane-enclose lumen）等；MF主要涉及酶調節器活性（enzyme regulator activity）、受體調節器活性（receptor regulator activity）、翻譯調節器活性（translation regulator activity）等。以上GO功能注釋如細胞死亡[31]、應激[32]、大分子復合體[33-34]、細胞膜空腔[35]以及酶調節器活性[36]等，與細胞凋亡相關。

如圖7所示，將INH致肝損傷組與對照組DEGs和多肽處理組與INH致肝損傷組DEGs進行KEGG富集分析，得到重要信號通路包括MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）和凋亡（apoptosis）等。

根據RNA-seq結果，推測調控MAPK信號通路誘導凋亡在多肽LLTRAGL發揮抗INH致肝損傷的作用機制中發揮重要作用。

3.5 多肽LLTRAGL抗INH致肝損傷活性的PPI網絡分析和分子對接

選取KEGG富集分析得到的MAPK信號通路DEGs，用于構建PPI網絡并經MCC算法篩選出核心靶點。如圖8A～B所示，PPI網絡分析得出66個靶點相互作用關系，篩選得出核心靶點分別為：EGFRa、FGFR1、PDGFRa、PDGFRb和INSR。

進行分子對接前，核心靶點蛋白原始晶體中的配體構象與對接后的配體構象重疊，且RMSD值均小于20 nm，表明本分子對接的方法和參數合理。將核心靶點與多肽LLTRAGL進行分子對接，CDOCKER對接能量分數越大提示對接體系結合性越好，受體與配體之間形成極性與非極性鍵，有助于結合構象穩定[37]。如圖8C～G和表2所示，多肽LLTRAGL為配體對接核心靶點EGFRa 、FGFR1、PDGFRa、PDGFRb和INSR具有良好的結合能力。其中，與配體對接結合能最大的核心靶點為EGFRa （8A27），形成氫鍵作用的氨基酸殘基有THR790、MET793、LYS745、CYS775、ASP855和LEU788；形成疏水鍵作用的氨基酸殘基有LEU777、LEU788、MET766、TYR869和LEU718。與配體對接結合能第二大的核心靶點為FGFR1 （3DPK），形成氫鍵作用的氨基酸殘基有LEU588、ASP670、CYS666、ASP796、ARG801和ASP802；形成疏水鍵作用的氨基酸殘基有LEU588、MET637和ARG782。后續實驗選擇EGFRa和FGFR1作為核心靶點進行進一步驗證。

3.6 RT-qPCR驗證

為了進一步研究多肽LLTRAG抗INH致肝損傷活性的作用機制，采用RT-qPCR檢測各實驗組（n= 3）MAPK信號通路及凋亡相關基因egfra、fgfr1、map2k2、map3k1、map3k7、mapk12a、caspase1、caspase3、caspase8和caspase9在斑馬魚體內的mRNA表達水平。與空白對照組相比，INH致肝損傷組中egfra、fgfr1、map2k2、map3k1、map3k7、mapk12a、caspase1、caspase3、caspase8和caspase9的表達明顯上調。與INH致肝損傷組相比，多肽LLTRAGL多肽處理組中egfra、fgfr1、map2k2、map3k1、map3k7、mapk12a、caspase1、caspase3、caspase8和caspase9的表達明顯下調且具有統計學意義（圖9）。

結果顯示，經多肽LLTRAGL處理后，MAPK信號通路及凋亡相關基因在斑馬魚體內mRNA表達水平均有明顯變化，說明多肽LLTRAGL能夠緩解INH造成的基因異常表達。

4 討論

有研究報道顯示海洋來源多肽在抗炎、免疫調節、抗氧化、抗高血壓等方面有顯著的活性，并且無明顯副作用[7，38]。此外，海洋來源多肽可在胃腸道中水解，釋放出結構類似于內源性肽的肽序列，能夠與相同的受體相互作用并發揮生物學效應[39]。由疏水性氨基酸殘基（如Leu、Asp、Glu、Lys）組成的肽具有極強的抗氧化作用[40]。有相關研究報道，海洋來源的鱈魚皮膠原蛋白肽（CSCP）和牡蠣肽（OP）通過增強體內抗氧化能力和抑制炎癥反應，對小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用[41-42]。鑒于INH是臨床治療結核病的關鍵藥物，INH肝損傷一旦發生不僅影響抗結核治療的效果還可能增加患者肝衰竭的風險，因此急需尋求對INH-ILI具有特異性作用的保肝藥物。本實驗發現具有抗INH致肝損傷保肝活性的多肽LLTRAGL，并初步探討其保肝作用機制，為INH致肝損傷的預防與治療提供了新思路。在本實驗中，與空白對照組相比，INH致肝損傷組斑馬魚肝臟熒光強度和面積顯著減小，ALT活性顯著上升，提示6 mmol/L INH造成斑馬魚肝臟損傷。與INH致肝損傷組相比，多肽LLTRAGL處理組斑馬魚肝臟熒光強度及面積恢復，顯著降低ALT活性，減少肝臟區域細胞凋亡數目。為深入探討多肽保肝作用機制，通過轉錄組學檢測空白對照組、INH致肝損傷組和多肽處理組的差異表達基因，發現其參與調控凋亡及MAPK信號通路。進一步運用分子對接和RT-qPCR技術驗證，多肽LLTRAGL與核心靶點EGFRa、FGFR1具有良好對接結合能，并且能改善由INH造成的MAPK信號通路（egfra、fgfr1、map2k2、map3k1、map3k7和mapk12a）和凋亡相關基因（caspase1、caspase3、caspase8和caspase9）的異常表達。

成纖維細胞生長因子受體（FGFR）屬于受體酪氨酸激酶（RTK）家族成員之一，在與配體結合后促進細胞內酪氨酸殘基的二聚化和激活、導致橋接蛋白的募集和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、磷脂酶C γ（PLCγ）以及信號轉導和轉錄激活因子（STAT）激活4個關鍵信號級聯反應[43]。表皮生長因子受體（EGFR）同屬RTK家族，除了依賴配體的激活外，如膽汁酸、高滲透壓和分化群分子（CD95）等物質通過氧化應激以一種與配體無關的方式激活EGFR，主要與肝損傷有關[44-45]。

活化的EGFR與細胞死亡受體結合，引起其磷酸化、寡聚化，并穩定死亡誘導信號復合物，導致細胞凋亡，這種肝細胞的凋亡性死亡可以被EGFR抑制劑所抑制[45]。Sommerfeld等[46]研究表明，疏水性膽汁酸導致NADPH氧化酶驅動的ROS生成，在靜止狀態下的大鼠肝星狀細胞（HSC）中Yes介導的EGFR激活，且Jun氨基末端激酶（JNK）信號同時發揮作用，增殖信號轉變為凋亡信號。EGFR系統在急性和慢性肝病中都發揮著重要作用，后者是肝細胞癌（HCC）發展的前體階段，在應激或急性肝損傷時，EGFR信號可以防止細胞凋亡和壞死[47]。Bhushan等[48]研究發現在原代人類肝細胞中，對乙酰氨基酚（APAP）處理后誘導EGFR活化，且毒性標志物升高；在APAP誘導的肝損傷小鼠模型上，表皮生長因子受體抑制劑（EGFRi）卡奈替尼治療，可有效抑制EGFR激活并顯著減輕APAP引起的肝損傷。Fuchs等[49]研究發現EGFRi厄洛替尼可能具有保護肝細胞效應，在預防纖維化和肝硬化的發展發揮著重要作用。近年來研究表明，INH誘導肝損傷的早期發病機制涉及膽汁酸在肝細胞中蓄積[50]。在本實驗對轉錄組學、PPI網絡及分子對接的分析中發現，多肽抗INH致肝損傷活性參與調控MAPK信號通路，并且多肽與核心靶點EGFRa、FGFR1具有良好對接結合能。因此，推測多肽LLTRAGL作用于EGFRa和FGFR1，進而參與調控MAPK信號通路，改善INH致肝損傷情況。

MAPK家族由細胞外信號相關激酶（ERK1/2）、JNK、p38-MAPK和ERK5組成，與細胞的生長、增殖和應激等多種重要的生理/病理過程有關，且MAPK信號通路與藥物性肝損傷密切相關[51-52]。Li等[53]

研究結果表明，咖啡通過抑制ERK、JNK和p38的磷酸化表達可改善2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹啉（IQ）誘導斑馬魚肝臟損傷的病理狀態和肝功能，減輕內質網應激，減少肝細胞凋亡，提示咖啡可通過抑制MAPK信號通路改善細胞凋亡，從而緩解IQ誘導的肝損傷。此外，研究表明細胞凋亡是INH致肝損傷的重要驅動因素，也是組織損傷的指標之一[54]。凋亡的觸發主要有兩條基本途徑：死亡受體途徑和線粒體途徑，而這兩條途徑的下游則是caspase-3、caspase-8和caspase-9的激活[52，55]。在本實驗研究的MAPK信號通路和凋亡相關基因表達量分析中發現，與空白對照組相比，INH致肝損傷組造成斑馬魚map2k2、map3k1、map3k7和mapk12a表達量升高；同時，INH導致caspase3、caspase8和caspase9表達量增加，表明INH激活MAPK信號通路誘導細胞凋亡。與INH致肝損傷組相比，多肽LLTRAGL處理后，map2k2、map3k1、map3k7、mapk12a、caspase3、caspase8和caspase9表達量顯著下調。因此，本研究推測多肽LLTRAG通過抑制MAPK信號通路激活，減輕斑馬魚肝臟細胞凋亡，從而發揮抗INH致肝損傷活性。

本實驗旨在探究海螺源生物活性多肽LLTRAGL的抗INH致肝損傷活性及其作用機制。結果發現，多肽LLTRAGL可能作用于核心靶點EGFRa、FGFR1并調控MAPK信號通路，從而減少肝臟細胞凋亡，緩解INH誘導的肝臟損傷。本研究表明多肽LLTRAGL具有抗INH致肝損傷活性，為INH致肝損傷的預防與治療提供了新思路，但其作用機制仍需更深入地研究。

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收稿日期：2023-12-08

基金項目：國家重點研發計劃項目（No. 2022YFC2804600）；泰山學者工程資助項目（No. tsqn202211204）；濟南市“新高校20條”資助項目（No. 2021GXRC047）；2023年江蘇省研究生實踐創新計劃項目（No. SJCX23_1457）

作者簡介：鐘雅韻，女，生于1998年，在讀碩士研究生，研究方向：基于斑馬魚模型的藥物活性篩選與安全性評價。

E-mail： amelia_zhong@163.com

*通信作者：張云，E-mail： xiaohan_0818@163.com；柳麗，E-mail： liulily@cczu.edu.cn