海南省腹瀉患者艱難梭菌感染狀況調查

摘要：目的 了解海南地區腹瀉患者中艱難梭菌感染的分子流行病學特征和耐藥性特征，為有效防控艱難梭菌感染的潛在暴發流行提供科學依據。方法 對2021—2022年在海南地區4家醫院中收集腹瀉患者的糞便樣本進行RT-PCR檢測艱難梭菌，并進行厭氧培養分離艱難梭菌，對所有分離株使用PCR法檢測毒素基因及MLST分型，采用E-test條法進行藥物敏感性檢測。結果 共收集205份樣本，其中核酸陽性率為10.73%（22/205），共分離17株艱難梭菌。在所有分離株中，有1株為非產毒艱難梭菌，16株為產毒株（tcdA/B+）。MLST共發現15個ST型別，其中ST3（clade 1）、ST5（clade 3）各2株，其余ST型均各一株，并發現一株新ST型別。藥敏結果表明，分離艱難梭菌對克林霉素（58.8%）、紅霉素（47.1%）、莫西沙星（23.5%）以及利福平（11.8%）呈現不同程度耐藥。此外，所有分離菌株均對萬古霉素、甲硝唑、氯霉素、美羅培南和四環素敏感。結論 海南省腹瀉患者中艱難梭菌的感染多為產毒株，分子分型具有高度的離散特征，優勢克隆群不明顯，但clade 3群菌株分離率高于既往其他地區報道，應加強開展艱難梭菌的持續監測。

關鍵詞：艱難梭菌；艱難梭菌感染；腹瀉；耐藥性；多位點序列分型

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

The investigation of" Clostridioides difficile infection in patients with diarrhea in Hainan Province

Xu Telong1， Zhang Yalin2 ， Bai Lulu1， Li Liefei2，" Jiang Yajun1，3， Wang Shaoling2， Zhang Wenzhu1，

Li Ying1， Wang Rui2， Zhang Bike1， Lu Jinxing1， Wu Yuan1， and Yu Xiaojie2

（1 National Institute for Communicable Disease Control and Prevention， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206; 2 Hainan Center for Disease Control and Prevention， Haikou 570203; 3 Chinese Center for Disease

Control and Prevention， Beijing 102206）

Abstract Objective To understand the molecular epidemiology and drug resistance characteristics of" Clostridioides difficile infection in patients with diarrhea in Hainan， and to provide a scientific basis for the effective prevention and control of potential outbreaks and epidemics of" Clostridioides difficile infection. Methods The fecal samples of 205 diarrhea patients collected from four hospitals in Hainan from 2021 to 2022 were subjected to the RT-PCR method to detect Clostridioides difficile and anaerobic culture to isolate Clostridioides difficile; all the isolates were tested for toxin genes and MLST typing by PCR， and drug susceptibility was tested by the E-test strip method. Results The nucleic acid positivity rate was 10.73% （22/205） out of 205 samples， and a total of 17 Clostridioides difficile strains were isolated. Among all the isolates， one was non-toxigenic Clostridioides difficile and 16 were toxigenic strains （tcdA/B+）. A total of 15 ST-types were found in the MLST， among which there were two strains each of ST3 （clade 1） and ST5 （clade 3）， and the rest of the ST-types were one each， and one new ST-type strain was found. The drug sensitivity results showed that the isolated Clostridioides difficile strains were resistant to clindamycin （58.8%）， erythromycin （47.1%）， moxifloxacin （23.5%） and rifampicin （11.8%） to different degrees. In addition， all isolates were sensitive to vancomycin， metronidazole， chloramphenicol， meropenem， and tetracycline. Conclusion The infections of Clostridioides difficile in diarrhea patients in Hainan Province were mostly toxin-producing strains， with highly discrete molecular typing characteristics， and the dominant clonal groups were not obvious， but the isolation rate of clade 3 group strains was higher than that previously reported in other regions， which should be strengthened to carry out the continuous monitoring of" Clostridioides difficile.

Key words Clostridioides difficile; Clostridioides difficile infection; Diarrhea; Drug resistance; Multilocus sequence typing

艱難梭菌（Clostridioides difficile，CD）是一種革蘭陽性、嚴格厭氧的產芽胞桿菌，其病原體廣泛存在于自然環境中，并可通過糞口途徑傳播[1]。艱難梭菌感染（Clostridioides difficile infection， CDI）可引起發熱、腹痛和嚴重腹瀉，甚至可以導致假膜性結腸炎、暴發性結腸炎和中毒性巨結腸，是院內腹瀉最常見的原因，據報道住院人群的患病率高出非住院人群數倍[2]。隨著廣譜抗菌藥的大量使用，艱難梭菌在腸道相關感染性疾病中被發現的次數不斷增加，直至2021年，北美CDI的發病率已達每10萬人110.2例，歐洲疾病預防控制中心2022年發布的報告顯示CDI發病率已達每萬患者日3.48例[3-4]。目前，CDI已成為最重要的醫院感染的疾病之一，并作為一種極其緊迫的公共衛生事件，對各醫療、療養機構產生著廣泛影響[1，5]。

艱難梭菌的主要毒力因子包括腸毒素A和細胞毒素B，分別由位于致病性位點（PaLoc）的tcdA和tcdB基因編碼，還有一些菌株也能夠產生二元毒素（CDT），由cdtA和cdtB基因編碼，但其在疾病發展中的作用仍不確定[6-8]。多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）是一種研究不同菌株細菌分子多樣性的分子分型方法，目前艱難梭菌的clade進化支被分為6個進化支，分別為clade 1～5和clade CI，后者為高分化不產毒菌株[9-10]。目前艱難梭菌已對多種抗生素耐藥，特別是對紅霉素、克林霉素和氟喹諾酮類 [11]。調查了解艱難梭菌的產毒情況、分子特征和耐藥特征等可以為有效防控艱難梭菌感染的潛在暴發流行提供科學依據。本研究是我國海南地區首次對腹瀉患者中艱難梭菌感染情況進行調查，旨在了解本地區艱難梭菌的感染定植情況、分子流行病學特征及耐藥性特征等。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2021—2022年海南省4所醫院的腹瀉患者糞便標本共205例。腹瀉定義為24 h內排便次數3次以上，且伴有糞便性狀異常[12]。

1.2 材料與儀器

1.2.1 實驗材料

CCFA瓊脂、BHI瓊脂（英國Oxoid公司），脫纖維羊血（北京萊貝塞斯公司），ddH2O（北京天根生化科技有限公司），糞便基因組DNA提取盒（北京天根生化科技有限公司），溶菌酶（德國默克Sigma-Aldrich公司），PCR premix Taq酶（北京寶日醫生物技術有限公司），E-test藥敏條（意大利利飛馳公司），無水乙醇（北京市通廣精細化工），卵黃液（青島海博生物）。

實驗涉及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司進行。

1.2.2 實驗儀器

恒溫培養箱（德國Memmert公司），厭氧培養罐及系統（荷蘭MART公司），溫控高速離心機（德國Eppendorf公司），離心機（德國Sigma公司），PCR儀（德國Senso Quest Labcycler公司），超凈臺與生物安全柜、冰箱（含超低溫冰箱）（青島海爾公司），移液器（德國Eppendorf公司），移液槍頭（美國Axygen公司），恒溫水浴鍋（德國Julabo公司），恒溫金屬浴以及RT-PCR分析儀均（日本Bioer公司）。

1.3 軟件及網站

統計學分析使用R（4.3.3）進行，計數資料采用χ2檢驗，雙側檢驗水準α=0.05， 以Plt;0.05為差異有統計學意義，MLST分析和鑒定使用PubMLST.org數據庫進行[13]，進化樹由MEGA11繪制并使用EvolView V2進行美化，進化樹比對株來自PubMLST和Genbank（表1）。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣本核酸檢測

將糞便樣本置于溶菌酶中處理30～60 min后，使用糞便DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用stcdb-f、stcdb-r、stcdb-p作為引物進行RT-PCR[12]，引物序列見表1。PCR反應體系：總計25 μL，Premix EX TaqTM（pefect Real Time）12.5 μL，10 μmol/L上述引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，去離子水3.0 μL， PCR反應條件：采用兩步法PCR擴增標準程序：預變性95 ℃ 30 s 1個循環；PCR反應95 ℃ 3 s，50 ℃ 30 s，40個循環。以Ct≤33為陽性，Ct≥35為陰性，33lt;Ctlt;35為可疑陽性[12]。

1.4.2 分離培養與鑒定

將糞便樣本與無水乙醇等比混勻，室溫靜置30 min

以消除雜菌，將其均勻涂布于含5%～8%卵黃液和1支選擇性培養基的環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂（cycloserine cefoxitin fructose agar， CCFA）培養基上，37 ℃厭氧培養24～48 h，挑取可疑菌落（呈攤雞蛋樣菌落），接種于含有5%～8%脫纖維羊血的腦心浸液（BHI）瓊脂培養基上進行純化培養24 h，使用細菌DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用通用引物27F/1492R進行PCR擴增，測定其16S rDNA序列，并通過NCBI（blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi）數據庫進行比對，判斷是否為艱難梭菌[12]。

1.4.3 毒素基因檢測

核酸提取同“1.4.1”，使用tcdA、tcdB、cdtA和cdtB對應的引物進行RCR擴增，參照文獻[12]中方法進行檢測。引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系：50 μL中，Premix Ex TaqTM（2×）25 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各1 μL，DNA 模板3 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應條件：tcdA/B：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 2min，74 ℃ 40 s，35個循環；74 ℃

5 min延伸；cdtA/B：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃

1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳成像，判讀對應毒素基因是否為陽性。

1.4.4 MLST檢測

核酸提取同“1.4.1”，使用adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi這7對管家基因對應的引物進行PCR擴增[21]，引物序列見表3。PCR反應體系：反應體系（50 μL）：Premix Taq酶25 μL，ddH2O 20 μL，上/下游引物（25 pmol/μL）1/1 μL，DNA模板（20～80 ng/μL）3 μL。 PCR反應條件： PCR循環參數：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，35個循環；72 ℃ 5 min[12]。將擴增序列拼接后導入MLST功用數據庫（http： //pubmlst.org/ Clostridioides difficile）進行比對，獲得對應的ST分型和clade從屬；進化樹繪制及分析使用MEGA11軟件，導入由GenBank、PubMLST檢索所獲得的各ST型別對應的管家基因序列，序列及分型見表1，并基于TN93（Tamura Nei model）模型結合G+I（Gamma Distribution with invariant sites）算法繪制所獲菌株ST型別的最大似然進化樹，并進一步使用Evolview在線進化樹進行編輯。

1.4.5 藥敏實驗

藥敏實驗采用E-Test條法進行，挑取“1.4.1”步驟中純化的艱難梭菌于布氏肉湯中，調麥氏值為1，取100 μL均勻涂布于含1 μg/mL維生素K1、1 μg/mL氯化血紅素和5%脫纖維羊血的布氏培養基中，并貼好莫西沙星、紅霉素、克林霉素、甲硝唑、萬古霉素、利福平、氯霉素、羅紅霉素和四環素9種含對應抗生素的E-test條，置于厭氧箱中37 ℃，培養48 h，觀察其最小抑菌濃度。以艱難梭菌ATCC700057為質控菌株，結果判讀標準參照歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會（EUCAST 2017歐盟藥敏試驗標準）及美國臨床實驗室標準協會（2021 CLSI-M100）[12]。通過R語言pheatmap包繪制了耐藥性熱圖。

2 結果

2.1 基本情況

205例樣本中，4例詳細信息缺失，另外信息完整的201例中，男性124例（61.7%），女性77例（38.3%）；≤5歲年齡組33人（16.4%），6～18歲年齡組17人（8.46%），19～59歲年齡組107人（53.2%），≥60歲年齡組44人（21.94%）；門診100人，住院97人；黏液樣便20人（9.96%），水樣便122人（60.7%），糊狀便33人（16.4%），膿血便1人（0.54%），其他糞便形態人數合計25人（12.4%）。單因素分析結果顯示，僅糞便性狀對tcdB陽性有統計學意義（χ2=17.835，P=0.001329）（表4），其余因素均無統計學意義可能與樣本量過小有關（表4）。所有腹瀉樣本中22（10.73%）例艱難梭菌tcdB基因檢測為陽性，成功分離艱難梭菌17株，分離率為8.29%。

2.2 毒素基因檢測結果

在17株艱難梭菌分離株中，僅有1（5.88%）株為非產毒艱難梭菌（non-toxin Clostridioides difficile，NTCD），其余16（94.12%）株為產毒株（tcdA/B+），其中6（35.29%）株表達全部毒素基因（tcdA+tcdB+cdt+），5（29.41%）株同時表達tcdA和tcdB基因（tcdA+tcdB+cdt-），還有5（29.41%）株僅表達tcdA基因（tcdA+tcdB-cdt-），各毒素型占比如圖1所示。

2.3 MLST檢測結果

MLST共檢出15個ST型別，覆蓋了4個進化支（clade 1、clade 3、clade 4和clade 5），其中ST3（clade" 1）檢出2株為數量最多的型別。另外檢出2株ST5（clade 3），這種型別在國內罕見。還檢出1株新型別為ST1066，其毒素基因表現為tcdA+tcdB+cdt+。其余clade 1中ST4、ST42、ST99、ST302、ST26和ST110，clade 4中ST243、ST23、ST39、ST238和ST262，clade 5中ST415各一株（圖2）。

2.4 耐藥性檢測結果

藥敏結果（表5和圖3）表明，大多數分離株對克林霉素（58.8%）和紅霉素（47.1%）耐藥，還有23.5%和11.8%的分離株分別對莫西沙星和利福平耐藥（圖3a），所有分離菌株均對萬古霉素、甲硝唑、氯霉素、美羅培南和四環素敏感。檢出2株（11.8%）對全部藥物敏感的分離株為CD2021HI064/ST4、CD2021HI190/ST5。另外發現3株（17.6%）多重耐藥分離株（multidrug resistance，MDR）包括CD2021HI161/ST1066（紅霉素、莫西沙星、利福平）耐藥，CD2021HI174/ST3和CD2021HI180/ST3（均為克林霉素、紅霉素、莫西沙星）耐藥（圖3b）。

3 討論

在2021—2022年海南地區的205例腹瀉患者糞便樣本中，艱難梭菌毒素基因tcdB的檢出率為10.73%，略低于我國另外一項針對腹瀉人群艱難梭菌的調查結果，該報道指出產毒艱難梭菌核酸陽性比率約為14%，這可能與地區差異有關[14]。另外海南地區的產毒株（tcdA/B+）比例高達94.12%，明顯高于我國華東地區的一項報道50.18%[15]。還有一項來自國內某教學醫院的調查發現，該醫院分離株中tcdA+tcdB+cdt+僅占5.1%[16]，而在我們的研究中這一比例高達35.29%，這提示與其他地區相比，海南地區具有更高的產毒株分離率。既往研究認為導致臨床感染病例的艱難梭菌大部分同時產tcdA和tcdB毒素，或者僅產tcdB毒素，單產tcdA毒素的極少[6，11]，而本研究發現有25.9%的單產tcdA毒素（tcdA+tcdB-）的分離株出現，未發現單產tcdB（tcdA-tcdB+）毒素分離株。這表明海南地區艱難梭菌毒素譜的分布已經表現出與其他地區明顯不同的特點，提示需要對本地區的毒素譜進行持續監測。

雖然本次研究中大部分分離株屬于clade 1和clade 4，這與目前國內外研究趨勢一致，但本研究發現海南地區分子分型特征呈高度離散狀態，并無明顯優勢克隆群，這可能與海南地區旅游業較為發達，人口流動幅度較大有關。另外本研究中未分離到我國艱難梭菌的典型分子型別ST37和ST54[17-18]。還有研究認為ST81也是國內較為常見的clade 4群艱難梭菌菌株[20]，而在本研究中也未被發現。值得注意的是，clade 3群艱難梭菌在我國罕見，屬于高產毒株，我國最近關于clade 3（ST5）分離株的報道是2020年西南西區開展的一項調查，據報道，clade 3群艱難梭菌在我國的發現率僅為0.86%[17，19-20]。然而本研究發現并成功分離2株clade 3（ST5）。歐洲有研究表明，ST5（RT023）相較于RT078是一類更易發生血性腹瀉的高毒力分群[21]，并且存在較高的復發傾向。本研究分離出ST5的兩份糞便樣本均屬于膿血樣便，其中一份樣本的ST5毒株還引發了該患者的復發性難治性CDI（病例報道撰寫中），這與歐洲的描述相近，提示需要密切關注膿血樣便患者，并持續進行clade 3群的監測。另外，本研究中出現的新型別ST1066雖分化程度較高，但其毒素基因全陽性tcdA+tcdB+cdt+，這與高度分化但不產毒的Clade-CI具有一定的區別[9-10]，說明ST1066并不屬于Clade-CI，這值得引起我們的注意，需要對海南地區的艱難梭菌分子分型進行持續監測與檢測。

艱難梭菌的耐藥性也是流行病學監測中關注的重要內容，本研究中耐藥率前3名為克林霉素58.82%、紅霉素47.06%和莫西沙星23.53%，耐藥種類與目前國內外的趨勢相符，但與國內其他研究相比，耐藥率明顯較低。此前我國研究顯示克林霉素耐藥率為62%～79%，紅霉素耐藥率為菌株耐藥75%～87%[11，18]。本研究中利福平耐藥率僅為11.8%外，此外剩余5種抗菌藥在海南地區全部敏感。另外還發現3株（17.6%）為MDR，與其他研究相比，MDR比率明顯偏低。這表明海南地區與其他地區相比耐藥率較低，這可能與不同地區的抗生素處方不同有關。

5 結論

本研究所獲得海南地區艱難梭菌分離株中產毒株比率較高，分子特征呈高度離散性，耐藥性水平較全國艱難梭菌耐藥水平更低，另外，還有部分罕見型的高致病菌株的分離率較全國更高（ST5/clade 3）。本研究也存在一定的不足，僅有17株艱難梭菌在統計方面的準確性有所欠缺，但卻對海南地區艱難梭菌感染的流行特征進行了初步展示。近些年海南地區已成為中國最重要的自由貿易區之一，目前海南地區的艱難梭菌表現出“高比率產毒分離株”和“高比率罕見高致病性分離株”的特點，隨著人口流動性的進一步擴大以及國際交流頻繁，可能會有潛在的暴發風險，這需要引起我們的關注。因此，海南地區的艱難梭菌監測需要擴大監測范圍，并盡可能多地收集相關樣本以便對本地區的艱難梭菌狀況進行更進一步的詳細和準確的評估。

參 考 文 獻

Leffler D A， Lamont J T. Clostridium difficile infection[J]. N Engl J Med， 2015， 372（16）： 1539-1548.

Lessa F C， Mu Y， Bamberg W M， et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States[J]. N Engl J Med， 2015， 372（9）： 825-834.

European Centre for Disease Prevention and Control， Clostridioides（Clostridium） difficile infections-Annual Epidemiological Report for 2016-2017[EB/OL]. （2022-11-16） [2024-03-22]. https：//www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/clostridiodes-difficile-infections-annual-epidemiological-report-2016-2017.

U. S. Center for Disease Control and Prevention，2021 Annual Report for the Emerging Infections Program for" Clostridioides difficile Infection | Emerging Infections Program | HAI | CDC[EB/OL]. （2023-07-13） [2024-03-22] https：//www.cdc.gov/hai/eip/Annual-CDI-Report-2021.html.

Czepiel J， Dró?d? M， Pituch H， et al. Clostridium difficile infection： Review[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis Off Publ Eur Soc Clin Microbiol， 2019， 38（7）： 1211-1221.

Lin Q， Pollock N R， Banz A， et al. Toxin a-predominant pathogenic Clostridioides difficile： A novel clinical phenotype[J]. Clin Infect Dis off Publ Infect Dis Soc Am， 2020， 70（12）： 2628-2633.

Heinlen L， Ballard J D. Clostridium difficile infection[J]. Am J Med Sci， 2010， 340（3）： 247-252.

Voth D E， Ballard J D. Clostridium difficile toxins： Mechanism of action and role in disease[J]. Clin Microbiol Rev， 2005， 18（2）： 247-263.

Knight D R， Elliott B， Chang B J， et al. Diversity and evolution in the genome of Clostridium difficile[J]. Clin Microbiol Rev， 2015， 28（3）： 721-741.

Dingle K E， Elliott B， Robinson E， et al. Evolutionary history of the Clostridium difficile pathogenicity locus[J]. Genome Biol Evol， 2014， 6（1）： 36-52.

Gao Q， Wu S， Huang H H， et al. Toxin profiles， PCR ribotypes and resistance patterns of Clostridium difficile： A multicentre study in China， 2012-2013[J]. Int J Antimicrob Agents， 2016， 48（6）， 736-739.

中華預防醫學會. 艱難梭菌感染診斷（T/CPMA 008-2020）[J]. 中華流行病學雜志， 2021， 42（1）： 58-63.

Jolley K A， Bray J E， Maiden M C J. Open-access bacterial population genomics： BIGSdb software， the PubMLST.org website and their applications[J]. Wellcome Open Res， 2018， 3： 124.

羅雨欣， 韓菲， 張瑞苗， 等." 艱難梭菌感染的流行病學及危險因素[J]. 臨床薈萃， 2018， 33（5）： 369-372.

Yang Z， Huang Q， Qin Juan X， et al. Molecular epidemiology and risk factors of Clostridium difficile ST81 infection in a teaching hospital in eastern China[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2020， 10： 578098.

Cheng J W， Xiao M， Kudinha T， et al. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile isolates from a university teaching hospital in China[J]. Front Microbiol， 2016， 7： 1621.

Tang C， Cui L B， Xu Y Q ，et al. The incidence and drug resistance of Clostridium difficile infection in China's mainland： A systematic review and meta-analysis[J]. Sci Rep" 2016， 6： 37865.

Liu X S， Li W G， Zhang W Z， et al. Molecular characterization of Clostridium difficile isolates in China from 2010 to 2015[J]. Front Microbiol， 2018， 9： 845.

Qin J， Dai Y， Ma X， et al. Nosocomial transmission of Clostridium difficile genotype ST81 in a general teaching hospital in China traced by whole genome sequencing[J]. Sci Rep， 2017， 7（1）： 9627.

Dai W， Yang T， Yan L et al. Characteristics of Clostridium difficile isolates and the burden of hospital-acquired Clostridium difficile infection in a tertiary teaching hospital in Chongqing， Southwest China[J]. BMC Infect Dis， 2020， 20（1）： 277.

Shaw H A， Preston M D， Vendrik K E W， et al. The recent emergence of a highly related virulent Clostridium difficile clade with unique characteristics[J] Clin Microbiol Infect off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect Dis， 2020， 26（4）： 492-498.

收稿日期：2024-04-15

作者簡介：徐特龍，男，生于1999年，在讀碩士研究生，主要研究方向為艱難梭菌相關，E-mail： 18522420276@163.com

*通信作者，E-mail： wuyuan@icdc.cn