喹諾酮類耐藥腸球菌Ⅱ型拓撲異構酶突變和外排泵表達

摘要：目的 探究喹諾酮類耐藥腸球菌Ⅱ型拓撲異構酶突變和外排泵基因表達發生率，并與喹諾酮類藥物左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）的耐藥相關性。方法 收集2022年7月—2023年6月臨床分離的67株屎腸球菌與17株糞腸球菌。用瓊脂稀釋法測定腸球菌對LVX的最低抑菌濃度，并用PCR擴增外排泵基因emeA、efrA、efmA和Ⅱ型拓撲異構酶gyrA與parC基因，并對gyrA和parC基因進行測序分析。結果 屎腸球菌LVX耐藥率為89.6%（60/67），有61株發生gyrA突變，62株發生parC突變。糞腸球菌LVX耐藥率為32.9%（6/17），有8株發生gyrA突變，10株發生parC突變。而總體外排泵檢出率efmA基因（59， 70.2%）、efrA（53， 63.1%）、emeA（24， 28.6%），共同表達主要發生在efmA+efrA/B（30， 35.7%），而3種外排泵PCR同步擴增為14.3%（12/84）。結論 Ⅱ型拓撲異構酶gyrA與parC堿基突變在耐喹諾酮類腸球菌株中非常普遍，并為腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制，而外排泵基因的檢出率提示該地區腸球菌耐藥由外排泵基因引起的可能性。

關鍵詞：喹諾酮類藥物；gyrA和parC基因；耐藥性；外排泵

中圖分類號：R378 文獻標志碼：A

Type Ⅱ topoisomerase mutations and efflux pump expression

in quinolone-resistant enterococci

Yi Xingchi， Zhang Lixia， Li Hongyu， and Wang Manqing

（Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Baotou 014000）

Abstract Objective To investigate the simultaneous incidence of type Ⅱ topoisomerase mutations and efflux pump gene expression in quinolone-resistant enterococci and their correlation with resistance of quinolone-resistant enterococci to levefloxacin （LVX）. Methods A total of 67 strains of Enterococcus faecium and 17 strains of Enterococcus faecalis were collected from July 2022 to June 2023. The minimal inhibitory concentration （MIC） of Enterococcus against LVX was determined by the agar dilution method. Efflux pump genes emeA， efrA， efmA， and type Ⅱ topoisomerases gyrA and parC genes were amplified by PCR and sequenced. Results The LVX resistance rate of E. faecium was 89.6% （60/67）. There were 61 strains with the gyrA mutation and 62 strains with the parC mutation. The resistance rate of E. faecalis to LVX was 32.9% （6/17）. There were 8 strains with the gyrA mutation and 10 strains with the parC mutation. efmA （59，70.2%）， efrA （53，63.1%） and emeA （24，28.6%） were detected in the whole efflux pumps， and the co-expression was mainly in efmA+efrA/B （30，35.7%）， while the simultaneous amplification of three efflux pumps was 14.3% （12/84）. Conclusion Type Ⅱ topoisomerase gyrA and parC mutations are common in quinolone-resistant Enterococcus strains and are the main mechanism of quinolone-resistance of Enterococcus. The detection rate of efflux pump genes suggested that the resistance of Enterococcus in this area was caused by efflux pump genes.

Key words Quinolones; gyrA and parC genes; Drug resistance; Efflux pump

糞腸球菌（Enterococcus faecalis， Efa）和屎腸球菌（Enterococcus faecium， Efm）為定植于動物和人類胃腸道中的正常菌群成員之一，是常見的機會致病菌。而長期以來臨床上抗生素濫用，使得多重耐藥腸球菌菌株逐漸增多，并已成為院內感染的主要致病菌，在免疫力低下時可引起尿道感染、傷口感染、血流感染和腹腔感染等[1-3]。隨著臨床治療上氟喹諾酮類藥物（fluoquinolones， FQs）的廣泛應用，尤其是用于治療由腸球菌等引發的泌尿系統感染，致使腸球菌對喹諾酮類藥物的耐藥性不斷上升[4-5]。

喹諾酮類藥物的耐藥性是與喹諾酮耐藥決定區（quinolone resistance-determination region， QRDR）的突變與外排泵基因的高度表達有關。介導腸球菌對喹諾酮類高水平耐藥機制主要為QRDR中Ⅱ型拓撲異構酶的突變相關，而Ⅱ型DNA拓撲異構酶又是DNA促旋酶（gyrA和gyrB基因）和拓撲異構酶Ⅳ（parC和parE基因）組成[6-8]。其中gyrA和parC主要負責于脫氧核糖核苷酸的斷裂與重接，當其發生突變由親水性氨基酸突變為疏水性氨基酸，則該位點親水性降低，是介導FQs耐藥最主要機制[9]。腸球菌對FQs產生耐藥性的另一種機制是通過激活細胞膜上的主動外排系統來使細菌體內的藥物濃度降低，emeA與efmA同屬于主要促進超家族（MFS），efrA/B屬于ATP結合盒家族（ABC）轉運蛋白，都為多藥外排泵，有助于腸球菌中氟喹諾酮類藥物的排出[10-11]。

這項研究通過對臨床分離的84株腸球菌gyrA和parC基因QRDR突變特征與外排泵基因檢出情況，結合測量腸球菌對第三代喹諾酮類藥物左氧氟沙星的MIC值，探究喹諾酮類耐藥腸球菌Ⅱ型拓撲異構酶突變和外排泵基因檢出率，并與喹諾酮類藥物左氧氟沙星的耐藥相關性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2022年7月—2023年6月包頭醫學院第一附屬醫院臨床標本中分離的67株屎腸球菌與17株糞腸球菌，采用美華MALDI-TOP MS質譜快速鑒定系統與VITEK2全自動微生物鑒定及藥敏系統進行鑒定。質控菌株糞腸球菌ATCC29212，經衛生部臨床檢驗中心購入。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏儀和革蘭陽性細菌鑒定卡（法國梅里埃公司）；左氧氟沙星（上海易恩化學技術有限公司）；水解酪蛋白（M-H）瓊脂（青島海博生物公司）；瓊脂粉（北京蘭杰柯科技有限公司）；細菌組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix基因擴增試劑盒和DNA Marker（北京索萊寶科技有限公司）；DNA Engine Dyad PCR基因擴增儀和GELDoc2000凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。PCR引物合成及PCR產物測序由上海生工生物技術公司完成。

1.3 藥敏試驗

采用瓊脂二倍稀釋法檢測所有腸球菌對LVX的MIC值，糞腸球菌ATCC 29212為質控菌株，LVX濃度系列為512～0.25 mg/L。藥敏結果判斷標準參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）文件，判讀標準為：LVX MIC≤2 mg/mL時敏感，MIC＝4 mg/mL時中介，MIC≥8 mg/mL時耐藥。

1.4 PCR擴增和測序

進行Ⅱ型拓撲異構酶gyrA和parC耐藥基因PCR擴增和基因測序檢測以及外排泵基因emeA、efrA和efmA PCR擴增，引物序列見表1[11-12]。PCR采用25 μL反應體系：上、下游引物（10 μmol）各1 μL，DNA模板2 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。gyrA、parC和efmA擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環；最后72 ℃延伸7 min。emeA和efrA擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，57 ℃～55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸 60 s，35個循環；最后72 ℃延伸7 min。對gyrA和parC基因擴增產物進行純化并委托上海生工生物技術公司進行正反雙向測序，測序結果在GenBank進行BLAST序列比對。

1.5 數據分析

屎腸球菌gyrA和parC序列測序結果分別與gyrA（GenBank： AF060881.1）和parC（GenBank： BAA33440.1/Gene ID： 66453014）序列進行比對分析，糞腸球菌gyrA和parC序列測序結果分別與gyrA（Gene ID： 77470243）和parC（Gene ID： 77470109）序列進行比對分析。所有數據錄入SPSS 26統計軟件包。gyrA和parC突變與腸球菌耐藥程度的相關分析采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 腸球菌對LVX藥敏結果

67株屎腸球菌中，LVX耐藥率為89.6%（60/67），敏感率為10.4%（7/67）。17株糞腸球菌中耐藥率為32.9%（6/17），敏感率為67.7%（11/17）。總體腸球菌LVX耐藥率為78.6%（66/84），敏感率為21.4%（18/84）。結果見表2。

2.2 gyrA和parC基因PCR擴增結果與突變特征

對67株屎腸球菌和17株糞腸球菌通過PCR反應特異性擴增gyrA和parC基因，電泳結果（圖1）顯示全部實驗菌株與質控菌株糞腸球菌ATCC29212分別在241與191 bp分子量位置均檢測出明亮與清晰的標本條帶，即均擴增出gyrA和parC基因的目的片段。將其擴增產物全部送檢進行基因測序分析。gyrA測序結果顯示：在67株屎腸球菌中有61株發生gyrA基因Ser83突變，其中有44株為Ser83（AGT）→Ile（ATT），17株為Ser83（AGT）→Tyr（TAT）。突變菌株中包含有2株敏感菌株，60株耐藥屎腸球菌中僅有1株未發生突變。在17株糞腸球菌中有8株發生gyrA基因Ser83突變，并均為Ser83（AGT）→Tyr（TAT），其中有2株突變發生在敏感菌株，6株則為耐藥菌株。parC測序結果顯示：67株屎腸球菌僅有5株未發生突變，并都為敏感菌株，兩株發生突變的敏感菌株類型為Ser80（AGC）→Ile（ATC）。而60株耐藥屎腸球菌57株均為單一Ser80（AGC）→Ile（ATC）突變，剩余有2株還伴有Met89（ATG）→Leu（CTA）突變，1株伴有Gly111（GGT）→Val（GTC）突變。17株糞腸球菌中有10株發生突變，其中6株發生在耐藥菌株中，突變類型均表現為Ser80（AGC）→Ile（ATC）。結果見表3。

在所有腸球菌測序標本中，均未檢測到gyrA基因Glu87突變和parC基因Glu84突變，腸球菌gyrA基因Ser83突變（χ2=56.076，Plt;0.001）和parC基因Ser80突變（χ2=51.333，Plt;0.001）與LVX耐藥相關性卡方檢驗具有統計學意義。

2.3 外排泵emeA、efrA和efmA基因PCR擴增結果（圖2）

在所有臨床分離株中外排泵檢出率最高為efmA基因（59， 70.2%），其次為efrA（53， 63.1%），emeA檢出率僅為28.6%（24/84）。此外，外排基因共同檢出主要發生在efmA+efrA（30， 35.7%），而3種外排泵PCR同步擴增為14.3%（12/84）。

3 結論

FQs藥物在人類和動物中被廣泛應用治療后，導致該藥物抗生素耐藥分離株逐漸增加。研究顯示，采用FQ治療會增大誘發基因突變與重組的幾率，并對喹諾酮類和非喹諾酮類抗生素均產生耐藥性[6]。在2001—2006年期間，英國FQs耐藥大腸埃希菌分離株的患病率便從6%增加到20%[13]。趙婧等[14]分析喹諾酮類藥物在9年間（2012—2020年）上海市三級醫院臨床藥物使用情況發現，喹諾酮類藥物使用量占比年均增長5.37%，其中左氧氟沙星占比最多、用量穩定。本研究中屎腸球菌LVX耐藥率為89.6%、糞腸球菌為32.9%，與2021年CHINET中國細菌耐藥監測網數據[15]相近（屎腸球菌LVX耐藥率87.6%，糞腸球菌LVX耐藥率30.5%）。

喹諾酮類藥物的抗菌作用是DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，當前研究認為在革蘭陽性細菌中，gyrA和parC基因確定為耐喹諾酮類藥物的主要靶標[7]。常見的腸球菌QRDR區突變位點為gyrA的Ser83、Glu87和parC的Ser80、Glu84密碼子[9，12]。這項研究中觀察到gyrA第87位谷氨酸替換在這次測試的臨床分離株中并不常見，結果與鄭來煜等[16]、牛海英[17]和Rathnayake等[18]相像。而parC的Ser80位點突變類型全為Ile（ATC），與他們具有少量Ser80→Arg位點突變不同，此外還伴有Met89（ATG）→Leu（CTA）突變和未被報道過的Gly111（GGT）→Val（GTC）突變。parC Met89（ATG）→Leu（CTA）突變在2011年張俠家等[19]指出，同時還發現parC基因Ser48和Lys94的突變，但這些少量位點的突變是否會引起腸球菌產生喹諾酮類耐藥性還需進一步研究。

當前研究者對QRDR區突變介導耐藥仍具有較大爭議，如：gyrA與parC誰占據主導地位，并在許多研究中還描述了不同頻率的突變與不同突變類型等[10]。如在Sun等[20]的研究中gyrA處發生的替換有Ser84Asn/Ser84Ile/Ser84Arg/Gly106Asp，parC處有Ser82Ile/Glu86Lys/Glu86Gly/His105Tyr。Urushibara等[21]研究中gyrA處發生的替換有Ser84Arg/Ser84Ile/ Ser84Tyr/Glu88Gly/Glu88Lys/Glu88Gln， parC有Ser82Arg/Ser82Ile，其中2株屎腸球菌在gyrA Glu88Gln處的替換為首次發現。而在耐藥關聯方面，本文研究者與Yasufuku等[5]都認為gyrA Ser83和parC Ser80突變與LVX耐藥性顯著相關，且Yasufuku等更進一步證明糞腸球菌氨基酸突變、LVX耐藥性和風險因素三者間相關性，這又與Esfahani等[10]實驗結論（QRDR突變和外排基因的表達均未與MIC有任何顯著關聯）相悖。唐曼娟[22]研究中指出腸球菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥以parC基因80位突變為主，拓撲異構酶Ⅳ是喹諾酮類對腸球菌耐藥的首要靶酶，在實驗中低耐藥株多為parC基因單位點突變而高耐藥株同時含有gyrA和parC基因雙位點突變。本項實驗在糞腸球菌耐藥與突變類型中發現此現象。

本實驗中編碼主要促進超家族（MFS）EMEA蛋白的emeA基因在84株腸球菌中的檢出率為28.6%（24/84），遠低于黃奕雯[23]研究的豬源糞腸球菌外排泵emeA基因80.5%（191/241）的攜帶率，也要弱于Mirzaii等[11]研究中emeA基因54.5%（48，88）的檢出率。吳英[24]收集臨床標本中腸球菌分離株探究主動外排泵emeA表達與氟喹諾酮類藥物耐藥關系，在112株腸球菌中emeA基因總體陽性率有50.9%（57/112），對于左氧氟沙星、加替沙星和司帕沙星耐藥的腸球菌株中emeA基因表達率為67.9%、80.0%和67.8%，敏感菌株中的檢出率為33.9%、44.6%和32.1%，并采用逆轉錄（RT）-PCR法檢測emeA基因mRNA表達水平，耐藥腸球菌組emeA基因mRNA表達量與內參灰度比值的平均值為1.485，敏感腸球菌組為1.099，耐藥株emeA表達水平非常顯著高于敏感株（Plt;0.01）。而外排泵efmA基因和efrA/B基因國內暫未有人進行研究分析，參照Mirzaii等[11]實驗結果efrA（45， 51%），efmA（60， 68%），本實驗efrA（53， 63.1%）和efmA基因（59， 70.2%）檢出率近似，同時Mirzaii等還指出外排泵efmA基因與耐環丙沙星屎腸球菌間存在相關性以及外排泵抑制劑與FQs具有協同作用。當前關于各類外排泵的檢出數據存有較大研究缺口，缺乏含有國內外地區的大樣本數據進行研究比對，用以分析外排泵耐藥機制是否存有不同國家地區差異及與該類藥物耐藥水平和耐藥基因型有無關聯。現有研究證明，主動外排抑制劑利血平可以有效抑制腸球菌主動外排活性，降低FQs對腸球菌MIC值，有望通過與β-內酰胺類抗生素聯合使用減弱臨床細菌耐藥性[25]。

綜上所述，Ⅱ型拓撲異構酶gyrA與parC堿基突變在耐喹諾酮類腸球菌株中非常普遍，并為腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制，而外排泵基因的高度表達可導致耐藥性的進一步上升。因此，監測QRDR區突變位點與頻率以及規范喹諾酮類藥物臨床用藥變得十分必要。

參 考 文 獻

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收稿日期：2024-01-12

基金項目：內蒙古自治區高等學校科學研究項目（No. NJZY21077）

作者簡介：易星馳，男，生于1999年，在讀碩士研究生，主要研究方向為細菌耐藥機制，E-mail： yixingchi2021@163.com

*通信作者，E-mail： zhanglixia19760308@163.com