LC-MS/MS法測定磷酸特地唑胺中2種基因毒性雜質

摘要：目的 建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定磷酸特地唑胺中2種基因毒性雜質的含量。方法 樣品使用稀釋液（0.5%氨水）溶解后采用Waters BEH C18色譜柱；以0.1%甲酸水（A）、0.1%甲酸乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃；采用電噴霧離子源（ESI）正離子掃描，多反應監測（MRM）模式對2種雜質進行定量檢測。結果 2種雜質在0.375～30 μg/L范圍內具有良好的線性關系；檢出限分別為0.09和0.05 μg/L；定量限分別為0.375和0.188 μg/L；2種雜質在磷酸特地唑胺中，25%限度、50%限度、100%限度和150%限度的加標回收率（n=3）在96.9%～129.6%之間，回收率RSD小于5%。結論 對磷酸特地唑胺片和原料藥中雜質進行檢測，雜質主要來源于原料藥，兩種雜質總量均未超過限值。該方法靈敏度高、專屬性好，準確度高，可用于測定磷酸特地唑胺中2種基因毒性雜質，為磷酸特地唑胺的質量控制提供技術支持。

關鍵詞：磷酸特地唑胺；惡唑烷酮類；基因毒性雜質；液相色譜-串聯質譜

中圖分類號：R917 文獻標志碼：A

Determination of two genotoxic impurities in terzolamide phosphate" by LC-MS/MS

Su Shuang， Yang Jiwei， Xu Qiao， Li Jian， and Yu Xiaofeng

（Expec Technology Inc.， Hangzhou 311300）

Abstract Objective To establish a method for the determination of two genotoxic impurities in tedizolid phosphate by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass. Methods The samples were dissolved in diluent （0.5% ammonia solution）， and then the chromatography was performed on the Waters BEH C18 column. Using 0.1% formic acid water （mobile phase A） and 0.1% formic acid acetonitrile （mobile phase B） as mobile phases， gradient elution was performed at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 40 oC. The compounds were scanned by positive ion ESI， and the two impurities were quantitatively detected in multiple reaction monitoring （MRM） mode. Results The two impurities had a good linear relationship in the range of 0.375～30 μg/L. The detection limits were 0.09 and 0.05 μg/L， respectively. The limits of quantitation were 0.375 and 0.188 μg/L， respectively. The recoveries （n=3） of 25% limit standard addition level， 50% limit standard addition level， 100% limit standard addition level and 150% limit standard addition level of the two impurities in terezolamide phosphate were between 96.9% and 129.6%， and the RSD of the two impurities was less than 5% in the terezolamide phosphate. Conclusion Impurities in terazolamide phosphate tablets and raw materials were detected， and the impurities mainly came from the raw materials. The total amount of both impurities did not exceed the limit. The method had high sensitivity， specificity and accuracy， which can be used for the determination of two genotoxic impurities in terzolamide phosphate， providing technical support for the quality control of terzolamide phosphate.

Key words Erezolamide phosphate; Zyvox; Genotoxic impurities; LC-MS/MS

惡唑烷酮類抗菌藥是一種新型結構類抗生素藥物，目前上市的有利奈唑胺和磷酸特地唑胺，該類藥物主要用于治療敏感性細菌引起的急性細菌性皮膚和皮膚結構感染[1-2]。磷酸特地唑胺是一種前體藥，在體內可被磷酸酶迅速轉化為具有生物活性的特地唑胺，特地唑胺能夠與細菌的核糖體50S亞基結合，從而抑制蛋白質的合成。磷酸特地唑胺（tedizolid phosphate）作為第二個上市的惡唑烷酮類藥物，相比于利奈唑胺具有藥效更高、耐藥性更低、長期用藥性更好等特點，具有更為廣闊的應用前景[3]。目前磷酸特地唑胺的合成方法主要有4種[4-5]，通過分析合成工藝路線發現，在這幾種合成過程中易產生多種基因毒性雜質，雜質I（化學命名為：（R）-5（氯甲基）-3-（3-氟-4-（6-（2-甲基-2H-四氮唑-5-基）吡啶-3-基）苯基）氧惡唑烷-2-酮）和雜質II（化學命名為：4-溴-3-氟苯胺）就是合成反應中可能存在的雜質。雜質I為氯離子取代磷脂產生的雜質[6]，雜質II是合成反應的原料之一[7]，兩種雜質的結構式及雜質來源見圖1。在藥物研發和生產過程中，這些藥物雜質將直接影響藥物效果及用藥者健康。根據中國藥典《9306基因毒性雜質控制指導原則》、人用藥品技術要求國際協調理事會發布指導原則[ICH M7（R1）]：《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》要求，若用于長期治療（大于10年），毒理學關注閾值（TTC）單日雜質攝入量為1.5 μg/d計算，結合該藥品每日攝入量為200 mg，則該藥物中基因毒性雜質的限值為7.5 μg/g。

基因毒性雜質檢測需要很高的靈敏度和專屬性， 液相色譜-串聯質譜聯用儀由于其靈敏度高，抗干擾能力強，現已成為藥物中基因毒性雜質檢測的常用手段[8-11]。但目前，對于磷酸特地唑胺的報道大部分都是有關其合成方法及可能產生的雜質的內容[4-5]。對于藥物中雜質的檢測方法甚少[6-7]。黎龍香[12]等對磷酸特地唑胺中TDZA010和TDZA046兩種雜質進行檢測，其中TDZA-010與本文中雜質I結構相同，另一種雜質結構不同。實驗以磷酸特地唑胺片為研究對象，分析其在合路線中可能產生的基因毒性雜質，建立LC-MS/MS測定磷酸特地片中2種雜質的檢測方法，并對相關方法學進行驗證，為磷酸特地唑胺片中基因毒性雜質的檢測提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

EXPEC 5210三重四極桿質譜儀，ULC 510超高效液相色譜儀（具體配有二元超高壓輸液泵、自動進樣器（含冷卻功能）、柱溫箱（杭州譜育科技）。十萬分之一天平（Mettler Toledo XSR105）；Milli-Q 純水系統（Millipore），超聲清洗機（昆山市超聲清洗有限公司），渦旋混合儀（泰州諾米醫療科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

雜質I對照品（自制，批號：20231023，純度95.4%）和雜質II對照品（自制，批號：20231015，純度99.7%），供試品為磷酸特地唑胺片（自制，批號：20231028、20231103、20231105、20231110）和磷酸特地唑胺原料藥（自制，批號：20231026、20231101、20231104、20231114）。色譜級乙腈（Merck）；質譜級甲酸（上海安譜公司），優級純氨水（國藥集團）。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1" " 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm），流動性A：0.1%甲酸水；流動性B：0.1%甲酸乙腈；流速：0.3 mL/min，流動相梯度洗脫條件：0～1 min，10%B；1～5 min，B相由10%變為95%B；5～6.5 min，95%B；6.6～9.5 min，10%B。柱溫：40 ℃；進樣體積1 μL，樣品盤溫度4 ℃。

2.1.2" " 質譜條件

采用正離子模式對2種雜質進行一級質譜掃描，根據掃描確定母離子，再用Product ion模式確定子離子。使用注射泵連接流動相和質譜對調諧電壓進行優化。在多反應檢測MRM模式下優化碰撞能量。ESI+模式；掃描模式：MRM，毛細管高壓：4.8 KV；去溶劑氣溫度：480 ℃；霧化氣流量：1.8" L/min，去溶劑氣：14.0 L/min；反吹氣：1.0 L/min，碰撞氣：0.5 mL/min，MRM參數見表1。

2.2 溶液制備

空白溶劑（稀釋液）：0.5%氨水溶液。

對照品溶液的制備：分別精密稱取雜質I和雜質II約3.75 mg于100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，精密移取適量所得溶液于100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，即得2種雜質的混合對照品儲備液。

供試品溶液的制備：將磷酸特地唑胺片打碎研磨，準確稱取供試品粉末約5 mg（精確到0.1 mg），置10 mL容量瓶中，加適量稀釋液超聲使其溶解，定容至刻度（約0.5 mg/mL），LC-MS/MS待分析。

3 結果

3.1 線性范圍實驗

精密量取適量混合對照品儲備液，用稀釋液進行稀釋，配制一系列標準曲線，濃度分別為：0.375、0.75、1.875、3.75、5.625、7.5、15和30 μg/L。分別取1 μL進樣檢測，記錄色譜圖，以各雜質對照品濃度（X，μg/L）為橫坐標，以各雜質對照品的峰面積（Y）為縱坐標，權重1/X，進行線性擬合，所得線性方程見表2，在線性范圍內，峰面積呈現良好的線性，線性相關系數r值在0.999以上。

3.2 專屬性實驗

將供試品溶液、空白溶液和“3.1”項下3.75 μg/L對照品溶液分別進樣分析，記錄各溶液提取離子流色譜圖，見圖2，雜質I和雜質II的保留時間分別為4.93和5.02 min，峰型良好，空白溶液對各雜質通道內無干擾。

3.3 檢測限與定量限

將定量限溶液進行連續進樣6次，測定雜質I和雜質II的峰面積、峰面積RSD和信噪比。將檢出限溶液進樣分析，測試其信噪比。結果見表3。

3.4 進樣精密度

對不同濃度標準溶液（0.375、1.875、5.625和15 μg/L）連續6次進樣，考察保留時間和峰面積的重復性，結果如表4所示。由結果可知，2種雜質保留時間和峰面積的RSD不大于5.4%，精密度良好。

3.5 重復性

取同一批磷酸特地唑胺片適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，計算供試品中雜質峰含量的RSD。測試結果顯示，供試品中雜質II未檢出；雜質I有檢出，6份樣品平均含量為1.40 ppm，含量的RSD為6.0%（表5），說明方法精密度良好。

3.6 準確度

準確稱取供試品5 mg（精確到0.1 mg），置10 mL容量瓶中，向其中精密加入0.375 μg/L的混合標準溶液，加入量分別為25、50、100和150 μL，加適量稀釋劑超聲使其溶解，再用稀釋劑稀釋至刻度，每個加標濃度平行3份。對應加標限度分別為25%、50%、100%和150%，計算每個加標濃度的回收率及RSD，結果見表6。結果顯示，磷酸特地唑胺片中2種雜質加標回收率在96.9%～129.3%之間，回收率RSD小于5%。

3.7 樣品測定

精密稱取6批磷酸特地唑胺片、4批原料藥按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行2份。按照“2.1”項下色譜條件和質譜條件進樣分析，測定磷酸特地唑胺片中雜質的含量，結果見表7。從檢測結果來看，6批藥物中雜質I檢出率為100%，雜質II的檢出率為33.3%，但2種雜質總量均未超過限值。

4 討論

實驗嘗試將供試品進行溶解，磷酸特地唑胺片在純乙腈或純水中微溶，同時pH對其溶解度也有影響。使用超純水或者0.1%甲酸水都不能完全溶解藥物，在稀氨水溶液中可完全溶解，最終采用0.5%氨水作為稀釋液來對藥物樣本進行溶解。實驗考察了進樣穩定性，將供試品溶液在4 ℃進樣器中放置0、2、4、8、12和24 h后進樣測定，記錄色譜圖和峰面積。結果顯示2種雜質峰面積RSD小于5%，說明該條件下2種雜質在24 h穩定性良好。實驗也考察了方法的耐用性，分別調整柱溫為38和42 ℃，流動相流速分別調整為0.28和0.32 mL/min。結果表明，雜質I和雜質II的色譜圖峰型無變化，保留時間RSD分別為2.2%和2.3%，峰面積RSD分別為5.6%和6.7%，表明檢測條件輕微改變不影響2種雜質的檢測。

作為新型惡唑烷酮類抗生素藥物，磷酸特地唑胺的合成工藝有較多報道，本研究基于不同合成方式涉及到的較常見的2種雜質，建立了專屬、靈敏的LC-MS/MS測定法，并完成了相關的方法學驗證。對磷酸特地唑胺片及原料藥進行檢測，6批磷酸特地唑胺片和4批原料藥中均檢出雜質I，但不超過檢出限值，由測試結果可知，磷酸特地唑胺片中雜質主要來源于原料藥，后期在原料藥的制備時可著重關注雜質的含量及控制。此方法操作簡單、快速，為磷酸特地唑胺片中基因毒性雜質的檢測提供技術支持，為藥物的質量控制提供了保障。

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收稿日期：2024-04-01

作者簡介：蘇爽，女，生于1992年，碩士，工程師，主要研究方向為色譜與質譜分析，E-mail： 451064835@qq.com