湖州市某三甲醫院住院患者艱難梭菌毒素基因檢測及其分子流行病學分析

摘要：目的 研究地市級醫院住院患者艱難梭菌感染的發生情況，并分析艱難梭菌的分子流行病學特征。方法 收集湖州市第一人民醫院2023年11月—2023年12月住院腹瀉患者糞便標本，培養分離艱難梭菌后，采用核酸擴增技術檢測毒素基因，菌株經全基因測序后（Whole Genome Sequencing， WGS）進行分子流行病學分析。結果 從500份住院患者腹瀉樣本中分離得到49株艱難梭菌，其中產毒型艱難梭菌40株，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infections， CDI）陽性率為8.00%；PCR檢測的毒素基因主要為tcdA（+）/tcdB（+），雙毒素基因陰性（A+B+CDT-），占97.50%（39/40），1株攜帶雙毒素基因（A+B+CDT+）；CDI陽性率最高的科室是消化內科，其次為ICU；MLST分型中，共有13種ST型別，其中ST2型為優勢型別，占30.00%；結合WGS數據分析，未發現艱難梭菌菌株在研究期間發生流行和傳播。結論 本院CDI在住院腹瀉患者中的發生率較低，未發生院內感染傳播和暴發流行現象，但不排除存在未知感染源可能性，應重點關注重點科室，如ICU 患者發生CDI情況。

關鍵詞：住院患者；腹瀉；艱難梭菌；毒素基因；分子分型

中圖分類號：R9 文獻標志碼：A

Toxin gene detection and molecular epidemiology of Clostridioides difficile isolated from hospitalized patients in a tertiary hospital in Huzhou

Zheng Lili， Qiang Xinhua， and Ji Longfei

（Department of Laboratory Medicine， the First People's Hospital of Huzhou， Huzhou 313000）

Abstract Objective To study the incidence of Clostridioides difficile infection （CDI） in hospitalized patients in a tertiary hospital and analyze the molecular epidemiological characteristics of C. difficile. Methods Stool specimens from hospitalized patients with diarrhea in the First People’s Hospital of Huzhou City from November 2023 to December 2023 were collected. After C. difficile was isolated and confirmed， polymerase chain reaction （PCR） was used to detect the toxin genes. All toxigenic C. difficile isolates were sequenced by whole genomic sequencing （WGS） for molecular epidemiological analysis. Results From 500 diarrhea samples， 49 strains of C. difficile were isolated， of which 40 were toxin-gene positive strains， resulting in a CDI positivity rate of 8.00%. Isolates with tcdA-positive and tcdB-positive （A+B+CDT-） were the predominant toxinotyping， accounting for 97.50% （39 out of 40）， while one strain carried binary toxin genes （A+B+CDT+）. The department with the highest CDI positivity rate was gastroenterology， followed by the intensive care unit （ICU）. In multilocus sequence typing （MLST）， there were 13 different sequence types （ST）， among which ST2 was the dominant type， accounting for 30.00%. Combining WGS data analysis， there was no evidence of an epidemic or spread of C. difficile strains during the study period. Conclusion The incidence of CDI among hospitalized patients with diarrhea in our hospital was relatively low， and there was no occurrence of nosocomial transmission or outbreak. However， the possibility of an unknown source of infection cannot be ruled out， and attention should be focused on the occurrence of CDI in key departments， such as ICU patients.

Key words Hospitalized patients; Diarrhea; Clostridioides difficile; Toxin genes; Molecular typing

艱難梭菌（Clostridioides difficile， C. difficile），是一種專性厭氧的革蘭陽性芽胞桿菌，主要通過芽胞經糞-口傳播[1]，可定植在人體腸道內，屬條件致病菌[2]。艱難梭菌主要通過分泌毒素A和/或毒素B致病[3]。毒素A為腸毒素，可結合腸黏膜上皮細胞的毒素受體，介導環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）促進水鹽分泌，引發腸炎和腹瀉；毒素B為細胞毒素， 可直接破壞腸壁細胞引發炎癥反應，導致腸黏膜細胞變性、凋亡、壞死甚至脫落。部分產毒素菌株通過產雙毒素（CDT）引發疾病[4]。當腸道正常菌群因抗菌藥物使用等因素導致菌群抵抗降低，產毒素艱難梭菌過度繁殖并釋放大量毒素，引起艱難梭菌感染（C. difficile infection， CDI）。CDI是常見的住院患者院內感染性腹瀉之一，臨床癥狀可從自限性腹瀉到假膜性結腸炎、中毒性巨結腸甚至感染休克死亡[5]。CDI是一種潛在的致命性疾病，世界范圍內發病率都在不斷上升[6]。在我國，由于多數醫療單位并未開展艱難梭菌的常規臨床檢測[7]，且目前國內已發表的艱難梭菌研究數據基本來源于一些大型綜合性教學醫院[8]，而基層醫院（地市級）對CDI的研究資料較為缺乏。本研究旨在了解地市級（湖州）醫院中，住院腹瀉患者艱難梭菌感染發生情況、感染患者的臨床基本特征、艱難梭菌分子流行病學特點等情況，為全面監測我國CDI的真實情況進行補充。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2023年11月—2023年12月湖州市第一人民醫院入院48 h后發生腹瀉的住院患者糞便樣本，進行艱難梭菌培養和毒素檢測并收集其相關臨床資料。腹瀉判斷標準為：24 h內腹瀉≥3次，糞便呈稀便、糊狀或水樣便等異常性狀[9]。患者出現腹瀉癥狀，同時糞便標本培養到艱難梭菌，且艱難梭菌tcdA和/或tcdB基因為陽性，并排除其他可能引起腹瀉的因素，診斷為CDI患者[10]。

收集CDI組患者發生腹瀉后首次送檢的臨床資料（包括白細胞計數、C反應蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、白蛋白和肌酐數值）；同時設立對照組，匹配年齡、性別和科室，患者發生腹瀉但艱難梭菌檢測為陰性的臨床資料進行統計分析，探討CDI臨床感染狀況。本方案經醫院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌分離培養及鑒定

收集來自湖州市第一人民醫院臨床住院患者發生腹瀉的送檢糞便樣本，取0.2～0.3 g（0.2～0.3 mL）左右的不成形糞便樣本浸泡于95%乙醇中，室溫靜置30 min后，置于離心機中以3000 r/min離心15 min，棄上清，加入生理鹽水0.5 mL并混勻。吸取適量的混合液加到選擇性培養基環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂培養基（cycloserine-cefoxitin-fructose agar， CCFA）上，用涂布棒均勻涂布，置于Electrotek AW300SG厭氧工作站（厭氧環境：80%氮氣-10%二氧化碳-10%氫氣），37 ℃培養48～72 h觀察結果。挑選黃色或灰白色、扁平粗糙、邊緣不規則、有特殊臭味（馬糞味）的典型菌落，經MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀）鑒定（score value≥2）為艱難梭菌的菌株于-80 ℃保存。

1.2.2 艱難梭菌毒素基因檢測

通過聚合酶鏈反應（PCR）檢測毒素基因tcdA、tcdB、cdtA和cdtB。引物序列[11]如表1所示。

1.2.3 艱難梭菌的全基因測序及分析

經鑒定的產毒素艱難梭菌重新接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37 ℃厭氧條件下培養48 h，用FastDNA Spin Kit試劑盒提取細菌的基因組，并送測序。全基因組（Whole genome sequences， WGS）數據在Illumina HiSeq 2500 系統（Illumina， San Diego， CA， USA）上進行。組裝前，使用FastQC v.0.11.5對原始序列讀數進行質量控制[12]，并使用Trimmomatic v.0.40 對適配器區域進行修剪[13]。使用SPAdes v.3.6 15 對修剪后的讀數進行重新組裝[14]。

為了解產毒素艱難梭菌的種群結構，將上述組裝好的基因組數據上傳至PubMLST官網，確定每株產毒素艱難梭菌的MLST分型[15]；并用Snippy基于參考序列Clostridioides difficile 630 （Accession： NC_009089.1）分析產毒素艱難梭菌菌株之間差異性突變位點，即單核苷酸多態性（SNP），并基于核心基因組用MAGE X構建進化樹[16]。同時，基于核心基因組的SNP利用Cytoscape構建最小生成樹[17]。為了深入研究艱難梭菌遺傳特征，使用Abricate v1.0.1軟件基于VFDB、Resfinder和CARD抗生素耐藥基因數據庫，對毒力基因和耐藥基因進行了分析[18]。

1.2.4 統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，對正態分布的計量數據，以（均數±標準差，x±s）表示，用t檢驗；對非參數計量數據，以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用例數（n）和百分率（%）表示，用χ2檢驗。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDI組患者的臨床基本情況

共收集腹瀉病例500例，其中男性患者278例（55.60%），女性患者222例（44.40%）；年齡≤65歲的有243例（48.60%），年齡＞65歲的有257例（51.40%）。一共分離鑒定得到艱難梭菌49株，培養陽性率為9.80%（49/500）。檢出產毒素艱難梭菌40株，結合患者臨床特征和CDI診斷標準，CDI陽性率為8.00%（40/500）。產毒艱難梭菌中，所有菌株毒素A和毒素B基因均陽性（A+B+），未檢測到毒素A陰性而毒素B陽性（A-B+）的菌株；在A+B+菌株中，僅有1株艱難梭菌檢測到雙毒素基因（A+B+CDT+）（2.50%， 1/40）。男性患者CDI陽性率為8.27%（23/278），女性患者CDI陽性率為7.66%（17/222）。年齡在65歲及以下患者中，CDI陽性率為7.40%（18/243）；年齡超過65歲患者中，CDI陽性率為8.56%（22/257）。不同年齡（年齡gt;65歲與年齡≤65歲）、不同性別住院患者CDI陽性率差異無統計學意義（Pgt;0.05）。CDI患者白細胞計數、C反應蛋白和肌酐值高于非CDI患者，而谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和血清白蛋白值低于非CDI患者，統計學分析發現，白細胞計數和血清白蛋白在兩組間差異有統計學意義（均Plt;0.05）；C反應蛋白、肌酐、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶在兩組間差異無統計學意義（均Pgt;0.05），詳見表2。所有CDI組患者經治療后均好轉出院。

2.2 CDI組的標本來源及科室分布

500份住院腹瀉患者糞便標本來源于22個科室，其中培養到產毒素艱難梭菌的有19個科室，CDI患者陽性率最高的科室是消化內科9例（14.52%，9/62），其次是ICU2例（10.00%，2/20）和神經內科3例（9.68%，3/31）。艱難梭菌科室培養陽性率及CDI陽性率詳見表3。

2.3 基因組測序分析結果

對40株產毒艱難梭菌進行MLST管家基因分析，共計得到13種ST型別，主要ST型別分別是ST2型12株（30.00%），ST35型、ST3型、ST54型和ST102型各占10.00%（4/40），其中產雙毒素艱難梭菌的型別為ST201型。對不同ST型別的艱難梭菌基因組進行分析，共發現11個耐藥基因，其中所有的產毒艱難梭菌均攜帶cdeA耐藥基因；AAC（6'）-Ie-APH（2''）-Ia、ANT（6）-Ia、ermB、ermQ、inuC、tetA（P）、tetB（P）和tet（M）等耐藥基因存在于個別艱難梭菌中。毒力基因分析發現一共有14個毒力基因，其中CD0873、CD2830、CD2831、cwp84、fbpA和groEL等毒力基因存在于所有產毒菌株中；CD3145、CD3246和cwp66毒力基因存在于大部分產毒艱難梭菌中；而slpA毒力基因僅存在于個別菌株中，詳見圖1。

基于核心組的SNP通過Cytoscape構建最小生成樹，見圖2。按照≤3個SNP來分析[19]：3個以下的SNP，菌株來源于同一個克隆菌株；4～10個SNP表示菌株之間有關聯性，可能來源于同一個克隆菌株；大于10SNP表示菌株為獨立菌株。根據這個判斷標準，40株菌株中，34株為確定的獨立菌株，而剩下的6株菌株中，編號為500號的菌株與457號和480號菌株可能來自同一克隆，480號菌株與448號菌株可能來自同一克隆，206號與157號菌株可能也有所關聯，分析攜帶上述菌株患者的院內活動軌跡，發現并不存在時空交叉感染，這表明未發現艱難梭菌在院內傳播的情況。

3 討論

目前，CDI發生率呈現不斷上升趨勢[20]，在我國部分地區一些綜合醫院發生率也較高。孔懿等[21]研究發現，江蘇地區的兩所大中型醫院的高危人群艱難梭菌檢出率為31.15%（38/122），CDI陽性率為20.49%（25/122）。朱曉艷等[22]收集了四川某大型綜合醫院810例腹瀉糞便標本進行篩查，其中艱難梭菌的檢出率為16.79%（136/810），CDI陽性率為9.75%（79/810）。本研究收取了湖州市第一人民醫院500例住院患者腹瀉樣本進行培養，共分離艱難梭菌49株，檢出率為9.80%；分離出產毒型艱難梭菌40株，結合患者臨床診斷，CDI陽性率為8.00%。與上述大型綜合醫院相比，地市級醫院艱難梭菌檢出率及陽性率略有偏低，可能是與研究對象非高危人群、收集時間短樣本量少、檢測方法不同等原因相關[23]。本研究中，CDI患者來源于19個科室，分布較為廣泛，陽性率最高的是科室是消化內科，可能是消化內科患者由于胃腸道疾病等原因容易引起胃腸黏膜屏障被破壞[24]，導致艱難梭菌易感；同時也可能是消化科醫生對CDI的認知度較高，對發生腹瀉的患者會考慮進行艱難梭菌的檢測。在本研究中，ICU患者CDI陽性率低于消化內科患者，而有相關研究[25-27]表明，ICU患者由于病情較重、合并基礎疾病較多、部分患者長期聯合使用抗菌藥物等原因，大大增加了感染艱難梭菌的風險，這提示在后續的研究中應重點關注ICU患者CDI的情況，包括對ICU醫生進行CDI的宣教。

本研究中，產毒素艱難梭菌分離率為81.63%，介于國內外研究數據的72.00%～92.00%之間[28]，其中A+B+是產毒素艱難梭菌最主要的毒素型別，這與國內外的相關研究數據相一致[29]。需注意的是，本研究中還檢出1株A+B+CDT+的艱難梭菌菌株，經MLST分型鑒定為ST201型，該ST型并非國外較為流行的高毒力艱難梭菌RT027型（ST1型）[30]和RT078型（ST11型）[31]，但與ST1型艱難梭菌高度同源[32]，雖未在國內外引起暴發流行，僅有少數相關報道[33-34]，仍應密切關注該種菌株的流行和傳播。

有研究指出，年齡（gt;65歲）、白細胞值升高、腎功能衰竭和潛在合并癥是復雜CDI常見危險因素[35]，而血清白蛋白是可以預測CDI死亡率和疾病并發癥及復發的實驗室指標[36]。由于本研究為回顧性研究，臨床醫生缺乏對CDI的了解，對多數患者只是進行了止瀉處理，所有患者病情經好轉后出院，未發生死亡事件。后續是否存在CDI的復發，還需進一步追蹤和隨訪。本研究中，CDI組與非CDI組患者的相關實驗室指標統計分析發現，CDI組白細胞計數高于非CDI組，白蛋白水平低于非CDI組，差異均有統計學意義。究其原因，考慮產毒型艱難梭菌在腸道中釋放毒素，引起白細胞浸潤和炎癥因子聚集，引發腸道炎癥反應[37]，導致白細胞數值升高。白蛋白作為一種負性急性期反應蛋白，與炎癥組織呈負相關[38]，在CDI嚴重感染時，由于腸通透性增加，蛋白質大量損失，甚至出現腸假膜[39]。本研究關于兩組在腎臟功能（肌酐）的比較中，差異無統計學意義，且CDI組肌酐指標均未超過重度標準（血肌酐≥1.5 mg/dL）[10]，這說明CDI組患者感染癥狀并不嚴重。有研究[40]顯示，年齡超過65歲也是CDI的危險因素之一，推測是與老年人的免疫力低、腸道菌群抵抗力下降等有關。但在本研究中，CDI發生率在超過65歲和小于65歲患者中并無統計學意義，可能是在收集樣本過程中，未將兒科的樣本剔除，導致整體年齡分布趨于年輕化。

細菌分子分型是用來監測CDI暴發和流行病學溯源的一種重要技術。本研究中所有的產毒型艱難梭菌經MLST分型后得到13種ST型，主要型別為ST2型，與國內現有的研究報道[41-42]大型綜合醫院的主要流行菌株為ST54型、ST35型等不同，這可能與大型綜合醫院的患者多數由于病情復雜、住院時間長，出現院內感染的可能性較高有關。研究報道稱[43]，ST2型艱難梭菌感染往往是社區來源，而地市級醫院接診的患者大多為社區首診，這就造成了艱難梭菌ST型別在不同等級醫院上的差異。對40株產毒艱難梭菌進行耐藥基因檢測發現，所有菌株均攜帶cdeA耐藥基因，它是艱難梭菌中被發現的首個多種藥物外排轉運體，會導致艱難梭菌對喹諾酮類和吖啶酮類藥物產生耐藥性[44]。氨基糖苷類和大環內酯類耐藥基因主要富集在ST35型、ST3型艱難梭菌等，其他類型耐藥基因無明顯聚集，呈多樣性分布。毒力基因檢測中，cwp（細胞壁或艱難梭菌壁蛋白）、fbpA（纖維連接蛋白）、groEL（熱休克蛋白）等蛋白基因，存在于所有產毒艱難梭菌中，其與艱難梭菌致病力有關，可以參與細菌黏附、侵襲、運動和定植等[45]。

基于WGS的數據和核心基因組的SNP構建最小生成樹，可以判斷流行菌株是否來自同一個克隆菌株[46]。本研究中，40株產毒艱難梭菌大多數都是獨立進化，沒有發生院內傳播，可能是患者在入院前已攜帶產毒菌株[47]。在最小生成樹中發現1個關系較為緊密的分支（clade），兩兩菌株之間的SNP在8～10之間，結合患者臨床資料分析，并沒有發現這些患者在時間、空間上有交叉感染的情況，推測可能是存在其他未知的傳染源。由于CDI患者或無癥狀艱難梭菌定植患者會不斷排出帶有艱難梭菌的糞便，其牙胞可在環境中存活6個月以上[48]，污染醫院環境、物體表面、醫療設備以及醫務工作者的衣物等[49]，因此，規范的手衛生、嚴格消毒院內環境和醫療設備、定期更換病房用品等措施有助于減少艱難梭菌的感染與傳播[50]。

需要說明的是，本研究還存在著一定不足之處，首先是收集樣本時間較短、樣本量較少；其次由于客觀原因未將CDI危險因素（使用抗生素、住院時長、合并并發癥等）納入統計分析，導致CDI患者臨床信息分析不夠全面，不足之處將在后續研究中加以改善。

綜上所述，湖州市第一人民醫院CDI陽性率與國內一些大型綜合醫院相比偏低，分子分型也略有差異，盡管未發現艱難梭菌的院內感染暴發流行，但未知的感染源仍應引起我們的重視，我們要繼續加強對CDI的監測和感控。

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