通過式固相萃取超高效液相色譜串聯質譜測定水產品中獸藥殘留

摘要 ［目的］采用通過式固相萃取超高效液相色譜串聯質譜法，對水產品中的獸藥殘留進行檢測。［方法］對樣品進行80%乙腈提取，利用OasisPRiMEHLB固相萃取小柱對提取液進行富集凈化，采用0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相進行梯度洗脫。運用串聯質譜電噴霧正、負離子掃描模式，結合質譜多反應監測（MRM）模式進行分段掃描，并通過外標法進行定量分析。［結果］10種獸藥殘留在10～200 ng/mL線性關系良好（R2gt;0.99）。方法的檢出限為0.24～4.07 μg/kg，定量限為0.07～1.22 μg/kg。在10、50、100 μg/kg的加標濃度下，回收率為80.64%～117.52%，相對標準偏差（RSD）為1.3%～6.6%。［結論］該研究構建的獸藥殘留檢測方法具有前處理簡便、凈化效能顯著、靈敏度高等優勢，可以滿足動物源性食品中獸藥殘留的檢測需求。

關鍵詞 獸藥殘留；超高效液相色譜串聯質譜法；水產品

中圖分類號 TS 254.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2025）05-0161-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.034

Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by Ultra-high Performance Liquid Chromatography by Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Chong-yu，WANG Zhan-hua，SHI Bei et al

（Zhejiang Institute of Food and Drug Control/Key Laboratory of Functional Food Nutrition and Quality Safety for State Market Regulation/Key Laboratory of Health Food Quality Safety of Provincial Market Regulation， Hangzhou，Zhejiang 310052）

Abstract ［Objective］To detect veterinary drug residues in aquatic products by using the formula solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.［Method］After 80% acetonitrile extraction using Oasis PRiME HLB solid phase extraction column enrichment purification and isolated components， 0.1% formic acid water-acetonitrile solution in the mobile phase proportional gradient elution， in series mass spectrum electrospray positive and negative ion scanning mode， using mass spectrometry multi-reaction monitoring （multiple reaction monitoring， MRM） mode segment scanning， quantified by external standard method. ［Result］The 10 veterinary drug residues showed good linear relationship between 10 and 200 ng/mL （R2gt;0.99）， the detection limit of method was 0.24-4.07 μg/kg， the limit of quantification was 0.07-1.22 μg/kg.At spiked concentrations of 10， 50， and 100 μ g/kg， the recovery rate was 80.64%-117.52%， the relative standard deviation （RSD） was 1.3%-6.6%.［Conclusion］The method for detecting veterinary drug residues constructed in this study has the advantages of simple pretreatment， significant purification efficiency and high sensitivity， which can meet the detection needs of veterinary drug residues in animal derived foods.

Key words Veterinary drug residues;Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;Aquatic product

獸藥殘留是指在食品動物使用藥物治療或長期攝入含有藥物的飼料后，其源性食品中所殘留的獸藥原型或其代謝產物，以及與之相關的雜質。目前，導致獸藥殘留超標的主要原因涉及多個方面：一是抗菌藥和藥物添加劑的濫用，二是對休藥期規定的不遵守，三是非法使用違禁藥物。獸藥殘留的來源不僅限于畜禽疾病的治療用藥，還包括飼料中添加的某些成分、動物性食品的保鮮措施，以及促生長飼料添加劑的使用，甚至環境中污染物質的接觸或攝入等［1］。由于部分養殖戶受到經濟利益的驅使，或對獸藥殘留潛在危害性的認識不足，導致畜禽產品中的獸藥殘留問題日益嚴重。目前，獸藥殘留已成為公眾廣泛關注的焦點。例如，農業農村部近期發布的2023年國家產地水產品獸藥殘留監控報告顯示，全國產地水產品獸藥殘留監測合格率高達99.5%［2］。

在動物源性食品中，獸藥殘留超標的問題尤為突出，主要涉及抗生素類、磺胺類、呋喃類、抗寄生蟲類和激素類藥物等，水產品中常用的獸藥包括孔雀石綠、硝基呋喃類藥物、氯霉素、地西泮、氟喹諾酮類等［3］。鑒于水產品已成為日常飲食的重要組成部分，獸藥殘留超標可能對人體健康產生深遠影響，如引發急性或慢性中毒反應，產生“三致”作用（致畸、致癌、致突變），增加治療難度，產生激素樣作用，甚至對生態環境造成污染。歷史上已有瘦肉精羊肉、喹諾酮蜂蜜、喹乙醇兔肉等事件［2］。此外，食品中藥物殘留的污染還加速了抗菌素耐藥性的產生，對全球公共健康構成嚴重威脅。因此，必須嚴格控制獸藥使用，確保食品安全［4］。

目前，針對獸藥殘留的檢測普遍采用膠體金免疫層析法（GLGA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）等方法［5-7］，這些方法在獸藥殘留檢測領域均得到了廣泛應用，并且具有一定的準確性和可靠性。

筆者運用通過式OasisPRiMEHLB固相萃取小柱對樣品進行預處理，并與超高效液相色譜串聯質譜法相結合，成功實現對魚肉中10種獸藥殘留的檢測，包括喹諾酮類（環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、諾氟沙星）和四環素類（四環素、土霉素、金霉素、多西環素）藥物，以期為獸藥殘留檢測工作提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 標準品。13種沙星混合標準品溶液，純度100%，北京曼哈格公司，批次號為F0032066。鹽酸-恩諾沙星-D5，純度99.8%，WITEGA，批次號為30174006。鹽酸-環丙沙星-D8，純度99.9%，ANPEL，批次號為2104943。諾氟沙星-D5，純度99.3%，ANPEL，批次號為M3960100。四環素，濃度100 μg/mL，北京曼哈格公司，批次號為E0030290。土霉素，濃度100 μg/mL，北京曼哈格公司，批次號為E0030290。金霉素，濃度100 μg/mL，北京曼哈格公司，批次號為E0030290。多西環素，濃度100 μg/mL，北京曼哈格公司，批次號為E0030290。

1.1.2 耗材。OasisPRiMEHLB（200 mg，6 mL）固相萃取柱，上海沃特世公司；0.22 μm PTFE過濾頭，美國安捷倫公司。

1.1.3 試劑。乙腈（質譜純，德國默克公司）；甲醇（質譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，美國默克公司），除已注明外，所用試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設備。

ShimadzuLC-30A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Milli-Q超純水儀（德國Millipore公司）；AB SCIEX 5500三重四極桿液質聯用儀（美國ABSciex公司）；MultiReax多通道旋渦混合器（德國Heidolph公司）；LYNX6000超速離心機（美國Thermo公司）；XPE205分析天平（瑞士Mettler公司）；全自動平行濃縮儀（廈門?？萍瘓F股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制。

1.2.1.1 標準品儲備液。13種沙星混合標準品溶液、四環素、土霉素、金霉素、多西環素為外購液體儲備液，濃度分別為0.1、100.0、100.0、100.0、100.0 μg/mL。

1.2.1.2 內標儲備液。精確稱取鹽酸-恩諾沙星-D5標準品12.34 mg，用乙腈定容至25 mL，配制成濃度為0.493 6 mg/mL的鹽酸-恩諾沙星-D5內標儲備液。精確稱取鹽酸-環丙沙星-D8標準品12.44 mg，用乙腈定容至25 mL，配制成濃度為0.497 6 mg/mL的鹽酸-環丙沙星-D8內標儲備液。精確稱取諾氟沙星-D5標準品12.71 mg，用乙腈定容至25 mL，配制成濃度為0.508 4 mg/mL的諾氟沙星-D5內標儲備液。

1.2.1.3 混合標準工作液。分別精確量取13種沙星混合標準品儲備液、四環素標準品儲備液、土霉素標準品儲備液、金霉素標準品儲備液、多西環素標準品儲備液0.02 mL置于2 mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，得到混合標準品中間液A。

精確量取1.0 mL混合標準品中間液A置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到混合標準品中間液B。

精密量取各內標儲備液0.20 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到混合內標中間液，濃度約為10 μg/mL。

精密量取混合內標中間液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到混合內標使用液，濃度約1 000 ng/mL。

1.2.2 樣品的前處理。

準確稱取約2 g的試樣（精確至0.01 g），并將其置于50 mL離心管中，隨后加入10 mL的90%乙腈水溶液，通過振蕩的方式提取30 min，確保充分混合和反應。試樣置于4 ℃的環境下，并以9 000 r/min離心5 min。離心后，取全部上清液采用primeHLB固相萃取柱收集全部的流出液，45 ℃的條件下使用氮氣吹干，使用2.0 mL的水-0.1%甲酸甲醇溶液來溶解殘渣。使用0.22 μm的PTFE過濾頭將溶液過濾至進樣瓶中，待進一步測定。

1.2.3 檢測條件。

1.2.3.1 色譜條件。色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；島津LC-30AD超高效液相色譜系統串聯AB SCIEX 5500 三重四極桿質譜儀（包括二元泵、在線脫氣機、自動進樣器）；流動相為0.1%甲酸混合水溶液（A）、0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液（V/V=1/1）（B）；梯度洗脫程序見表1；流速0.35 mL/min；進樣量2 μL。

1.2.3.2 質譜條件。離子源為TurboV電噴霧（ESI）離子源；電離方式為正離子、負離子；離子源溫度（TEM）為500 ℃；霧化電壓（IS）為5 500 V；霧化氣壓力（GS1）為275.79 kPa；輔助加熱氣壓力（GS2）為275.79 kPa；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓13 V；去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、定性離子對、定量離子對見表2。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

在獸藥殘留檢測過程中，采用超高效液相色譜串聯質譜法，甲醇和乙腈被普遍用作提取溶劑。通過試驗研究和對比，發現乙腈的提取效果明顯優于甲醇，且具有更高的回收率。此外，乙腈還能夠有效去除魚肉中的蛋白質，達到凈化的目的，進而降低基質效應。對比乙腈與乙腈-0.1%甲酸2種提取溶劑發現，乙腈-0.1%甲酸的使用能夠進一步提高提取效果。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 分離色譜柱的優化。該試驗選擇Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）2種色譜柱分別進行分離試驗，結果發現，Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱所檢測物質的分離效果更好［4］。

2.2.2 液相色譜條件的優化。

該試驗選用了2組流動相體系（甲醇+0.1%甲酸水和乙腈+0.1%甲酸水）進行梯度洗脫。通過對2組試驗結果的比較和分析，發現甲酸濃度在洗脫過程中起至關重要的作用。當甲酸濃度過低時，目標物質的信號強度會受到影響，可能導致結果不準確；而當濃度過高時，可能會引發峰形失真，如拖尾峰的出現，從而對分離效果產生不良影響［8］。綜合考慮各種因素，采用甲醇+0.1%甲酸水作為洗脫液。與乙腈+0.1%甲酸水相比，具備更高的響應值和更穩定的回收率，使得分離效果更加顯著和可靠［9］。

2.3 質譜條件的選擇

為了進行獸藥殘留分析，將1 mg/L的10種獸藥殘留標準物質分別注入電噴霧離子源（ESI）中，在ESI+和ESI- 2種模式下進行掃描，利用一級質譜（Q1）精確地測定每個物質的母離子的質荷比。隨后，通過二級質譜（Q2）掃描，篩選出2個峰形清晰且響應較高的離子作為子離子。為了確保最佳的檢測效果，該研究根據各種獸藥殘留的特性選擇了適當的ESI模式。進一步運用多反應監測掃描（MRM）技術優化了相關的質譜參數。詳細的優化結果參見表2。

2.4 凈化條件的選擇

水產品樣品主要包含蛋白質、脂肪和磷脂等成分。在提取過程中，雖然蛋白質可以通過沉淀和離心被去除，但脂肪和磷脂往往會與目標化合物一同被提取。這些共提取物質可能嚴重干擾質譜分析，并對UPLC系統的分析柱和其他組件造成污染，甚至影響質譜儀的正常運行。通過試驗比較，發現使用OasisPRiMEHLB小柱的過柱凈化方法，可以有效地從水產品提取物中去除脂肪和磷脂，同時，這種方法對獸藥回收率的影響較小，確保了分析的準確性和可靠性。

2.5 基質效應

動物源性食品富含脂肪和磷脂，這些成分在超高效液相色譜串聯質譜檢測過程中難以完全去除，可能引發顯著的基質效應，干擾試驗結果，進一步影響分析物的信號強度，最終導致定量結果的不準確性。評估目標物基質效應通常采用空白基質中添加標準溶液的峰面積與初始流動相中標準物質峰面積的比值。研究數據顯示，10種獸藥殘留均受到了不同程度的基質效應影響。為了降低這種影響，提高定量結果的準確性，該研究采用了基質標準曲線法，并建議同時使用同位素內標來進一步減少基質效應［10］。

2.6 方法學驗證

2.6.1 方法的檢出限、定量限和線性范圍。

將混合標準工作液配制成10～200 ng/mL的系列標準溶液，以質量濃度為橫坐標（X）、不同獸藥殘留各自的峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到線性方程和相關系數（R2）。根據信噪比（S/N）≥3確定檢出限（LOD），S/N≥10確定定量限（LOQ）。結果見表3，從表3可以看出，10種獸藥在10～200 ng/mL線性關系良好（R2gt;0.99），檢出限為0.24～4.07 μg/kg，定量限為0.07～1.22 μg/kg。以GB 31658.17—2021規定為準，該方法檢測出的10種獸藥殘留的定量限遠低于10 μg/kg的標準要求，可滿足日常獸藥殘留檢測的需求。

2.6.2 精密度與回收率。

選取10、50、100 μg/kg 3個濃度水平對空白樣品進行加標回收試驗，每個濃度水平平行測定2次，計算加標回收率及相對標準偏差（RSD），具體見表4。結果顯示，10種獸藥殘留的加標回收率為80.64%～117.52%，RSD為1.3%～6.6%。表明該方法精密度和準確度高、重現性好、準確可靠，適用于動物源性食品中多種獸藥殘留檢測。

2.7 實際樣品測定

為評價方法的適應性，采用該方法測定了魚肉（市售）中的獸藥殘留情況，結果表明，所有樣品均未檢出10種獸藥殘留成分。

3 結論與結論

經過對10種獸藥殘留檢測結果的分析，發現超高效液相色譜串聯質譜法展現出卓越的特異性，兼具簡捷、高效與高度靈敏的特點。對于復雜的樣品分離分析，此法亦能迅速應對，通過精選離子對模式，可有效削弱背景干擾，確保檢測結果的靈敏度和準確度，同時重現性表現優異。

在樣品預處理環節，該研究采用了80%乙腈提取法，并結合OasisPRiMEHLB固相萃取小柱進行富集與凈化，這能高效去除潛在污染物，如脂肪和磷脂等，這些污染物可能對色譜柱和儀器造成損害。因此，使用OasisPRiMEHLB小柱，可以在確保獸藥殘留回收率的同時，有效去除水產品提取物中的脂肪和磷脂。相較于傳統的正己烷脫脂法或硅膠C18凈化法，此方法表現出更高的凈化效率。

該試驗選用了0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相，通過梯度洗脫技術，成功降低了基質效應對目標峰的干擾。同時，為進一步提高定量結果的準確性，該研究采用了外標法來校正動物源性食品中脂溶性物質和基質效應可能產生的誤差。經過嚴格的方法學驗證，該方法的檢出限為0.24～4.07 μg/kg，定量限為0.07～1.22 μg/kg，回收率穩定在80.64%～117.52%，RSD控制在1.3%～6.6%，表明該方法精密度和準確度高、重現性好、準確可靠。與現行國家標準相比，該方法在性能上更勝一籌，完全滿足對動物源性食品中多種獸藥殘留的快速定性與定量篩查需求。

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基金項目 浙江省市場監督管理局雛鷹計劃核心項目（CY2022227）。

作者簡介 張翀宇（1993—），男，浙江衢州人，助理工程師，從事食品安全檢測研究。*通信作者，高級工程師，碩士，從事食品安全檢測研究。

收稿日期 2024-07-04