金盞花提取液對皮膚損傷的舒緩作用

目的：探究金盞花提取液保護皮膚損傷的舒緩作用。

方法：采用醇-水梯度提取法制備金盞花提取液，通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）分析物質成分。建立光誘導角質細胞損傷模型、LPS誘導巨噬細胞及斑馬魚損傷模型及C48/80誘導肥大細胞脫顆粒模型，檢測細胞或組織損傷后的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）及炎癥因子等指標。

結果：金盞花提取液能降低角質細胞光損傷后炎癥因子（PGE2、IL-6、COX2）的產生（P<0.001）；能通過MyD88信號通路降低LPS誘導巨噬細胞炎癥因子（IL-1β、IL-8）的產生（P<0.001）；能抑制C48/80刺激肥大細胞引起的脫顆粒現象（P<0.01）；能降低LPS刺激斑馬魚ROS的產生（P<0.001）。

結論：金盞花提取液具有保護皮膚損傷的舒緩作用。

關鍵詞：金盞花提取液；炎癥因子；氧化應激；舒緩作用

金盞花（Calendula officinalis L.）為菊科金盞花屬植物，含有類黃酮、三萜類化合物、糖苷、皂苷、類胡蘿卜素、揮發油、氨基酸、類固醇、甾醇和奎寧等成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗病毒等作用，它還應用于治療各種皮膚疾病，包括皮膚炎癥、開放性傷口和出血的撕裂傷[1]。

作為身體的外部屏障，皮膚不可避免地長期暴露在外部環境中，紫外線輻射、病原體或化學刺激物接觸等都可以導致皮膚炎癥[2-3]。炎癥因子能夠加速氧化應激反應，氧自由基會損傷細胞和降解結構成分，如膠原蛋白和彈性蛋白，炎癥因子與氧自由基能夠協同引起DNA的損傷，最終導致皮膚衰老[4]。

為研究金盞花提取液對皮膚炎癥的舒緩作用，本實驗通過紫外線（UV）誘導角質細胞、脂多糖（LPS）誘導巨噬細胞與斑馬魚、C48/80誘導肥大細胞構建皮膚損傷模型，檢測金盞花提取液對角質細胞與巨噬細胞炎癥因子的分泌、斑馬魚ROS含量與肥大細胞脫顆粒的影響。結果表明，金盞花提取液對光誘導損傷角質細胞的炎癥因子（PGE2、IL-6、COX2）與LPS誘導巨噬細胞的炎癥因子（IL-1β、IL-8）表達有顯著抑制作用，且實驗表明，金盞花提取液通過MyD88炎癥通路調控炎癥水平。此外，金盞花提取液還能夠使LPS誘導斑馬魚產生ROS的含量與C48/80誘導的肥大細胞脫顆粒率顯著下降。因此，金盞花提取液具有保護皮膚損傷的舒緩作用。

Part 1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

試劑：金盞花提取液（上海輝文生物技術股份有限公司）；角質形成細胞（中科院細胞庫）；巨噬細胞（中科院細胞庫）；肥大細胞（中科院細胞庫）；DMEM培養基（Gibco）；FBS （gibco）；雙抗（gibco）；PBS（生工）；地塞米松（sigma）；LPS （sigma）；BSA （Beyotime）；TritonX 100 （Beyotime）；COX2 （abcam）；MyD88 Antibody（Thermo）；二抗（abcam）；DAPI （abcam）；三卡因（aladdin）；胚胎培養液（上海費曦）；C48/80 （Sigma）；色甘酸鈉（Sigma）；PGE2 ELISA Kit （elabscience）；Human IL-6 ELISA Kit （elabscience）；Mouse IL-1β ELISA Kit（elabscience）；Mouse IL-8 ELISA Kit （酶聯生物）；ROS檢測試劑盒（Beyotime）。

儀器：高效液相色譜儀（Thermo）；質譜儀（Thermo）；酶標儀（Tecan）；倒置熒光顯微鏡（明美）；水浴鍋（SENCO）；旋渦震蕩儀（大龍）；電子秤（舜宇恒平）；移液器（大龍）；CO2培養箱（Thermo）；紫外輻照燈（飛利浦）；輻照劑量儀（泰瑪斯）；斑馬魚循環系統（杭州環特）；配魚缸（杭州環特）；生化培養箱（上海一恒）。

1.2實驗方法

1.2.1 金盞花提取液的制備及LC-MS組分分析

將干燥金盞花粉碎，按照1：10的料液比加入1，3-丙二醇溶液，于50℃保溫提取3 小時，過濾；按照1：40料液比在濾渣中加入70%乙醇，于50℃保溫提取4小時，過濾，按照相同料液比加入純水復提一次，將乙醇提取液與水提取液合并，濃縮至無乙醇，洗脫 AB-8 樹脂，收集純水洗液與 70%乙醇洗液，合并濃縮至無乙醇，將 1，3-丙二醇溶液提取液與濃縮洗液合并即得。

色譜條件：流速為0.3mL/min，進樣量為10μl，流動相采用0.1%甲酸/乙腈（B）-0.1%甲酸/水（A）。溶液的梯度洗脫程序見表1。

質譜條件：離子源溫度、毛細管溫度分別為310℃和 320℃，鞘氣流速、輔助氣流速分別為30單位和10單位，正、負離子模式噴霧電壓分別為2kV和2.8kV。分析采用數據以來掃描分析儀（DDA）。

1.2.2角質細胞急性毒性檢測

將角質細胞接種至96孔板，培養48-72h后待細胞生長至30%，以高糖DMEM完全培養基作為基礎培養體系，使空白組只含培養基，樣品組分別含15%、7.5%、5%、2.5%、1%和0.5%金盞花提取液，加樣后的96孔板放置于培養箱中培養。

培養48h后，棄上清，加250μl預熱的DPBS清洗細胞一次，棄去DPBS后加入250μl含中性紅的培養基于培養箱繼續孵育3h，用DPBS清洗一次，每孔加入100μl中性紅解析液，振蕩器上避光孵育20-45min，形成均一的溶液。靜置5min后，于酶標儀上540nm處讀取吸光度值。[5]

1.2.3光誘導角質細胞模型及炎癥因子的檢測

將角質細胞接種至24孔板，培養18-24h后待細胞生長至60%，對除空白外的實驗組換液為PBS采用UV誘導，誘導完成后棄去上清，以高糖DMEM完全培養基作為基礎培養體系，使空白組和模型組只含培養基，陽性對照組含100μg/mL地塞米松，樣品組分別含0.5%和1%金盞花提取液，加樣后的24孔板放置于培養箱中培養。

24h后按照ELISA方法檢測細胞上清中炎癥因子（PGE2、IL-6）的含量。細胞用PBS洗滌，0.5%TritonX-100通透20min，10%BSA封閉1h；PBS洗滌，加入COX2抗體溶液至覆蓋細胞，4℃孵育過夜；PBS洗滌，加入100μl二抗溶液至覆蓋細胞，于37℃孵育1h；加入DAPI孵育10min，PBS洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，所得熒光圖片采用 Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.2.4 LPS誘導巨噬細胞模型及炎癥因子的檢測

將巨噬細胞接種至24孔板，培養18-24h后待細胞生長至60%，以高糖DMEM完全培養基作為基礎培養體系，除空白外的實驗組加入1μg/mL LPS誘導6h，誘導完成后棄去上清，按照1.2.3的空白組、模型組、陽性對照組及樣品組分別給藥，培養24h后收集上清檢測炎癥因子（IL-1β、IL-8）及MyD88的含量，方法同1.2.3。

1.2.5 LPS誘導斑馬魚模型檢測ROS

收集野生型AB品系成年斑馬魚交配所得的胚胎，將孵育48hpf的斑馬魚幼魚健康個體分組放至24孔板中，空白組加入1mL胚胎培養液，其余組加入10μg/mL的1mL胚胎培養液，于28℃生化培養箱中誘導，誘導24h后，棄去孔內培養液，空白組與模型組加入1mL胚胎培養液，其余組分別加入含0.5%、1%金盞花提取液的1mL胚胎培養液，于28℃生化培養箱培養24h。

用試劑盒中的染色探針孵育1h，孵育結束后用PBS沖洗并在0.003%的三卡因（MS-222）麻醉液中麻醉，單個斑馬魚幼魚熒光強度用酶標儀進行量化，使用熒光顯微鏡觀察染色幼魚的圖像。

1.2.6 C48/80誘導肥大細胞脫顆粒模型

收集肥大細胞，以無血清高糖DMEM培養基作為基礎培養體系，將細胞稀釋至6×104/mL，按照細胞溶液與樣品溶液為1：1的比例接種至24孔板，使得每孔約3×104個細胞，空白組只含基礎培養體系，模型組含25μg/mL C48/80，陽性對照組含25μg/mL C48/80與1mg/mL色甘酸鈉，樣品組含25μg/mL C48/80與對應濃度（0.5%及1%）的金盞花提取液。培養30min，冰浴終止反應。在顯微鏡下觀察各組細胞脫顆粒情況并拍照。采用 ImageJ軟件統計。

1.2.7統計學處理

圖片數據采用ImageJ軟件分析，定量數據以均數±標準差（x±s）表示，用GraphPad Prism8軟件進行ANOVA方差分析。

Part 2結果

2.1 金盞花提取液的LC-MS組分分析結果

LCMS數據（見圖1、圖2）經Compound discover軟件分析比對，保留匹配度較高的化學成分，峰面積占比高于1 %的化學成分見表2。其中，金盞花提取液的主要活性成分為金盞花苷E，可通過抑制ROS的產生及抑制LPS誘發的炎癥反應，為金盞花提取液具有舒緩功效提供了物質基礎[7-8] 。

2.2角質細胞急性毒性結果

金盞花提取液在1%和0.5%濃度下的細胞活力均高于90%，可見無細胞毒性，故后續實驗在該濃度下進行（見表3）。[5-6]

2.3光誘導角質細胞模型檢測炎癥因子

皮膚過度暴露于紫外線輻射可導致皮膚老化和皮膚病，UVB可以到達表皮和真皮表層，對皮膚造成直接傷害，UVA可以深入滲透到表皮和真皮的基底層，并誘導與活性氧（ROS）過量產生相關的細胞損傷和光老化。作為皮膚最外層的屏障，角質形成細胞是紫外線輻射的主要目標。UVA 和 UVB 照射都會誘發氧化應激和炎癥，從而破壞皮膚屏障并在皮膚上產生皺紋，從而導致皮膚損傷。[9]

角質細胞受到刺激后可產生多種細胞因子和炎癥介質，在皮膚的免疫和炎癥反應中發揮重要作用[10]。白細胞介素6（IL-6） 在感染和組織損傷時迅速產生，可通過免疫反應促進宿主防御[11]。前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是花生四烯酸在環氧合酶（COX）催化下產生，能夠引發疼痛、發熱及炎癥等多種反應[12-13]。

與空白組相比，模型組炎癥因子的分泌顯著增加（p<0.001）；與模型組相比，陽性組炎癥因子的分泌顯著降低（p<0.001）；0.5%及1%金盞花提取液組的炎癥因子均顯著降低（p<0.001），對PGE2的降低率分別為24.21%和32.72% （見圖3），對IL-6的降低率分別為23.56%和34.25% （見圖4），對COX2的降低率分別為33.63%、49.61% （見圖5、圖6）。

2.4 LPS誘導巨噬細胞模型檢測炎癥因子

白細胞介素-1β （IL-1β）由先天免疫系統細胞（如單核細胞和巨噬細胞）受到刺激時產生，是一種促細胞炎癥因子，白細胞介素-8由巨噬細胞等各種組織細胞暴露于炎癥刺激（如白細胞介素-1）時釋放，二者對細胞炎癥的調節作用至關重要。[14-15]

與空白組相比，模型組炎癥因子的分泌顯著增加（p<0.001）；與模型組相比，陽性組炎癥因子的分泌顯著降低（p<0.001）； 0.5%及1%金盞花提取液組的炎癥因子均顯著降低（p<0.001），對IL-1β的降低率分別為28.05%和35.56% （見圖7），對IL-8的降低率分別為24.28%和28.51% （見圖8）。

2.5 LPS誘導巨噬細胞模型炎癥通路研究

MyD88信號通路是機體炎癥體系中的重要途徑，廣泛存在于各種組織細胞中，參與多種疾病的發生與調控。MyD88是經典炎癥通路TLR/MyD88/NF-κB中的重要節點，能被TLR （一種能夠識別多種類型病原并引起機體炎癥免疫應答的蛋白）激活，且在LPS活化通路中起重要作用[16-17]。

與空白組相比，模型組MyD88的表達量顯著提高（p<0.001）；與模型組相比，0.5%和1%金盞花提取液組MyD88表達量顯著降低，降低率分別為16.52% （p<0.05）和26.57% （p<0.01） （見圖9、圖10）。

2.6 LPS誘導斑馬魚模型檢測ROS

LPS可誘導斑馬魚產生炎癥，使炎癥因子和ROS水平升高[17]，活性氧可激活無數信號通路，能夠介導炎癥反應，使膠原蛋白的生成減少，加速皮膚老化并被認為是內在衰老的主要原因[18]。

與空白組相比，模型組中ROS含量顯著增加（p<0.001）。與模型組相比，0.5%和1%金盞花提取物均可以顯著降低ROS含量（p<0.001），下降率分別為29.07%和66.67%（見圖11、圖12）。

2.7 C48/80誘導肥大細胞脫顆粒模型

肥大細胞是一種分布在身體不同部位的免疫細胞，能夠釋放活性介質以相應不同的刺激，如C48/80可刺激肥大細胞釋放組胺引起細胞脫顆粒，其在超敏反應及神經性疼痛的發病機制中起著重要作用[20]。

0.5%及1%金盞花提取液均可以使肥大細胞脫顆粒率顯著下降，下降率分別為25.52%（p<0.01）及38.07% （p<0.001） （見圖13、圖14）。

Part 3結論

本研究采用多種炎癥損傷實驗模型，探討了金盞花提取液的抗炎舒緩作用。結果表明，金盞花提取物對LPS和C48/80等經典刺激信號及紫外線造成的損傷具有一定程度的抗炎及舒緩作用，對MyD88通路的研究提示金盞花提取物的抗炎作用廣泛，為金盞花提取物的開發與應用提供了更深入與全面的參考依據。

作者介紹

第一作者 王璐君：助理工程師，供職于上海輝文生物技術股份有限公司

第二作者 劉玉晨：中級工程師，供職于上海輝文生物技術股份有限公司

通訊作者 費維成：高級工程師，供職于上海輝文生物技術股份有限公司，郵箱：fwc95135@21wenda.com

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