肉桂和丁香中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選

摘要：為探究藥食同源植物肉桂和丁香中具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的潛在活性物質，采用體外酶活性模型實驗測定肉桂和丁香甲醇粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，進一步采用生物活性色譜和超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS/MS）分析其中的活性物質。結果表明，肉桂和丁香甲醇粗提物具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制作用，IC50分別為（50.0±0.08） μg/mL和（2.19±0.17） μg/mL，抑制作用明顯高于陽性對照阿卡波糖［IC50=（264.37±2.73） μg/mL］。生物活性色譜分析表明多酚類物質為主要活性成分。UPLC-QTOF-MS/MS分析揭示丁香中的黃酮類物質、肉桂中的肉桂酸和2-甲氧基肉桂醛可能為潛在的活性成分。肉桂和丁香在預防和治療糖尿病的功能性利用方面具有一定潛力。

關鍵詞：藥食同源植物；α-葡萄糖苷酶；生物活性色譜；超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS/MS）

中圖分類號：R284.1" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.017 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening of α-glucosidase inhibitors in Eugenia caryophyllata and Cinnamomum cassia

XU Cong

（Ankang Municipality Agricultural Science Research Institute， Ankang" 725000， Shaanxi， China）

Abstract： The purpose of this study was to explore the potential constituents responsible for α-glucosidase inhibitory activity of medicine food homologous herbs Eugenia caryophyllata and Cinnamomum cassia. The α-glucosidase inhibitory effect of crude extracts from Eugenia caryophyllata and Cinnamomum cassia were preliminary determined by in vitro enzyme activity experiment. The corresponding bioactive constituents were determined by the combined use of high-resolution inhibition profiling and ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-QTOF-MS/MS）. The results showed that， crude methanol extracts of Eugenia caryophyllata and Cinnamomum cassia displayed considerable inhibition towards α-glucosidase with IC50 values of （50.0±0.08） μg/mL and （2.19±0.17） μg/mL， respectively， more active than the positive control acarbose ［IC50=（264.37±2.73） μg/mL］. The high-resolution inhibition profiles pointed out that polyphenols were correlated with α-glucosidase inhibitory activity. In addition， flavonoids from Eugenia caryophyllata， cinnamic acid and 2′-methoxy cinnamaldehyde from Cinnamomum cassia were considered as the possible inhibitors by the careful analysis of UPLC-QTOF-MS/MS data. The results supported further research with the aim of developing Eugenia caryophyllata and Cinnamomum cassia into functional food for prevention and management of T2D and T2D-related complications.

Key words： medicine food homologous herbs; α-glucosidase; high-resolution inhibition profiling; ultra high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-QTOF-MS/MS）

2型糖尿病（T2DM）作為慢性非傳染性疾病已成為威脅人類生命健康的重大疾病[1]。國際糖尿病聯盟（IDF）最新數據顯示，截至2019年中國約有1.27億糖尿病患者，發病率高達11%，而每年因糖尿病及其并發癥導致的死亡人數約為83.4萬[2]，T2DM已成為中國主要的公共健康危機之一。伴隨中國人口老齡化，糖尿病治療給個人和社會造成的經濟負擔越來越重，飲食干預成為最基本、最重要的治療策略，而食用藥食同源性降糖植物被認為是低成本、安全、療效穩定的飲食干預方式，在降血糖的同時可預防相關并發癥[3]。α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）是位于小腸刷狀緣上皮細胞的膜結合酶，是降糖中藥的重要作用靶標之一，通過抑制其活性可延緩多糖水解，降低餐后血糖濃度[4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑（AGI）在中國糖尿病患者臨床治療中使用占比超過50%，在延長患者生命周期以及提高生活水平方面發揮重要作用[5]。

本研究以藥食同源植物肉桂和丁香為研究對象，探討其中具有抑制 α-葡萄糖苷酶的降糖活性成分。丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）的干燥花蕾，目前關于丁香α-葡萄糖苷酶的抑制作用主要是以80%乙醇和水粗提物為研究對象[6]，但具體活性成分的報道甚少。肉桂為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮，許芹永[7]通過傳統活性追蹤方法確定其α-葡萄糖苷酶的抑制作用主要與桂皮醛、肉桂酸和鞣質有關，雖然傳統活性追蹤法是篩查中藥藥效成分的主要方法，但該方法存在費時、費力、低效等弊端[8]。為解決上述問題，深入挖掘肉桂和丁香中的AGI，本研究采用生物活性色譜與超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS/MS）聯用方法，在生物活性色譜中，通過將待測樣品的HPLC色譜圖與抑制作用譜圖結合，直接指認出HPLC色譜圖中具有抑制作用的活性成分[9]。該方法已成功用于降糖成分α-葡萄糖苷酶抑制劑[10]、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制劑[11]和α-淀粉酶抑制劑的篩查試驗中[12]。相較于傳統的活性追蹤方法，生物活性色譜的篩查效率和分辨率更為優異。因此，本研究擬利用生物活性色譜法篩選潛在的目標抑制劑，進一步應用UPLC-QTOF-MS/MS分析鑒定其活性成分，為藥食同源植物肉桂和丁香預防和治療糖尿病的功能性利用提供研究支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

肉桂和丁香（滄州神農居藥店），阿波卡糖、α-葡萄糖苷酶、對硝基-α-D-葡萄糖吡喃苷（pNPG）（美國Sigma-Aldrich公司），甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國Merck公司），乙酸乙酯、甲醇、氫氧化鈉、石油醚（分析純，天津方正試劑廠），DMSO、NaH2PO4、Na2HPO4（分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

FA2204N電子天平（上海菁海儀器有限公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司），SYNERGY H1酶標儀（美國Biotek公司），Agilent1100分析型HPLC（配有可變波長紫外檢測器）、Agilent 1290Infinity-6530B液相-質譜聯用儀（美國Agilent公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 甲醇粗提物的制備 參照文獻方法[13]并適當進行改進，將肉桂和丁香用粉碎機粉碎后，取粉末10 g，以W∶V=1∶20 加入甲醇，室溫下超聲提取2 h，靜置過濾除掉濾渣，濾液減壓濃縮除去有機溶劑得到粗提物。將其超聲溶于90%甲醇水溶液中，用石油醚萃取去除掉其中的脂類成分，繼續減壓濃縮得去脂粗提物，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測定 參照相關文獻[8]，在96孔板中加入20 μL待測樣品（DMSO為溶劑），80 μL的磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）和0.125 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，混勻。振蕩2 min，在28 ℃孵育10 min后加入20 μL 10 mmol/L pNPG溶液，測定產物在405 nm處吸光度，反應時間35 min，測定次數為70次，并以10% DMSO為空白對照，阿卡波糖為陽性對照，抑制率計算公式如下所示：

[抑制率=SlopeDMSO405 nm-Slopesample405 nmSlopeDMSO405 nm×100%]

式中：[SlopeDMSO405 nm]為空白對照的反應速率，[Slopesample405 nm]為待測樣品的反應速率。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性色譜的建立 取適量肉桂和丁香粗提物，溶于甲醇溶液中得濃度為20 mg/mL的待測溶液。

色譜條件：Agilent1100標準型高效液相色譜儀。色譜柱：Phenomenex（150mm×4.6 mm，5 μm），以5% 乙腈溶液（0.1%甲酸）為流動相A，以95%乙腈溶液（0.1%甲酸）為流動相B，梯度洗脫：0～30 min 0%～100% B，30～32 min 100% B，32～35 min 100%B～0%B，35～37 min 0%B。進樣量15 μL，流速0.8 mL/min。檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長254 nm。

將待測樣品HPLC洗脫液收集到兩個96孔板中，最后一列（8個孔）停止收集，供空白對照使用。待 96孔板干燥后測定每孔的抑制率，測定方法如“1.3.2”所述。按照抑制率公式計算每孔抑制率，以該值為Y軸，以對應保留時間為X軸得抑制圖譜，并與HPLC圖譜對應指認出活性成分。

1.3.4 UPLC-QTOF-MS/MS條件

1）色譜條件：安捷倫1290Infinity-6530B型液相-質譜聯用儀。色譜柱：安捷倫EclipsePlus（C18，100×2.1 mm，1.8 μm），流動相與洗脫條件與“1.3.3”一致。

2）質譜條件：電噴霧（ESI）離子源；正離子檢測；源電壓：3.5 kV；干燥氣體溫度：310 ℃；干燥氣體流速：9 L/min；鞘氣和輔助氣體：氮氣；碰撞氣體：氦氣；采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z 100～1 200。霧化器壓力：35 kPa。

2 結果與分析

2.1 肉桂和丁香甲醇粗提物的生物活性色譜

譚敏華等[6]報道該兩種植物的80%乙醇粗提物在濃度為5 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到90%以上，進一步證實肉桂和丁香的活性物質可通過抑制α-葡萄糖苷酶的水解活性發揮降糖作用。本研究研究了不同濃度下肉桂和丁香甲醇提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，運用GraphyPad Prism軟件繪制IC50曲線圖，具體見圖1。其抑制曲線表現出濃度依賴關系，測得IC50分別為（50.88±0.80） μg/mL和（2.19±0.17） μg/mL，均好于陽性對照阿卡波糖［（264.37±2.73） μg/mL］。

為進一步篩查肉桂和丁香甲醇粗提物的潛在活性成分，建立生物活性色譜如圖2所示。在丁香中，6～15 min的餾分表現出接近100%的抑制活性，在肉桂中，10～18 min的餾分也表現出較強的抑制活性。在Kongstad等[14]對Caloncoba gilgiana乙醇粗提物的真菌質膜H+-ATPase抑制活性圖譜中，也出現類似的抑制寬峰，推測其可能為多酚類物質。多酚類物質溶于水、乙醇等溶劑，在此次試驗中采用甲醇為溶劑進行超聲提取，不可避免會存在多酚類物質，因此初步推測肉桂和丁香甲醇粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性主要是由多酚物質引起的。龍曉珊等[15]曾報道肉桂多酚α-葡萄糖苷酶的抑制活性，與本次研究結果相吻合。

2.2 肉桂和丁香甲醇粗提物的總離子流

由于多酚物質較強的抑制活性，掩蓋了其他成分可能存在的α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此試驗采用HPLC-QTOF-MS/MS對成分進行定性分析，揭示其潛在的活性成分，肉桂和丁香甲醇粗提物正離子模式下的總離子流（Total ion chromatogram，TIC）如圖3所示，各成分的保留時間、準分子離子峰和二級質譜的碎片峰見表1。

在丁香總離子流圖中，色譜峰1準分子離子峰 m/z 為355.103 8[M+H]+和377.085 1[M+Na]+，推定其相對分子質量為355，參考文獻[16]確定其為丁香苷II。色譜峰2準分子離子峰 m/z 為355.102 8[M+H]+和377.084 3[M+Na]+，推定其相對分子質量為355，參考文獻[16]確定其為丁香苷I。色譜峰3準分子離子峰 m/z 為479.083 8[M+H]+和501.065 3[M+Na]+，確定其相對分子質量為478，準分子離子峰m/z 479.083 8丟失一分子葡萄糖醛酸得到特征碎片離子303.050 2[M+H-176]+，推測化合物3為槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷[17]。色譜峰4準分子離子峰 m/z 為479.119 6[M+H]+和979.214 5[2M+Na]+，推定其相對分子質量為478，準分子離子峰丟失一分子葡萄糖得到特征碎片離子317.066 3[M+H-162]+，該化合物苷元相對分子質量比槲皮素多14，推測化合物4為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷[17]。色譜峰5準分子離子峰m/z為493.098 9[M+H]+和515.241 0[M+Na]+，確定其相對分子質量為492，準分子離子峰丟失一分子葡萄糖酸得到特征碎片離子317.066 2[M+H-176]+，苷元部分與4相同，且極性相近，推測化合物5為異鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸苷。色譜峰8的準分子離子峰m/z 為493.124 8[M+H]+，確定其相對分子質量為492，準分子離子峰進一步丟失一分子葡萄糖得到特征碎片離子331.055 4[M+H-176]+，苷元相對分子質量比異鼠李素多14，推測化合物8為鼠李秦素-3-O-葡萄糖苷[18]。色譜峰9準分子離子峰m/z為303.041 2[M+H]+，其特征碎片離子275.273 5[M+H-CO]+，推測化合物為槲皮素[19]。色譜峰10準分子離子峰 m/z 為318.300 8[M+H]+，并沒有特征碎片離子出現，可能與準分子離子的極性和質譜碰撞能量有關，推測其為楊梅素[20]。以上化合物在丁香的成分研究中均有報道，其中槲皮素表現出較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，其IC50為0.055 mg/mL[21]。

在肉桂的甲醇粗提物中，色譜峰1準分子離子峰 m/z 為149.053 6[M+H]+，推定其相對分子質量為148，準分子離子失去羥基后得到特征碎片離子131.048 1[M+H-OH]+，進一步裂解丟失CO得到碎片離子103.054 5[M+H-OH-CO]+，推測化合物為肉桂酸[22]，許芹永[7]報道了其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并測定其IC50為286.22 μg/mL。色譜峰2準分子離子峰 m/z 為163.071 6[M+H]+，推定其相對分子質量為164，準分子離子失去CO后得到特征碎片離子135.079 5[M+H-CO]+，再重排裂解丟失-C2H4得到碎片離子107.048 3[M+H-CO-C2H4]+，進一步丟失甲氧基得到77.038 3[M+H-CO-C2H4-OCH3]+的碎片離子，推測其為2-甲氧基肉桂醛[23]。

3 小結

本研究利用體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選模型對藥食同源植物肉桂和丁香的抑制活性成分進行測定，結果表明肉桂和丁香甲醇粗提物表現出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，強于陽性對照阿卡波糖。生物活性色譜和UPLC-QTOF-MS/MS聯用表明肉桂和丁香甲醇粗提物抑制活性與多酚類物質有關。同時丁香中的黃酮類和肉桂中的肉桂酸和醛類物質也可能發揮抑制作用，雖然具體活性成分還有待進一步研究，但本研究為肉桂和丁香中α-葡萄糖苷酶抑制作用成分的研究提供了參考依據。以上結果表明生物活性色譜和UPLC-QTF-MS/MS聯用可用于篩選和鑒定降糖藥食兩用植物中的潛在活性物質，而且藥食兩用植物肉桂和丁香可以作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的天然來源。

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