微波輔助提取松乳菇多糖及其抗氧化性研究

摘要：以松乳菇（Lactarius deliciosus）為原材料，選取料液比、微波功率、微波時間、水浴溫度、水浴時間5個變量進行單因素試驗，利用響應面分析對微波輔助提取松乳菇多糖工藝進行優化，并對其抗氧化性進行研究。結果表明，最佳提取工藝條件為料液比1∶35 g/mL、微波功率640 W、微波時間25 s、水浴溫度90 ℃、水浴時間120 min，在該條件下松乳菇多糖的提取率可達（4.61±0.03）%；松乳菇多糖具有良好的抗氧化性，當松乳菇多糖的質量濃度為1.0 mg/mL時，其總還原能力和DPPH自由基清除率達到最大。

關鍵詞：松乳菇（Lactarius deliciosus）；微波輔助提??；多糖；抗氧化活性；響應面分析

中圖分類號：TQ281" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0138-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.022 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on microwave-assisted extraction of polysaccharide from Lactarius delicious and

its antioxidant activity

JIANG Shu， ZHENG Yu-feng， WU Fang， ZHANG Jin-fan， XIONG Jia-yi ， HU Ting

（College of Biology and Agricultural Resources， Huanggang Normal University/Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization/Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristice Resources Exploitation of Dabie Mountains， Huanggang" 438000，Hubei， China）

Abstract： Lactarius delicious was used as raw material， the material-liquid ratio， microwave power， microwave time， water bath temperature， and water bath time were selected as the variables for the single-factor test， and the Lactarius delicious polysaccharide microwave-assisted extraction process was optimized by using response surface analysis， and its antioxidant activity was studied. The results showed that the best extraction process condition was the material-liquid ratio of 1∶35 g/mL， microwave power of 640 W， microwave time of 25 s， water bath temperature of 90 ℃， and water bath time of 120 min. Under this condition， the extraction rate of polysaccharide from Lactarius delicious was （4.61±0.03）%. The polysaccharide from Lactarius delicious had good antioxidant activity. When the mass concentration of polysaccharide from Lactarius delicious was 1.0 mg/mL， its total reducing ability and DPPH radical scavenging rate reached the maximum.

Key words： Lactarius delicious; microwave-assisted extraction; polysaccharides; antioxidant activity; response surface analysis

松乳菇（Lactarius deliciosus （L.） Gray）多糖具有較顯著的抗氧化活性[1]，同時，松乳菇多糖在提高免疫力[2]、抑菌[3]、降血糖[4]、動物醫學抗脂質氧化、影響神經內分泌調節網絡[5]等方面具有較高的研究價值。松乳菇廣泛分布于長江中下游地區，出菇時對溫度和土壤濕度要求較高，因而較難實現人工養殖[6]。目前市售松乳菇多以野生生長、人工采摘為主，價格較昂貴。食用真菌多糖在日常生產生活中有廣闊的應用范圍，如農業[7]、藥學[8]、食品加工[9，10]等行業。同時，食用真菌多糖在調節免疫力、促進B細胞和T細胞增殖分化[11]、抑菌[12]、降血糖[13]等方面有重要作用。

當前最常用于提取真菌多糖的方法有水提醇沉法、酶提法、超臨界和亞臨界萃取法、超聲輔助法、微波輔助法等[14]。水提醇沉法需要耗費較長時間，提取率較低。酶提法由于酶具有專一性，故不同菌種所需的酶不同，實際操作中成本過高[15]。微波輔助提取技術具有許多優點，包括設備簡單、萃取效率高、選擇性強、適用范圍廣、省時省力。近年來國內外微波工藝發展迅速，國內的微波技術已經應用到揮發油、多糖、酚類、黃酮、萜類、生物堿、有機酸、甾醇等生物活性分子的提取中[16]。國內外有關松乳菇多糖的提取方法大多采用水提醇沉法、酶法提取等方法[17]。本研究以松乳菇為原材料，對微波輔助提取松乳菇多糖工藝進行優化，并以總還原能力和DPPH自由基清除率對其抗氧化性進行評價，為松乳菇多糖的進一步開發利用提供一定的指導與依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥松乳菇，湖南省吉首市；濃硫酸，天津市凱通化學試劑有限公司；無水三氯化鐵，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸，上海賽創科技有限公司；鐵氰化鉀，北京市索萊寶科技有限公司；無水乙醇，成都科龍化工試劑廠；三氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、苯酚，天津天力化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（自由基），梯希愛（上海）化成工業有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外可見分光光度計，上海美析儀器有限公司；H/T18MM型臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；LGJ-12型真空冷凍干燥機，北京市松源華興科技發展有限公司；WBFY-201型微電腦微波化學反應器、YRE2000A型真空旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；PH-3C型電子pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的提取 將已經干燥的松乳菇粉碎過篩，留粉渣備用；準確稱取一定質量的松乳菇粉于燒杯中，并按特定比例加入去離子水，將松乳菇粉與去離子水充分混勻，再用微波進行處理，在恒溫條件下進行水浴，水浴結束后，以4 000 r/min的速度離心15 min，取上清液，即可得到粗多糖溶液。將濾液進行旋轉蒸發，濃縮至原來體積的1/3，加入現在體積3倍的無水乙醇，以4 000 r/min的速度離心15 min，取下層沉淀，經冷凍真空干燥后，可得粗多糖[18]。

1.3.2 多糖提取率的測定

1）標準曲線制定。采用硫酸-苯酚法[19]測定上清液中的多糖含量，得到標準曲線線性回歸方程：A=0.819 5c+0.002 6，線性相關系數R2=0.999 5。

2）樣品測定。按照標準樣品的處理方法，測量樣品處理后的吸光度，代入標準曲線線性回歸方程得多糖濃度（c）。按照下式計算松乳菇多糖提取率（%）。

提取率 = [c×n×vm×100%] " " " " " " " " （1）

式中，c為多糖濃度（mg/mL）；n為稀釋倍數；v為定容體積（mL）；m為松乳菇粉末質量（g）。

1.3.3 單因素試驗 在料液比為1∶30 g/mL、微波時間為30 s、微波功率為640 W、水浴時間為120 min、水浴溫度為90 ℃的基礎上進行單因素試驗，分別探究不同料液比、微波功率、微波時間、水浴時間、水浴溫度對松乳菇多糖提取率的影響，每次試驗平行重復3次，結果取平均值。

1.3.4 響應面法優化提取 以單因素試驗的結果為基礎，將料液比、微波功率、微波時間、水浴時間4個因素作為自變量，將松乳菇多糖提取率作為響應值，使用Box-Behnken法設計響應面試驗方案，經分析試驗數據后得出微波輔助提取松乳菇多糖的最佳條件。測試因素和水平見表1。

1.3.5 松乳菇多糖抗氧化活性的測定

1）總還原能力測定。使用鐵氰化鉀還原法[20]，測定不同質量濃度多糖溶液的總還原能力，每組平行試驗重復3次，并以相同濃度維生素C溶液作為陽性對照，吸光度越大，表示待測物的總還原能力越強。

2）DPPH自由基清除率的測定。參考郭華等[21]的方法，測定不同濃度多糖溶液的DPPH自由基清除率，并以相同濃度的維生素C溶液作為陽性對照，重復平行試驗3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對松乳菇多糖提取率的影響 固定微波功率640 W，微波時間30 s，水浴時間120 min，水浴溫度90 ℃，改變料液比。由圖1可知，當料液比在1∶25～1∶35 g/mL范圍內，多糖提取率隨溶劑體積的增加而逐漸上升；當料液比為1∶35 g/mL時，多糖提取率達到最大，為4.51%；當溶劑體積繼續增加時，多糖提取率出現下降趨勢，這是因為隨著溶劑體積的繼續增加，提取時間固定不變，需要更多的微波能才能滿足松乳菇多糖提取率的最大化，因此導致松乳菇多糖提取率略微降低[22]。

2.1.2 微波功率對松乳菇多糖提取率的影響 固定微波時間30 s，料液比1∶35 g/mL，水浴時間120 min，水浴溫度90 ℃，改變微波功率。由圖2可知，當微波功率為80～640 W，微波功率越高，多糖的提取率越大；在微波功率為640 W時，松乳菇多糖提取率達到最大，為4.42%；隨著微波功率繼續增加，松乳菇多糖提取率出現下降趨勢，這是由于微波功率過大，引起溫度的劇烈升高，導致松乳菇多糖的結構破壞，進而導致松乳菇多糖提取率降低[23]。

2.1.3 微波時間對松乳菇多糖提取率的影響 固定料液比1∶35 g/mL，微波功率640 W，水浴時間120 min，水浴溫度90 ℃，改變微波時間。由圖3可知，當微波時間在10～30 s范圍內，多糖提取率隨微波時間的延長而不斷提高；當微波時間為30 s時，松乳菇多糖提取率達到最大，為4.23%；微波時間繼續增加時，多糖提取率呈近乎直線下降的趨勢，由于微波時間過長導致溫度過高，多糖結構被破壞，生物活性及分子穩定性降低，從而導致松乳菇多糖提取率出現下降趨勢[24]。

2.1.4 水浴時間對松乳菇多糖提取率的影響 固定料液比1∶35 g/mL，微波功率640 W，微波時間30 s，水浴溫度90 ℃，改變水浴時間。由圖4可知，當水浴時間在60～120 min范圍內，多糖的提取率隨時間的增加不斷變大；當水浴時間升至120 min時，松乳菇多糖提取率達到最大，為4.55%；當水浴時間繼續增加時，松乳菇多糖提取率呈下降趨勢，這可能是由于長時間的水浴導致松乳菇多糖被水解，進一步導致松乳菇多糖提取率下降[25]。

2.1.5 水浴溫度對松乳菇多糖提取率的影響 固定料液比1∶35 g/mL，微波功率640 W，微波時間30 s，水浴時間120 min，改變水浴溫度。由圖5可知，松乳菇多糖提取率隨水浴溫度的提高不斷上升；并在100 ℃時達最大值4.64%?？紤]到水浴溫度過高，多糖容易分解成單糖且容易失活，故本研究選取90 ℃作為最佳水浴溫度[26]。

2.2 響應面試驗優化

2.2.1 Box-Behnken模型的建立與分析 考慮到多糖提取率隨水浴溫度的增加而呈上升趨勢，而當水浴溫度過高，多糖結構容易受到破壞，因此，本研究直接選90 ℃為最佳水浴溫度。選取料液比、微波功率、微波時間、水浴時間4個因素設計響應面試驗。

表2是采用Design-Expert 8.0軟件設計的試驗組合以及對應試驗得出的數據結果。通過統計分析軟件，對表2中的數據進行二次多項式回歸方程擬合分析，得出擬合方程：

Y = 4.59 + 0.1A + 0.007 5B - 0.089C + 0.10D-0.043 AB - 0.11AC - 0.042AD - 0.10BC - 0.098BD+0.050CD-0.19A2-0.12B2-0.15C2-0.31D2。

對該模型進行方差分析，由表3可知，模型的F值為24.79，說明模型中自變量與因變量之間存在顯著的線性關系；該模型Plt;0.000 1，表明響應面回歸模型極度顯著，可以較好地反映4個因素與多糖提取率之間的關系；失擬項P不顯著，說明實際測量值與模型擬合度較高；相關系數R2=0.961 2，RAdj2=0.922 5，說明該試驗誤差較小。綜上，可運用該模型對松乳菇多糖提取率與4個影響因素的關系進行分析和檢驗。在一次項中，A和D對多糖提取率的影響極度顯著（Plt;0.000 1），C高度顯著（Plt;0.05），B不顯著；在交互項中，AC、BC、BD對多糖提取率有顯著影響，AB、AD、CD對多糖提取率無顯著影響；在二次項中，A2、C2、D2對多糖提取率的影響都表現為極度顯著（Plt;0.000 1），B2為高度顯著。通過對各試驗因素的方差分析與比較，可得出各試驗因素對松乳菇多糖提取率的影響程度為Dgt;Agt;Cgt;B。

通過統計分析軟件Design-Expert 8.0對試驗的結果進行統計與分析，得出微波輔助提取松乳菇多糖的最佳工藝條件為料液比1∶36.6 g/mL，微波功率618.6 W，微波時間26 s，水浴時間123.2 min，該條件下多糖提取率的理論值為4.63%。

2.2.2 響應面分析 如圖6所示，由各因素之間的交互影響圖可以直觀地反映因素之間的交互影響關系程度。通過對曲面的傾斜度進行觀察與比較，可以得出兩個交互因素對響應值的影響程度大小。坡度陡，則表示該因素對松乳菇多糖提取率的影響大，否則反之。由圖6a可知，A對多糖得率的影響大于B；由圖6b可知，A對多糖得率的影響大于C；由圖6c可知，C對多糖得率的影響大于B；由圖6d可知，D對多糖得率的影響大于A；由圖6e可知，D對多糖得率的影響大于B；由圖6f可知，D對多糖得率的影響大于C。綜上所述，對松乳菇多糖提取率的影響因素的主次排序為Dgt;Agt;Cgt;B，與上述方差分析結果一致，進一步論證了模型的可行性。

2.2.3 驗證試驗 對實際操作和微波輻射儀器功率的局限性進行了分析，將提取的工藝條件重新調整為料液比1∶35 g/mL、微波功率640 W，微波時間25 s，水浴時間120 min，水浴溫度為90 ℃。在該提取工藝條件下，經過重復3次平行試驗，得出多糖實際的提取率為（4.61±0.03）%，與預測值相差不大。

2.3 松乳菇多糖抗氧化活性

2.3.1 總還原能力 由圖7可知，當松乳菇多糖溶液濃度在0.2～0.8 mg/mL時，隨著溶液濃度增大，松乳菇多糖的還原能力呈上升趨勢，而在0.8～1.0 mg/mL濃度范圍內，濃度繼續增大，上升趨勢變緩。當多糖的質量濃度為1.0 mg/mL時，吸光度達到最大值，松乳菇多糖的總還原能力達到最大，但與同濃度的維生素C溶液作比較，松乳菇多糖的總還原能力遠低于維生素C。

2.3.2 DPPH自由基清除能力 由圖8可知，當松乳菇多糖溶液濃度在0.2～1.0 mg/mL時，隨著松乳菇多糖濃度的提高，DPPH自由基的清除能力也隨之增加，兩者之間存在著明顯的線性關系；試驗濃度在1.0 mg/mL時，松乳菇多糖對DPPH自由基的清除能力達到最大，但與相等濃度的維生素C相比，松乳菇多糖對DPPH自由基的清除率低于相同濃度的維生素C溶液。

3 小結

以松乳菇為原料，采用單因素試驗結合響應面法得出微波輔助熱水浸泡松乳菇多糖的最優提取條件為料液比1∶35 g/mL、微波功率640 W、微波時間25 s、水浴時間120 min、水浴溫度90 ℃，在該工藝條件下松乳菇多糖的提取率為（4.61±0.03）%。此外，當松乳菇多糖的質量濃度為1.0 mg/mL時，總還原能力和DPPH自由基清除能力達到最大，表明松乳菇多糖具有較好的抗氧化活性，為后續進一步開發和利用松乳菇多糖奠定了一定基礎。

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