馬鈴薯Rieske FeS基因克隆及其在干旱脅迫下的表達分析

摘要：以馬鈴薯（Solanum tuberosum）為研究對象，通過RT-PCR技術克隆馬鈴薯Rieske FeS基因的cDNA序列，并對該基因進行生信分析；通過熒光定量PCR檢測Rieske FeS基因在模擬干旱脅迫（0、12、24 h）下的表達情況。結果表明，馬鈴薯Rieske FeS基因cDNA序列全長693 bp，包含1個開放閱讀框，可編碼230個氨基酸，馬鈴薯Rieske FeS蛋白分子質量為24.27 ku，理論等電點為8.20；Rieske FeS蛋白含有CytB6-F_Fe-S結構域（59～97 aa）、跨膜區（72～94 aa）、Rieske結構域（113～203 aa）；馬鈴薯Rieske FeS蛋白的二級結構中無規則蜷曲占比最高，其次是β-折疊，占比最低的是α-螺旋。系統進化樹分析表明，馬鈴薯Rieske FeS蛋白與煙草Rieske FeS蛋白親緣關系最接近。qPCR結果顯示，馬鈴薯Rieske FeS基因在所有被檢測組織中均有表達，葉片中Rieske FeS基因的相對表達量最高，其次是莖、根，在塊莖中相對表達量最低。經PEG干旱脅迫后，葉片中Rieske FeS基因的相對表達量呈先下降后上升趨勢，12 h相對表達量顯著低于0 h（對照組）。莖段中Rieske FeS基因的相對表達量在模擬干旱處理12 h時顯著上調；塊莖中模擬干旱脅迫24 h時Rieske FeS基因的相對表達量顯著上調；根中各干旱處理間Rieske FeS基因的相對表達量無顯著差異。馬鈴薯Rieske FeS基因與干旱脅迫密切相關。

關鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；Rieske FeS基因；克隆;生信分析；干旱脅迫；基因表達

中圖分類號：S532；Q789" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0176-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.028 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Clone of potato Rieske FeS gene and its expression analysis under drought stress

YE He-jun1， YE Chong-ze2， YU Jing3， ZHAO Rui-ying4， GUO Zhi-ping3

（1. Lishui Baiyunshan Ecological Forest Farm， Lishui" 323000， Zhejiang， China; 2. School of Forestry and Biotechnology， Zhejiang A amp; F University， Hangzhou" 311300， China; 3. College of Ecology， Lishui University， Lishui" 323000， Zhejiang， China; 4. Lishui No.2 High School， Lishui" 323000， Zhejiang， China）

Abstract： The potato （Solanum tuberosum） was used as the research object. The cDNA sequence of the Rieske FeS gene of the potato was cloned by RT-PCR technology， and bioinformatics analysis was performed on the gene. The expression of the Rieske FeS gene under simulated drought stress （0， 12， 24 h） was detected by fluorescence quantitative PCR. The results showed that the full-length cDNA sequence of the potato Rieske FeS gene was 693 bp， containing one open reading frame and encoding 230 amino acids. The molecular weight of the potato Rieske FeS protein was 24.27 ku， with a theoretical isoelectric point of 8.20;the Rieske FeS protein contained the CytB6-F_Fe-S domain （59～97 aa）， transmembrane region （72～94 aa）， and Rieske domain （113～203 aa）;the secondary structure of potato Rieske FeS protein had the highest proportion of irregular curls， followed by β-sheets， and the lowest proportion was α - helices. The phylogenetic tree analysis showed that the potato Rieske FeS protein was most closely related to the tobacco Rieske FeS protein. The qPCR results showed that the Rieske FeS gene of the potato was expressed in all tested tissues， with the highest relative expression level of Rieske FeS gene in leaves， followed by stems and roots， and the lowest relative expression level in tubers. After PEG drought stress， the relative expression level of Rieske FeS gene in leaves showed a decreasing trend followed by an increasing trend， and the relative expression level at 12 hours was significantly lower than that at 0 hours （control group）. The relative expression level of Rieske FeS gene in stem segments was significantly upregulated after 12 hours of simulated drought treatment; the relative expression level of Rieske FeS gene was significantly upregulated in tubers under simulated drought stress for 24 hours; there was no significant difference in the relative expression levels of Rieske FeS gene among the drought treatments in the roots. The potato Rieske FeS gene was closely related to drought stress.

Key words： potato（Solanum tuberosum）； Rieske FeS gene; clone; bioinformatics analysis; drought stress; gene expression

馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬于茄科，1年生草本植物，是典型的C3作物。塊莖可供食用，是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、稻谷和玉米，馬鈴薯主糧化戰略被正式提上日程，優質高產仍然是追求的目標[1]。土壤水分是影響植物生理生態特性和生長發育的重要生態因子，水分脅迫已經成為制約植物生長發育的主要逆境因子，影響著植株的光合性能[2，3]。研究表明，馬鈴薯對水分脅迫十分敏感，水資源短缺影響馬鈴薯的生產，水分脅迫程度增加，馬鈴薯的光合特性指標也隨之降低，從而影響馬鈴薯中干物質的積累以及產量[4]。

對植物光合作用機制的研究發現，Rieske FeS蛋白是光電子傳遞鏈組成成分（細胞色素b6/f復合體的組成部分之一），因此可以明確Rieske FeS蛋白與植物光合作用有著密切的關系[5，6]。而細胞色素b6/f 復合物在葉綠體電子傳遞中具有獨特的作用，它可以同時進行線性電子傳遞和循環電子傳遞。此外，通過對C4植物的模式生物狗尾草的研究，過表達Rieske FeS蛋白顯著促進C4植物的光合作用[7]。過表達Rieske FeS蛋白能夠使擬南芥細胞色素b6/f 復合物的核心組成成分細胞色素f和細胞色素b6的水平隨之增加，也觀察到光系統Ⅰ和光系統Ⅱ復合物中蛋白質水平的增加，這些結果證明操縱電子傳遞過程可以提高作物產量[8]。此外，在其他有關擬南芥抗性研究中發現，Rieske FeS基因能夠提高擬南芥在脫落酸（Abscisic acid，ABA）、鹽脅迫以及高溫高濕脅迫下的抗性[9]，特別是在耐熱性方面[10]。但到目前為止，關于Rieske FeS基因與水分脅迫的相關研究還較少。

本研究克隆馬鈴薯Rieske FeS基因并對其進行生物信息學分析。定量PCR檢查Rieske FeS基因在馬鈴薯各組織中的表達情況；通過聚乙二醇（PEG）模擬干旱處理，探究Rieske FeS基因在干旱脅迫下的表達情況，為馬鈴薯抗旱相關基因功能研究和解析抗旱機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和干旱處理

馬鈴薯取自浙江省縉云縣大洋山森林公園。將馬鈴薯切成小塊，每個小塊包含2～3個芽眼，種于花盆（直徑20.0 cm，高19.5 cm）中。每盆每天上午9：00澆水800 mL，待馬鈴薯幼苗長至約40 cm時，對其進行干旱脅迫處理。將生長整齊一致的馬鈴薯幼苗分為3組，處理組1和處理組2分別加入20% PEG6000溶液，處理組3正常供水（對照），干旱處理時間如表1所示。干旱脅迫處理結束后取馬鈴薯完全展開的葉片、莖、塊莖和根，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2 馬鈴薯植株總RNA的抽提、反轉錄與Rieske FeS基因克隆

采用柱式植物總 RNA 抽提純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取馬鈴薯幼苗各組織的總RNA。以總RNA為模板，采用PrimeSeriptTM RT reagent試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進行反轉錄。以馬鈴薯Rieske FeS基因的cDNA序列（NCBI登錄號NM_001287956.1）為模板設計克隆引物，上游引物：5′-GGCTTCTTCCACTCTT TC-3′，下游引物：5′-GTGCCGTGGAATACTGC-3′。PCR擴增：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增產物，割膠回收并送生工生物工程（上海）股份有限公司檢測。

1.3 馬鈴薯Rieske FeS基因生物信息學分析

采用ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預測馬鈴薯Rieske FeS基因編碼區；采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）預測分子質量、等電點等理化性質；采用ProP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0）預測前導肽和信號肽；采用ClustalW（http：//clustalw .ddbj.nig.ac.jp）進行多序列比對；采用MEGA X軟件構建系統進化樹，1 000次Bootstrap。采用NovoPro（https：//www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html）預測蛋白二級結構；采用SWISS-MODLE（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）進行三維建模。

1.4 實時熒光定量PCR

以馬鈴薯Rieske FeS基因的cDNA序列為模板設計定量引物。使用BioRad CFX96 Touch實時熒光定量PCR系統進行qPCR，反應體系：SYBR Premix Ex Taq（2×）緩沖液12.5 μL，cDNA模板0.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，用ddH2O補足至25 μL。反應程序：94 ℃預變性300 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。qPCR檢測結果使用2-ΔΔCt方法分析。以18S rRNA作為內參基因，所用引物如表2所示。每個樣品重復4次。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯Rieske FeS基因克隆

采用TRIzol法提取馬鈴薯葉片總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的總RNA條帶清晰、完整（圖1）；經NanoDrop檢測，總RNA濃度約為170 ng/mL，OD260 nm/OD280 nm為2.14，表明提取的總RNA完整度和純度較高。馬鈴薯葉片總RNA進一步通過反轉錄、PCR擴增、凝膠電泳（圖2）、PCR 產物回收及連接轉化測序，最終獲得馬鈴薯Rieske FeS基因的編碼序列。

2.2 馬鈴薯Rieske FeS蛋白分子特征

馬鈴薯Rieske FeS基因cDNA序列全長693 bp，包含1個開放閱讀框，可編碼230個氨基酸。馬鈴薯Rieske FeS蛋白分子質量為24.27 ku，理論等電點為8.20，甘氨酸（Gly）含量最高，為10.4%。馬鈴薯Rieske FeS蛋白不含信號肽和前導肽（圖3）。

2.3 Rieske FeS氨基酸序列比對

將馬鈴薯Rieske FeS蛋白氨基酸序列與其他植物Rieske FeS蛋白氨基酸序列進行比對，結果（圖4）表明，Rieske FeS蛋白氨基酸序列N端序列可變性較高，而C端序列較保守。Rieske FeS蛋白含有CytB6-F_Fe-S結構域（59～97 aa）、跨膜區（72～94 aa）、Rieske結構域（113～203 aa）。

2.4 Rieske FeS蛋白同源性分析

采用BLAST分析Rieske FeS蛋白同源性，結果（表3）表明，馬鈴薯Rieske FeS蛋白與煙草Rieske FeS蛋白的相似度最高，為88.70%，其次與土瓶草Rieske FeS蛋白的相似度較高，為77.88%，與小麥Rieske FeS蛋白的相似度最低，僅為69.26%。

2.5 Rieske FeS蛋白系統進化樹分析

為了分析馬鈴薯Rieske FeS蛋白與其他植物Rieske FeS蛋白之間的親緣關系，通過Mega構建系統進化樹。結果（圖5）表明，馬鈴薯與煙草聚為一類，接著又與豌豆、土瓶草和擬南芥聚為一大類。

2.6 馬鈴薯Rieske FeS蛋白結構分析

對馬鈴薯Rieske FeS蛋白二級結構進行分析，結果表明，α-螺旋由36個氨基酸殘基組成，占比15.7%；β-折疊由56個氨基酸殘基組成，占比24.3%；無規則蜷曲由138個氨基酸殘基組成，占比60.0%。進一步預測馬鈴薯Rieske FeS蛋白的三級結構，結果（圖6）表明，Rieske結構域基本上由β-折疊組成，CytB6-F_Fe-S結構域基本由α-螺旋組成，其他部分基本由無規則卷曲組成。

2.7 馬鈴薯Rieske FeS基因差異表達

馬鈴薯Rieske FeS基因在所有被檢測組織中均有表達，葉片中Rieske FeS基因的相對表達量最高，其次是莖、根，在塊莖中相對表達量最低。葉片中Rieske FeS基因的相對表達量遠高于其他組織，表明Rieske FeS基因在葉綠體中高豐度表達（圖7）。

2.8 干旱處理后馬鈴薯Rieske FeS基因的表達

經PEG干旱脅迫后，葉片中Rieske FeS基因的相對表達量呈先下降后上升趨勢，12 h相對表達量顯著低于0 h（對照組）（圖8a）。莖中Rieske FeS基因的相對表達量在模擬干旱處理12 h時顯著上調（圖8b）；塊莖中模擬干旱脅迫24 h時Rieske FeS基因的相對表達量顯著上調（圖8c）；根中各干旱處理間Rieske FeS基因的相對表達量無顯著差異（圖8d）。

3 討論

馬鈴薯對土壤適應性強，在中國種植面積廣，產量高，對國家糧食安全意義重大。但馬鈴薯對水分的虧缺十分敏感，干旱已成為制約馬鈴薯生產的重要因素。本研究就馬鈴薯Rieske FeS基因與馬鈴薯抗旱性之間的聯系開展研究，以期為馬鈴薯抗旱機理以及馬鈴薯Rieske FeS基因功能研究提供一定的理論基礎。

通過克隆獲得馬鈴薯Rieske FeS基因，其屬于Rieske 鐵硫蛋白基因家族。馬鈴薯Rieske FeS基因存在CytB6-F_Fe-S和Rieske 2個保守的結構域以及1個跨膜結構，鄭紅英[11]的研究發現擬南芥Rieske FeS蛋白也存在1個跨膜結構。同源性分析表明，馬鈴薯Rieske FeS蛋白與煙草Rieske FeS蛋白同源性最高，為88.70%，這與系統進化樹分析結果一致，在進化樹中二者亦聚為一簇，說明二者的親緣關系最近。在蛋白結構方面，馬鈴薯Rieske FeS蛋白由230個氨基酸組成，擬南芥Rieske FeS蛋白由187個氨基酸組成，可能是由于擬南芥與馬鈴薯親緣關系較遠[12]；目前未見煙草Rieske FeS蛋白研究。此外，馬鈴薯Rieske FeS蛋白的二級結構中無規則蜷曲占比最高，其次是β-折疊，占比最低的是α-螺旋；馬鈴薯Rieske FeS蛋白三級結構與煙草Rieske FeS蛋白三級結構高度相似，可以推測二者在功能上有著高度相似性（圖5）。

目前在對藻類[6]、稀脈浮萍[13]、狗尾草[14]等研究中，已經明確了Rieske FeS基因與光合作用密切相關，其還在電子傳遞以及代謝反應等方面發揮重要作用。在研究Rieske FeS蛋白對C4植物光合作用的影響時發現，當Rieske FeS亞基被組成型過表達時，葉肉細胞和束鞘細胞中細胞色素復合體b6/f的含量會增加，從而在光系統中表現出更佳的光轉換效率[14]。在對水稻Rieske FeS基因進行研究時發現，當水稻根系受到脅迫時會產生ABA并將其輸送到植物的氣生部分；ABA又會導致Rieske FeS 前體蛋白發生劇烈變化，導致某些防御/脅迫相關蛋白的積累，進而誘導氣孔關閉以防止蒸發，從而應對干旱環境[15]。因此，在PEG脅迫下，馬鈴薯葉片組織中的Rieske FeS基因相對表達量在12 h時顯著下調。在PEG脅迫下，葉綠體類囊體膜會受到損傷，尤其是對于細胞色素復合體b6/f的結構和活性，從而導致Rieske FeS基因相對表達量的下降，進而影響植物光系統對光能的吸收、光系統之間的電子傳遞等，最終導致光合作用不斷下降[16]。與馬鈴薯葉片中Rieske FeS基因下調的結果相反，在塊莖和莖中Rieske FeS基因呈上調趨勢。馬鈴薯莖、塊莖中Rieske FeS基因分別在模擬干旱脅迫12、24 h時顯著上調。吳璽等[17]發現，不同程度干旱下，馬鈴薯塊莖中淀粉和蔗糖途徑為下調表達基因富集的通路。在干旱脅迫程度增加后，馬鈴薯塊莖中的差異表達基因主要以下調表達為主，差異表達基因在光合作用、卟啉和葉綠素代謝中均顯著富集，與本試驗中12 h模擬干旱脅迫后塊莖中Rieske FeS基因表達下調的結果一致。這可能是由于Rieske FeS基因表達產物是細胞色素b6/f復合體組成成分之一，細胞色素b6/f復合體是光合作用光電子傳遞系統的組分之一，而貯存在馬鈴薯塊莖中的淀粉和蔗糖是光合作用的2種主要終產物。在PEG脅迫下，植物因水分缺失，在光合作用或呼吸作用的電子傳遞過程中會發生電子泄漏，導致正常的生理代謝出現紊亂，從而產生大量活性氧，這破壞了植物細胞原有的氧化還原平衡狀態[18]。塊莖在模擬干旱脅迫后出現上調極大可能是由于Rieske FeS蛋白發揮了氧化還原酶活性[19]，以緩解由于干旱造成的馬鈴薯組織中氧化還原系統紊亂狀態，應對干旱逆境。此外，趙龍等[20]在研究模擬干旱脅迫下馬鈴薯莖段差異表達基因并進行富集分析時發現，隨著干旱脅迫程度的加深，屬于氧化還原系統的差異表達基因，上調基因數量減少，下調基因數量逐漸增加，說明某些差異表達基因在干旱脅迫初期可能表現為上調，隨著脅迫程度的加深，基因表現為下調。該結論與本研究中馬鈴薯莖段Rieske FeS基因的相對表達量呈先上升后下降的結果基本一致，究其原因，與Rieske FeS蛋白的氧化還原酶活性有很大聯系。

4 小結

本研究從馬鈴薯中克隆得到Rieske FeS基因，該基因有典型的CytB6-F_Fe-S和Rieske結構域，是細胞色素復合體b6/f的組成成分之一。組織差異表達結果表明，馬鈴薯葉片中Rieske FeS基因相對表達量最高。干旱脅迫模擬試驗顯示，Rieske FeS基因表達水平顯著響應干旱信號，表明其直接參與植物干旱脅迫應答調控。

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