農桿菌介導的稻瘟病菌遺傳轉化體系的建立及優化

摘要：以稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）為試驗材料，通過PCR獲得GFP基因，構建pBarg-GFP-BAR-Amp重組載體，使用農桿菌轉化法獲得能夠穩定遺傳的含GFP基因的稻瘟病菌菌株，采用單因素與響應面法優化轉化條件。稻瘟病菌遺傳轉化體系的最佳轉化條件：OD600 nm為 0.38（農桿菌菌液濃度）、共培養溫度為28.2 ℃、共培養時間為2.12 d，轉化效率為280.00×10-5。PCR鑒定和熒光顯微鏡觀察發現，轉化的稻瘟病菌GFP基因能夠正常表達，和野生型稻瘟病菌的致病性無顯著差異。

關鍵詞：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）；農桿菌介導；遺傳轉化；GFP基因；建立；優化

中圖分類號：S432.4" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0182-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.029 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment and optimization of Agrobacterium mediated genetic transformation system for Magnaporthe oryzae

LI Shuang1，ZHANG Shu-mei1，TIAN Yuan1，2，PAN Yu1，3，LIU Wei1，YAN Geng-xuan1

（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin" 150010，China；2. College of Food Science，Northeast Agricultural University， Harbin" 150030，China；3. School of Life Sciences， Heilongjiang University，Harbin" 150006，China）

Abstract： Magnaporthe oryzae was used as the experimental material. The GFP gene was obtained through PCR， and a pBarg-GFP-BAR-Amp recombinant vector was constructed. The Magnaporthe oryzae strain containing the GFP gene with stable inheritance was obtained using Agrobacterium-mediated transformation. The transformation conditions were optimized using single factor and response surface methodology. The optimal transformation conditions for the Magnaporthe oryzae genetic transformation system were an OD600 nm of 0.38 （Agrobacterium concentration）， a co-culture temperature of 28.2 ℃， a co-culture time of 2.12 days， and a transformation efficiency of 280.00×10-5. PCR identification and fluorescence microscopy observation revealed that the GFP gene of the transformant Magnaporthe oryzae could be expressed normally， with no significant difference in pathogenicity compared to the wild-type Magnaporthe oryzae.

Key words： Magnaporthe oryzae； Agrobacterium mediated； genetic transformation； GFP gene； establish； optimization

水稻是全球五大糧食作物之一，水稻產量的不穩定是導致糧食危機的重要原因［1］，近年來以真菌為主的病害頻繁暴發，嚴重影響了水稻的產量和品質。水稻稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的真菌性病害，稻瘟病菌侵染水稻時可通過分生孢子接觸侵入水稻葉片并擴散到細胞，進而引發大面積的病害［2］，稻瘟病發病時會導致水稻減產，部分區域甚至顆粒無收［3］。稻瘟病菌生理小種變異速度快，流行性強，培育抗病品種難以一勞永逸地滿足農業生產需求［4］，為促進優良抗病品種的選育，建立高效、便捷的稻瘟病菌轉化體系對致病及預防機理的研究具有重要意義。

稻瘟病菌細胞壁結構復雜，遺傳轉化難度較大。常規方法是通過根癌農桿菌介導將外源DNA引入受體細胞［5］，但原生質體制備以及共培養等過程的不穩定性直接影響轉化效率［6］。本研究將綠色熒光蛋白GFP基因導入具有草銨膦抗性的質粒pBarg中，以農桿菌EHA105為介導，通過凍融法將重組質粒轉化至農桿菌中，并將表達GFP基因的農桿菌菌液與稻瘟病菌孢子液混合共培養獲得能夠穩定遺傳GFP基因的稻瘟病菌轉化株，通過單因素試驗和響應面分析優化轉化條件，為進一步研究稻瘟病菌的致病機制以及防治措施提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 Magnaporthe oryzae菌株由東北林業大學生命科學學院惠贈。大腸桿菌DH5α感受態細胞、農桿菌EHA105感受態細胞、質粒pCamb-GFP、質粒pBarg-BAR-Amp（草銨膦-氨芐青霉素抗性）由本實驗室保存。

1.1.2 培養基

1）PDA培養基（1 L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 2 g，蛋白胨 2 g，瓊脂粉20 g等。

2）LB培養基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g等。

3）YM培養基（1 L）：酵母膏0.4 g，D-甘露醇10 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g等。

4）IM培養基（1 L）：磷酸氫鉀緩沖液 10 mL（K-Buffer： 200 g/L K2HPO4，145 g/L KH2PO4，pH 7.0），硫酸鎂-氯化鈉溶液20 mL（M-N Buffer：30 g/L MgSO4·7H2O，15 g/L NaCl），1% CaCl2·2H2O 1 mL，20%葡萄糖10 mL，20%（NH4）2SO4 2.5 mL，50%甘油10 mL，0.01% FeSO4 10 mL，1 mg/mL 2-（N-嗎啉基）乙磺酸鈉（MES） 10 mL。

1.1.3 抗生素及其他試劑 氨芐青霉素、利福平、二甲亞砜均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，草銨膦購于上海圣鼎生物科技有限公司，乙酰丁香酮購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，瓊脂粉購于蘭杰柯科技有限公司，Loading Buffer、DNA marker購于寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構建 根據GFP基因序列設計上下游特異性引物，上游引物GFP-F1（5′-GTTGTCGACGGATGGTGAGCAAGG-3′），下游引物GFP-R1（5′-CGCGGATCCGCTTGTACAGCTCGTC-3′），通過PCR擴增GFP基因片段，PCR反應體系（25 μL）：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板1 μL（來源于pCamb-GFP質粒），上游引物1 μL，下游引物" 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 循環體系：94 ℃預變性" 5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸" " " "1 min（30 個循環）；72 ℃延伸10 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用DNA回收試劑盒純化回收GFP基因片段［7］。將回收的GFP基因片段連接至pBarg質粒，得到載體pBarg-GFP-BAR-Amp，將載體轉化至大腸桿菌DH5α中，在含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上37 ℃培養過夜，挑取轉化子在LB液體培養基中37 ℃ 160 r/min培養12 h。將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.2.2 農桿菌的轉化及培養 將pBarg-GFP-BAR質粒通過液氮凍融法轉化至農桿菌EHA105中［8］，涂布在含50 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL利福平的YM平板上，30 ℃下培養48 h，挑取轉化子接種于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的YM液體培養基中，30 ℃ 160 r/min培養24 h，加入無抗生素的YM液體培養基（含200 mmol/L乙酰丁香酮，AS）至OD600 nm為0.15［9］，搖床上繼續培養12 h，至 OD600 nm為0.4時備用。

1.2.3 稻瘟病菌對草銨膦敏感性測定 配置含有不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）草銨膦的 PDA 平板，將稻瘟病菌打成5 mm的菌餅接種在PDA平板中央，30 ℃培養 5 d，觀察菌落生長狀態并測量菌落直徑，每個濃度設置3次重復。

1.2.4 農桿菌介導的稻瘟病菌遺傳轉化 將活化的稻瘟病菌制成濃度為1×105個/mL的分生孢子懸浮液，取200 μL培養好的農桿菌菌液（OD600 nm為0.4）和100 μL分生孢子懸浮液混勻，將300 μL混合液涂布在IM平板的硝酸纖維素膜上［10］，28 ℃共培養" " " 2 d［11］后將硝酸纖維素膜轉移至含草銨膦的IM平板上［12］，28 ℃培養2～5 d獲得轉化子。

1.2.5 農桿菌介導的稻瘟病菌遺傳轉化條件的優化 影響稻瘟病菌遺傳轉化的因素主要包括農桿菌菌液濃度（用OD600 nm表示）、稻瘟病菌分生孢子液濃度、共培養溫度［13］、共培養時間［14］，通過單因素試驗，篩選影響產生轉化子的主要因素，進行響應面分析［15］。單因素試驗設計如表1所示。

1.2.6 Box-Behnken設計 根據單因素試驗結果，以農桿菌菌液濃度（A）、共培養溫度（B）和共培養時間（C）為因素設計3因素3水平試驗［16］，優化稻瘟病菌遺傳轉化的條件，因素與水平如表 2 所示。

采用SPSS Statistics 26.0軟件處理數據，Origin 2021軟件繪圖，Design Expert 13軟件進行響應面相關結果分析。

1.2.7 轉化子遺傳穩定性和致病性測定 為檢測稻瘟病菌重組轉化子的遺傳穩定性，隨機挑選3個轉化子，接種到不含草銨膦的PDA平板上，30 ℃培養5 d，挑取平板邊緣新長出的菌絲轉接新的不含草銨膦PDA平板上［17］，重復4次，將第5代轉化子接種到含草銨膦（250 μg/mL）的 PDA平板上，觀察生長狀況［18］。采用水稻離體葉片接種進行致病性測定［19］。在平板中鋪2層吸水紙，用水浸濕，將長至3～4葉的水稻葉片剪成長約5 cm小段放在吸水紙上，每個平板放4片葉片，取3個轉化的稻瘟病菌和野生型稻瘟病菌的分生孢子分別配成1×105個/mL 的懸浮液，取10 μL菌液滴在葉片上，28 ℃下光照培養 5 d，對比轉化的稻瘟病菌和野生型稻瘟病菌的致病性。

1.2.8 轉化子驗證

1）轉化子 PCR 驗證。使用真菌DNA提取試劑盒提取轉化子的DNA。以質粒DNA為陽性對照，野生型稻瘟病菌的基因組DNA為陰性對照，采用 GFP基因特異性引物 GFP-F2（5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTCATCTTATACTGTCGGAGAATG-3′）和GFP-R2（5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATTTGTAGAGCTCA? TCCATG-3′）進行PCR擴增。將 PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中觀察凝膠是否有單一的明亮條帶。

2）轉化子熒光顯微鏡觀察鑒定。將轉化子打成5 mm菌餅并接種在含草銨膦的PDA平板上，將滅菌的載玻片斜放至PDA平板上，待菌絲長至載玻片后取出，在熒光顯微鏡下進行熒光觀察、拍照［20］。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

參照“1.2”方法擴增GFP基因片段（圖1），構建并獲得了重組表達載體pBarg-GFP-BAR-Amp（圖2）。

2.2 不同濃度草銨膦對稻瘟病菌菌絲生長的影響

將稻瘟病菌接種到含不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）草銨膦的 PDA平板上，30 ℃培養" 5 d，測量菌落直徑，當PDA平板中草銨膦濃度為50～200 μg/mL時，菌絲生長受到不同程度抑制；當草銨膦濃度為250 μg/mL時菌絲被抑制程度最大（圖3）。因此選擇250 μg/mL草銨膦進行陽性轉化子篩選。

2.3 農桿菌介導的稻瘟病菌遺傳轉化條件的優化

2.3.1 單因素試驗

1）農桿菌菌液濃度對轉化效率的影響。不同農桿菌菌液濃度影響稻瘟病菌的轉化效率（圖4）。隨著農桿菌菌液濃度的升高轉化效率先升高后降低，當OD600 nm為0.4時，轉化效率最高，當OD600 nm大于0.4時轉化效率反而降低。因此農桿菌菌液OD600 nm為0.4時將農桿菌菌液與稻瘟病菌分生孢子液共培養。

2）稻瘟病菌分生孢子液濃度對轉化效率的影響。不同稻瘟病菌分生孢子液濃度影響稻瘟病菌的轉化效率（圖5）。隨著分生孢子液濃度的提高轉化效率先升高后降低，當分生孢子液濃度為1×105個/mL時，轉化效率最大，為253.00×10-5。但當孢子液濃度繼續增加獲得的轉化子數量明顯下降。因此稻瘟病菌分生孢子液最佳濃度為1×105個/mL。

3）共培養溫度和時間對轉化效率的影響。由圖6、圖7可知，隨著稻瘟病菌分生孢子液與農桿菌菌液共培養溫度、共培養時間的升高轉化效率均呈先上升后下降趨勢，最佳共培養溫度為28 ℃、共培養時間為2 d。

2.3.2 響應面試驗設計 基于單因素試驗結果選出影響重組轉化子轉化效率較大的3個因素，分別為農桿菌菌液濃度（A）、共培養溫度（B）、共培養時間（C），設計3個水平，共設計17組試驗（表3）。以農桿菌菌液濃度、共培養溫度、共培養時間為自變量，以轉化效率為響應值，經回歸擬合分析，得到回歸模型方程：Y=280.4-13.5A+9.63B+11.63C+4.75AB-12.25AC-6.0BC-76.7A2-32.95B2-50.95C2。

對回歸模型進行方差分析和差異顯著性檢驗，如表4所示，回歸模型F為75.82，Plt;0.000 1，說明模型具有極顯著性；失擬項F為2.06，P=0.248 1gt;0.05，表明未知因素對試驗結果的影響較小；相關系數（R2）=0.965 5，表明響應值的變化有96.55%來源于所選的自變量，試驗值和預測值具有高度相關性。農桿菌菌液濃度（A）、共培養時間（C）對轉化效率影響極顯著（Plt;0.01），共培養溫度（B）對轉化效率影響顯著（Plt;0.05）。二次項A2、B2、C2對轉化效率影響極顯著（Plt;0.01），交互項AB（農桿菌菌液濃度和共培養溫度）、BC（共培養溫度和共培養時間）對轉化效率影響不顯著（Pgt;0.05），AC（農桿菌菌液濃度和共培養時間）對轉化效率的影響顯著（Plt;0.05）。

響應面三維曲面圖能體現農桿菌菌液濃度（A）、共培養溫度（B）、共培養時間（C）3 個單因素之間的交互作用對轉化效率的影響。結果（圖8）顯示，3個因素對轉化效率影響的顯著性順序為農桿菌菌液濃度（A）gt;共培養時間（C）gt;共培養溫度（B）。根據回歸模型得到最佳轉化條件：OD600 nm為0.38（農桿菌菌液濃度）、共培養溫度為28.2 ℃、共培養時間為2.12 d，轉化效率為282.33×10-5。采用最佳提取工藝進行驗證試驗［21］，轉化效率為280.00×10-5，與預測值接近，顯示該模型的擬合度較好，具有參考價值。

2.4 轉化子穩定性檢測和致病性檢測

隨機選取 3個轉化子接種到 PDA平板上培養，傳代培養到第5 代后再轉接到含草銨膦的 PDA平板上培養48 h，結果發現這3個轉化子生長正常，表明重組表達載體pBarg-GFP-BAR-Amp已轉入稻瘟病菌基因組，可以穩定遺傳。

將3個轉化的稻瘟病菌與野生型稻瘟病菌分別接種到水稻葉片，由圖9a可知，轉入的 GFP 基因對稻瘟病菌致病力幾乎無影響。使用雙波長熒光蛋白激發光源照射被轉化的稻瘟病菌侵染的水稻葉片，葉片的病斑處發出綠色熒光，如圖9b所示。

2.5 轉化子的驗證

根據GFP基因設計特異性引物，以重組質粒pBarg-GFP-BAR-Amp DNA為陽性對照，野生型稻瘟病菌DNA為陰性對照，對轉化子進行PCR擴增，擴增條帶回收后送至公司測序。由圖10可知，轉化子中擴增出約750 bp的片段，將測序結果在NCBI網站與GFP基因比對，同源性為99.5%，表明GFP基因已成功轉入稻瘟病菌。據轉化的稻瘟病菌與野生型稻瘟病菌在日光和熒光顯微鏡下的觀察（圖11），野生型稻瘟病菌菌絲未觀察到綠色熒光，轉化的稻瘟病菌平板有明顯綠色，熒光顯微鏡下可以觀察到菌絲發綠色熒光，證明GFP基因已轉入稻瘟病菌基因組。

3 討論

傳統稻瘟病菌防治技術的弊端較多，建立能夠穩定遺傳稻瘟病菌的轉化體系，采用直觀準確的檢查方法對了解稻瘟病菌致病機制及侵染過程具有重要意義［22］。GFP基因作為標記基因在顯微鏡下易觀察，熒光穩定，受外界因素影響較小，易于載體構建，可以動態觀察活體真菌內部生物過程，是研究植物病害發生和發展過程的重要工具［23］。孫振琪等［24］通過農桿菌轉化將表達載體pMDC32-GFP轉入農桿菌，注射菌液到煙草葉片觀察熒光，為GFP基因作為植物遺傳轉化的報告基因提供基礎。本研究同樣選擇GFP基因為標記基因，用于后續dsRNA防治稻瘟病害的研究。將目的基因導入細胞的方法主要有電擊轉化法和農桿菌轉化法。電擊轉化法效率高，但大約有70%的菌體被電擊死亡；農桿菌轉化法不需制備原生質體，受體廣泛，農桿菌的T-DNA可以隨機插入基因組并且穩定遺傳［25］，在轉化過程中加入適宜濃度的乙酰丁香酮可以提高轉化效率［26］，為正向遺傳篩選提供資源［27］，但該方法試驗時間較長，可能會引起染色體重排［28］。張小蕊等［29］采用電擊轉化法成功獲得含GFP基因的解淀粉芽孢桿菌，該轉化子菌株與野生型稻瘟病菌生物學特性一致。嚴亞琴等［30］將GFP基因作為報告基因對農桿菌介導的茄子枯萎病菌的遺傳轉化條件進行優化，建立穩定高效的轉化體系。為保證轉化菌體的存活率，本研究采用農桿菌轉化法獲得GFP基因標記的稻瘟病菌，通過單因素和響應面優化轉化條件，提高轉化效率。

4 小結

本研究通過PCR獲得GFP基因片段，構建pBarg-GFP-BAR-Amp重組載體，使用農桿菌介導法獲得穩定遺傳表達GFP基因的稻瘟病菌轉化株系，用單因素與響應面法優化轉化條件，稻瘟病菌遺傳轉化體系的最佳轉化條件：OD600 nm為 0.38（農桿菌菌液濃度）、共培養溫度為28.2 ℃、共培養時間為2.12 d，轉化效率為280.00×10-5。PCR檢測和熒光顯微鏡觀察結果顯示，GFP基因成功轉化到稻瘟病菌基因組，遺傳穩定，與野生型稻瘟病菌的致病性無顯著差異。本研究為其他受體的農桿菌轉化提供依據，為研究稻瘟病菌與水稻的互作機制提供技術支撐。

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