葛根素對自身免疫性心肌炎小鼠Th1細胞分化的影響及其機制

［摘要］目的探討葛根素對于自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠Th1細胞分化的影響及其機制。方法將BALB/c雄性小鼠隨機分為A～D組，每組各5只。A組正常飼養(yǎng)20 d，B、C、D組在第0天和第7天時皮下注射心肌肌球蛋白肽（α-MyHC）和完全弗氏佐劑（CFA）構(gòu)建EAM模型，第8天時，B組小鼠灌胃羧甲基纖維素鈉，C組小鼠灌胃羧甲基纖維素鈉+地塞米松，D組小鼠灌胃羧甲基纖維素鈉+葛根素。第21天時，通過HE染色觀察各組小鼠心臟組織的炎性細胞浸潤情況，通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測各組小鼠心臟組織中IFN-γ、TNF-α和T-bet mRNA的相對表達量，通過Western blotting實驗檢測小鼠心臟組織中IFN-γ、TNF-α、T-bet蛋白相對表達量。從正常小鼠脾臟中分選出Nave CD4+T細胞，分為a～d組，a組加入anti-CD28，b組加入anti-CD28、IL-4、IL-12和IL-2，c和d組在b組基礎(chǔ)之上再分別加入12.5、25 μmol/L葛根素，各組均處理72 h。通過流式細胞術(shù)檢測Nave CD4+T細胞中Th1/CD4+T細胞比例，通過RT-qPCR技術(shù)檢測Nave CD4+T細胞中IFN-γ、TNF-α和T-bet mRNA的相對表達量，通過Western blotting實驗檢測Nave CD4+T細胞中p-STAT4蛋白相對表達量，通過免疫熒光技術(shù)觀察Nave CD4+T細胞中p-STAT4的染色位置。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，A、C、D組小鼠心臟組織炎性細胞浸潤程度顯著低于B組（F=228.50，q=20.98～36.72，Plt;0.05）；RT-qPCR和Western blotting實驗檢測結(jié)果顯示，A、C、D組小鼠心臟組織中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA和蛋白相對表達量顯著低于B組（F=6.10～1 843.00，q=4.73～93.94，Plt;0.05）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，a、c、d組Nave CD4+T細胞中Th1/CD4+T細胞比例明顯低于b組（F=116.40，q=9.49～26.08，Plt;0.05）。RT-qPCR結(jié)果顯示，a和d組Nave CD4+T細胞中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA相對表達量明顯低于b組（F=6.58～1 072.00，q=4.21～23.24，Plt;0.05）。分子對接結(jié)果顯示，葛根素與STAT4的結(jié)合能力為（-7.64±0.03）kcal/mol。Western blotting實驗結(jié)果顯示，a、d組p-STAT4蛋白相對表達量明顯低于b組（F=29.38，q=8.89、9.81，Plt;0.05）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，葛根素可以抑制p-STAT4進入Th1細胞的細胞核內(nèi)。結(jié)論葛根素通過干擾STAT4信號通路抑制EAM小鼠Th1細胞的分化，發(fā)揮抗炎作用，從而改善EAM小鼠的炎癥癥狀。

［關(guān)鍵詞］葛根素；心肌炎；自身免疫疾病；Th1細胞；STAT4轉(zhuǎn)錄因子；信號傳導(dǎo)；細胞分化

［中圖分類號］R542.21;R593.2［文獻標志碼］A

Effect of puerarin on the differentiation of Th1 cells in a mouse model of experimental autoimmune myocarditis and its mechanism" LIU Meng， LI Ling， WANG Shuang（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of puerarin （PUE） on the differentiation of Th1 cells in a mouse model of experimental autoimmune myocarditis （EAM） and its mechanism. MethodsMale BALB/c mice were randomly divided into groups A， B， C， and D， with 5 mice in each group. The mice in group A were fed normally for 20 d， and those in groups B， C， and D were given subcutaneous injection of myocardial myosin peptide （α-MyHC） and complete Freund’s adjuvant （CFA） on days 0 and 7 to establish a model of EAM. On day 8， the mice in group B were given sodium carboxymethyl cellulose （CMC-Na） by gavage， those in group C were given CMC-Na+dexamethasone by gavage， and those in group D were given CMC-Na+PUE by gavage. On day 21， HE staining was used to observe inflammatory cell infiltration in cardiac tissue， RT-qPCR was used to measure the relative mRNA expression levels of IFN-γ， TNF-α， and T-bet in cardiac tissue， and Western blotting was used to measure the relative protein expression levels of IFN-γ， TNF-α， and T-bet in cardiac tissue. Nave CD4+ T cells were isolated from the spleen of healthy mice and were divided into groups a， b， c， and d; the cells in group a were treated with anti-CD28， those in group b were treated with anti-CD28， IL-4， IL-12， and IL-2， and those in groups c and d were treated with 12.5 and 25 μmol/L PUE in addition to the treatment in group b; the course of treatment was 72 h for all groups. Flow cytometry was used to measure the proportion of Th1/CD4+ T cells in nave CD4+ T cells; RT-qPCR was used to measure the relative mRNA expression levels of IFN-γ， TNF-α， and T-bet in nave CD4+ T cells; Western blotting was used to measure the relative protein expression level of p-STAT4 in nave CD4+ T cells， and immunofluorescence assay was used to determine the position of p-STAT4 within nave CD4+ T cells. ResultsHE staining showed that compared with group B， groups A， C， and D had a significantly lower degree of inflammatory cell infiltration in cardiac tissue （F=228.50，q=20.98-36.72，Plt;0.05）; RT-qPCR and Western blotting showed that compared with group B， groups A， C， and D had significantly lower relative mRNA and protein expression levels of T-bet， IFN-γ and TNF-α in cardiac tissue （F=6.10-1 843.00，q=4.73-93.94，Plt;0.05）. Flow cytometry showed that compared with group b， groups a， c， and d had a significantly lower proportion of Th1/CD4+ T cells in nave CD4+ T cells （F=116.40，q=9.49-26.08，Plt;0.05）. RT-qPCR showed that compared with group b， groups a and d had significantly lower relative mRNA expression levels of T-bet， IFN-γ and TNF-α in nave CD4+ T cells （F=6.58-1 072.00，q=4.21-23.24，Plt;0.05）. Molecular docking showed that the binding energy between PUE and STAT4 was （-7.64±0.03） kcal/mol. Western blotting showed that compared with group b， groups a and d had significantly lower relative protein expression of p-STAT4 （F=29.38，q=8.89，9.81，Plt;0.05）. Immunofluorescent staining showed that PUE inhibited p-STAT4 from entering the nucleus of Th1 cells. ConclusionPUE inhibits the differentiation of Th1 cells in EAM mice by interfering with the STAT4 signaling pathway and can improve the inflammatory symptoms of EAM mice by exerting an anti-inflammatory effect.

［KEY WORDS］Puerarin; Myocarditis; Autoimmune diseases; Th1 cells; STAT4 transcription factor; Signal transduction; Cell differentiation

心肌炎是一種與免疫功能相關(guān)的心肌疾病，可致心臟組織纖維化以及心臟功能喪失[1]。實驗性自身免疫性心肌炎（EAM）動物模型是研究心肌炎疾病的常用模型[2]，其發(fā)生機制主要由CD4+T細胞介導(dǎo)，CD4+T細胞受到抗原刺激后，在不同的條件下可分化為不同亞型的T細胞，包括Th1、Th2、Th17及Treg[3]，其中Th1是目前研究的熱點，其特征是表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α[4-5]，同時其也參與許多自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，如實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和小鼠多發(fā)性硬化等。IL-12可以誘導(dǎo)Nave CD4+T細胞向Th1分化，p-STAT4是IL-12的下游信號因子，因此推測STAT4也參與了Th1細胞的分化。研究顯示，阻斷p-STAT4信號可以抑制Th1細胞分泌炎性因子，從而緩解EAM大鼠的炎癥癥狀[6-7]。葛根素是葛根的主要生物活性成分，具有舒張血管、保護心臟和抗炎等藥理作用[8-11]，其抗炎作用與其調(diào)節(jié)Th1/Th2比例，降低TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎性因子水平有關(guān)。目前葛根素對EAM小鼠Th1分化是否具有影響，及其具體影響機制尚不明確。本研究旨在通過觀察葛根素對EAM小鼠心臟組織中炎性細胞浸潤、炎性因子水平及Th1細胞分化的影響，進一步明確葛根素的具體作用機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)參考。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

完全弗氏佐劑（CFA）購買于美國Sigma公司，心肌肌球蛋白肽（α-MyHC）購買于生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶抑制劑（GRF101）和磷酸酶抑制劑（GRF102）購自上海雅酶生物技術(shù)有限公司，布雷非德菌素A（420601）、Ultra-LEAFTM Purified anti-mouse IL-4 antibody （504122）、Purified anti-mouse CD28 （102102）、anti-mouse CD3（100238）、FITC anti-mouse CD4（100406）、APC/Cyanine7 anti-mouse CD3（100222）以及PE-anti-mouse IFN-γ（100406）抗體購自美國BioLegend公司，葛根素標準品（MB6183-S）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）（11202ES08）、MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit（19221ES50）以及ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（36208ES60）均購買于上海翌圣生物技術(shù)有限公司。T-bet（bs-3599R）、IFN-γ（bs-0480R）和p-STAT4（Tyr693）（bs-10023R）購買于北京博奧森生物科技有限公司，TNF-α（346654）以及HRP-labelled goat anti-rabbit IgG （H+L）（511203）購自成都正能生物技術(shù)有限公司。佛波酯/離子霉素混合物（CS1001）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2動物分組和處理

20只6～8周BALB/c雄性小鼠（購買于北京思貝福生物有限公司）于恒溫恒濕的SPF級環(huán)境中，12 h/12 h晝夜光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)21 d，隨機分為A～D組，每組各5只。將10 mg的α-MyHC溶解于DMSO中，PBS稀釋至質(zhì)量濃度2 g/L，加入等劑量的質(zhì)量濃度為1 g/L的CFA后超聲乳化，獲得模型制備所需抗原乳劑。分別于第0天和第7天時于B、C、D組小鼠腋窩和腹股溝皮下各注射100 μL抗原乳劑；第8天時B組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.1 mL，C組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉+地塞米松（0.5 mg/kg）共0.1 mL，D組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉+葛根素（75 mg/kg）共0.1 mL，均每天1次，共持續(xù)13 d；A組小鼠正常飼養(yǎng)20 d。于第21天時，將各組小鼠麻醉以后斷頸處死，剝離心臟，用于后續(xù)實驗。

1.3蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠心臟組織中炎性細胞浸潤程度

取每只小鼠1/2心臟組織，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，6 μm厚切片，脫蠟后行HE染色，脫水處理后以中性樹脂膠封片。置于倒置顯微鏡下（Nikon，DS-Ri2），雙盲形式對炎癥情況進行評分。炎性細胞浸潤程度=炎性細胞浸潤面積/心臟整體面積，炎性細胞浸潤程度無為0分，lt;25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分[12]。

1.4小鼠脾細胞的處理和分組

將2只正常小鼠麻醉后斷頸處死，剝離脾臟研磨后，加入紅細胞裂解液充分裂解，銅網(wǎng)過濾獲得單細胞懸液；按照MojoSortTM Mouse CD4 T Cell Isolation Kit試劑盒（480006，Biolegend）操作說明分選獲得Nave CD4+T細胞，分為a～d組。預(yù)先將5 mg/L anti-CD3加入96/6孔板中，4 ℃孵育12 h，PBS清洗2次，分別向孔板中加入Nave CD4+T細胞（96孔板1×106/孔，6孔板1×107/孔），隨后立即向a組加入2 mg/L anti-CD28，b組分別加入4 μg/L IL-2、10 μg/L IL-12、10 mg/L IL-4以及2 mg/L anti-CD28，c、d組在b組的基礎(chǔ)上再分別加入12.5或者25 μmol/L的葛根素，均再繼續(xù)孵育72 h。

1.5流式細胞術(shù)檢測Nave CD4+T細胞中Th1/CD4+T細胞情況

取96孔板中孵育72 h的a～d組Nave CD4+T細胞，加入1×佛波酯和1×離子霉素混合物及布雷非德菌素A繼續(xù)孵育4 h；加入流式CD3和CD4抗體（每孔各0.1 μL），4 ℃孵育30 min， PBS清洗后4%多聚甲醛固定；加入2% Triton孵育10 min；加入流式IFN-γ抗體（每孔各0.1 μL）4 ℃孵育1 h后，使用銅網(wǎng)過濾制備單細胞懸液。使用Beckman CytoFLEX流式細胞儀上樣檢測，使用FlowJo V10軟件分析并計算Th1/CD4+T細胞比例。

1.6免疫熒光染色觀察Nave CD4+T細胞中的p-STAT4染色位置

將6孔板中孵育72 h的a、b、d組Nave CD4+T細胞收集到1.5 mL EP管中，PBS清洗1次后均勻涂抹于載玻片上，4%多聚甲醛固定30 min；滴加2% Triton孵育10 min，山羊血清封閉30 min；再滴加p-STAT4（1∶200）抗體，4 ℃孵育12 h后，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3遍；滴加FITC標記山羊抗兔IgG（H+L）（1∶500），37 ℃孵育1 h；DAPI染色以后封片，置于倒置顯微鏡（Nikon，DS-Ri2）下，觀察p-STAT4染色位置，并拍照。

1.7Western blotting實驗檢測心臟組織中T-bet、IFN-γ、TNF-α以及Nave CD4+T細胞當中的p-STAT4蛋白相對表達量

取A～D組每只小鼠1/4心臟組織，剪碎后放于研磨管中，加入研磨珠和200 μL RIPA裂解液（該裂解液中已預(yù)先加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），于勻漿機中研磨后，取上清液15 000 r/min離心5 min；再取上清液，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸煮10 min，冷卻后獲得組織總蛋白。配置10%的PAGE凝膠，將樣品加入后進行電泳；轉(zhuǎn)膜后TBST洗3次，10%脫脂奶粉封閉；加入T-bet（1∶1 000）、IFN-γ（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育12 h，TBST洗3次；加入山羊兔抗（1∶10 000）孵育2 h；使用化學(xué)發(fā)光試劑盒和VILBER成像儀顯影，使用Image J軟件計算目的蛋白相對表達量。

取6孔板中孵育72 h的a、b、d組Nave CD4+T細胞于1.5 mL EP管中，1 500 r/min離心2 min，棄上清液，加入100 μL的RIPA裂解液，輕柔吹打后以15 000 r/min離心5 min，取上清液，向其加入5×蛋白上樣緩沖液，沸煮10 min后獲取細胞中總蛋白。電泳、轉(zhuǎn)膜之后，加入p-STAT4一抗（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000），后續(xù)按照上述方法，檢測細胞中p-STAT4蛋白的相對表達量。

1.8RT-qPCR檢測小鼠心臟組織和Nave CD4+T細胞中T-bet、IFN-γ和TNF-α的mRNA相對表達量

取A～D組小鼠剩余心臟組織，以及6孔板中孵育72 h的a、b、d組Nave CD4+T細胞，使用MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit試劑盒提取組織或者細胞中的總RNA，使用ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR將總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。加入cDNA、引物和qPCR Mix進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參。采用2-△△CT方法計算目的基因相對表達量。引物名稱及其序列見表1。

1.9分子對接實驗計算葛根素和STAT4蛋白的結(jié)合能

從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取葛根素的分子結(jié)構(gòu)，同時從UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中獲取STAT4（PDB ID：P42228）蛋白的結(jié)構(gòu)，在Maestro1 1.9平臺進行處理后，使用Schrdinger Maestro軟件中的Glide模塊通過標準對接方法對葛根素與STAT4蛋白進行分子對接，計算葛根素和STAT4蛋白的結(jié)合能。該分子對接實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0.1軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey’s多重比較。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤情況

HE染色結(jié)果顯示，與A組相比較，B組小鼠心肌組織中有大量的炎性細胞浸潤；與B組相比較，D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤明顯減少；C組與D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤無明顯的差異。見圖1。

A～D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤程度分別為（0.68±0.11）、（2.97±0.07）、（1.58±0.13）、（1.66±0.21）分，組間比較差異具有顯著意義（F=228.50，Plt;0.05），其中與B組比較，A、C、D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤程度均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=20.98～36.72，Plt;0.05），C組與D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤程度比較無明顯差異（P＞0.05）。

2.2各組小鼠心臟組織中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA和蛋白相對表達量比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A～D組小鼠心臟組織中T-bet、IFN-γ、TNF-α mRNA相對表達量比較差異均有顯著意義（F=218.20～1 843.00，Plt;0.05），其中與B組比較，A、C、D組小鼠心臟組織中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA相對表達量均顯著降低（q=20.92～93.94，Plt;0.05）；與C組相比較，D組小鼠心臟組織中IFN-γ和TNF-α mRNA相對表達量顯著降低（q=41.41、4.37，Plt;0.05），而T-bet無明顯差異（P＞0.05）。Western blotting實驗檢測結(jié)果顯示，A～D組小鼠心臟組織中T-bet、IFN-γ和TNF-α蛋白相對表達量比較差異均具有顯著性（F=6.10～25.90，Plt;0.05），其中與B組相比，A、C、D組小鼠心臟組織中上述3種蛋白的相對表達量均顯著降低（q=4.73～12.31，Plt;0.05），C組與D組比較均無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2、圖2。

2.3葛根素對于Nave CD4+T細胞向Th1分化的影響

流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，a～d組的Nave CD4+T細胞當中Th1/CD4+T細胞的比例分別為（2.42±0.22）%、（16.85±0.30）%、（10.88±0.82）%、（11.60±0.65）%，各組間比較差異具有顯著性（F=116.40，Plt;0.05），其中與b組比較，a、c、d組Nave CD4+T細胞當中Th1/CD4+T細胞比例明顯降低（q=9.49～26.08，Plt;0.05）。見圖3。

RT-qPCR結(jié)果顯示，a、b、d組Nave CD4+T細胞中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA相對表達量比較差異均有顯著性（F=6.58～1 072.00，Plt;0.05）；其中與b組比較，a、d組Nave CD4+T細胞中T-bet、IFN-γ和TNF-α mRNA相對表達量顯著降低（q=4.21～23.24，Plt;0.05）。見表3。

分子對接實驗結(jié)果顯示，葛根素和STAT4結(jié)合能為（-7.64±0.03）kcal/mol。Western blotting結(jié)果顯示，a、b、d組Nave CD4+T細胞中p-STAT4蛋白相對表達量分別為0.69±0.05、1.13±0.05、0.65±0.05，組間比較差異有顯著性（F=29.38，Plt;0.05）；其中與b組比較，a、d組細胞中p-STAT4蛋白相對表達量顯著降低（q=8.89、9.81，Plt;0.05）。見圖4。

2.4葛根素對p-STAT4入核的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，a、d組細胞p-STAT4染色位于細胞質(zhì)中，b組細胞p-STAT4染色位于細胞核中。見圖5。圖中綠染處為p-STAT4，藍染處為細胞核。

3討論

心肌炎是心肌組織發(fā)生炎癥的一種疾病，炎癥反應(yīng)發(fā)生過程分為亞急性和慢性兩個階段[13-14]。在亞急性階段，心肌組織當中的T細胞所占比例增加[15]。其中，Th1在促進炎癥反應(yīng)中起了重要作用，Th1分化過程主要依賴IFN-γ與IL-12。IFN-γ可以通過激活JAKs/STAT1信號通路，增強Th1型轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達，從而促進Th1分化[16]，而IL-12則可以通過激活JAKs/STAT4信號通路，同樣上調(diào)T-bet表達，進一步促進Th1分化[17]。因此，通過干預(yù)JAKs/STATs信號通路的激活，減少T-bet表達，是抑制Th1分化、降低炎癥反應(yīng)的有效措施。已有研究表明，T-bet能夠誘導(dǎo)IFN-γ生成，以此提高抗原加工與呈遞的能力，促使大量炎性細胞向炎癥部位聚集，使得炎癥反應(yīng)進一步增強[18]。同時研究還發(fā)現(xiàn)，T-bet對炎癥以及自身免疫性疾病的發(fā)展有著不可忽視的作用[19]，例如，它能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2比例，緩解小鼠結(jié)腸炎的炎癥狀況[20]，T-bet的缺失會延緩實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)展[21-23]。葛根素抗炎作用較為顯著，在治療糖尿病腎病（DN）以及肝炎等疾病模型中展現(xiàn)出一定潛力。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素凍干提取物能夠降低腎臟組織中iNOS、IL-6、TNF-α、PKC-α和NF-κB表達水平，改善DN大鼠炎癥情況[24]；葛根素還可通過抑制NF-κB與P38信號通路，以及通過抑制促炎因子的分泌，顯著減輕大鼠的急性肝損傷[25]。本課題組前期研究表明，葛根素通過與STAT1結(jié)合，通過影響JAKs/STAT1信號傳導(dǎo)，減輕EAM小鼠的炎癥反應(yīng)[26]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進一步探討葛根素對Th1分化的影響，以及葛根素對Th1分化的影響是否與JAKs/STAT4信號通路也有關(guān)聯(lián)。通過給EAM小鼠灌胃葛根素13 d后，與B組相比，C、D組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤程度顯著降低，但C、D組比較無顯著差異。提示葛根素降低了EAM小鼠心肌組織的炎癥程度，其治療效果與臨床常用的地塞米松相當。然后本研究又對各組小鼠心臟組織中Th1細胞標志物進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與B組相比，C、D組小鼠心臟組織中TNF-α、IFN-γ和T-bet的mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低，而且D組顯著低于C組，提示葛根素對EAM小鼠具有顯著的抗炎作用。但C、D組小鼠心臟組織中Th1細胞標志物的比較結(jié)果，與前面兩組小鼠心肌組織中炎性細胞浸潤程度的比較結(jié)果略有不同，分析原因，可能由于兩組小鼠剝離出的心臟組織，隨機分為了3部分，各部位心臟組織炎癥情況不同，從而影響了實驗結(jié)果。本研究又通過細胞實驗，探討葛根素對EAM小鼠抗炎的作用機制，從正常小鼠脾臟組織中分選出Nave CD4+T細胞，加入向Th1分化的因子（anti-CD28、IL-4、IL-12和IL-2）和葛根素處理72 h，結(jié)果顯示，與b組相比，c、d組Nave CD4+T細胞分泌的IFN-γ顯著降低。為了進一步明確IFN-γ是否是由Th1分泌，本研究又檢測了Th1標志物TNF-α、IFN-γ和T-bet mRNA的相對表達量，發(fā)現(xiàn)與b組相比，d組Nave CD4+T細胞中的TNF-α、IFN-γ和T-bet的mRNA相對表達量明顯減少，說明葛根素在體外也可抑制Nave CD4+T細胞向Th1的分化。STAT4是STAT家族成員之一，磷酸化后形成二聚體進入細胞核內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，Nave CD4+T細胞向Th1分化的過程中，IL-12起主導(dǎo)作用，而p-STAT4是IL-12的下游信號[12]，因此猜測葛根素是通過p-STAT4信號通路抑制Th1分化的。為了驗證這種猜測的正確性，本研究又檢測了各組Nave CD4+T細胞分化72 h后細胞中p-STAT4的蛋白表達量，結(jié)果顯示，與b組相比，d組Nave CD4+T細胞的p-STAT4蛋白相對表達量明顯下調(diào)；而且通過免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，d組Nave CD4+T細胞的p-STAT4停留于細胞質(zhì)中，b組Nave CD4+T細胞的p-STAT4則作為轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)位進入細胞核中，這也說明葛根素是通過干預(yù)STAT4的磷酸化和核轉(zhuǎn)位抑制了Nave CD4+T細胞向Th1的分化。

綜上所述，葛根素對EAM小鼠心肌組織具有顯著的抗炎作用，可以顯著降低心臟組織中TNF-α、IFN-γ和T-bet等炎癥因子的表達水平，其作用機制可能是通過干預(yù)p-STAT4信號通路抑制Th1細胞分化實現(xiàn)的。該研究為葛根素治療EAM提供了理論和實驗支持。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2024759）。所有實驗過程均遵照《實驗室動物管理守則》的條例進行。

作者聲明：劉蒙、李玲參與了研究設(shè)計，劉蒙、王爽參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）