黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響

［摘要］目的探討黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響。方法從6～8周齡的BALB/c雄性小鼠脾臟中分選出Na?ve CD4+T細胞，并將其分為A～F組。A組細胞接種在包被有抗小鼠CD3抗體的孔板中，在含抗小鼠CD28抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；B組細胞在A組基礎上再加入白細胞介素-2（IL-2）、IL-12和抗小鼠IL-4抗體；C組細胞在B組的基礎上再加入黃芩素。D組細胞的培養(yǎng)體系與A組相同；E組細胞在D組的基礎上再加入IL-2和轉化生長因子-β（TGF-β）；F組細胞在E組的基礎上再加入黃芩素。通過流式細胞術檢測A～C組中Th1細胞的比例和D～F組中Treg細胞的比例；通過RT-qPCR檢測A～C組細胞中T盒子轉錄因子（T-bet）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的相對表達水平和D～F組中叉頭框蛋白P3（Foxp3）和IL-10的相對表達水平；通過免疫熒光染色檢測A～C組中Th1細胞陽性率和D～F組中Treg細胞陽性率。結果流式細胞術檢測結果顯示，C組Th1細胞比例顯著低于B組（F=46.91，q=7.95，Plt;0.05），F(xiàn)組Treg細胞比例顯著高于E組（F=145.20，q=8.64，Plt;0.05）。RT-qPCR檢測結果顯示，C組細胞中T-bet、IFN-γ、TNF-α的相對表達水平顯著低于B組（F=15.77～862.50，q=7.05～26.34，Plt;0.05），F(xiàn)組細胞中Foxp3和IL-10的相對表達水平顯著高于E組（F=38.25、49.24，q=4.65、7.64，Plt;0.05）。免疫熒光結果顯示，C組Th1細胞陽性率顯著低于B組（F=11.64，q=4.50，Plt;0.05），F(xiàn)組Treg細胞陽性率顯著高于E組（F=20.31，q=4.64，Plt;0.05）。結論黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞分化具有抑制作用，對Na?ve CD4+T細胞向Treg細胞分化具有促進作用。

［關鍵詞］黃芩苷；Th1細胞；T淋巴細胞，調節(jié)性；細胞分化；體外研究

［中圖分類號］R329.21［文獻標志碼］A

Effect of baicalein on the differentiation of Na?ve CD4+T cells into Th1 cells and Treg cells" TONG Huimin， WANG Shuang， LI Ling （School of Basic Medical， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of baicalein on the differentiation of Na?ve CD4+ T cells into Th1 cells and Treg cells. MethodsNa?ve CD4+ T cells were isolated from the spleen of male BALB/c mice aged 6-8 weeks and were divided into groups A to F. The cells in group A were inoculated into a well plate coated with anti-mouse CD3 antibody and were cultured in a medium containing anti-mouse CD28 antibody for 72 h; in addition to the treatment in group A， the cells in group B were treated with interleukin-2 （IL-2）， IL-12， and anti-mouse IL-4 antibodies; in addition to the treatment in group B， the cells in group C were further treated with baicalein. The cells in group D were cultured in the same culture system as group A; in addition to the treatment in group D， the cells in group E were further treated with IL-2 and transforming growth factor-β （TGF-β）; in addition to the treatment in group E， the cells in group F were further treated with baicalein. Flow cytometry was used to measure the percen-tage of Th1 cells in groups A to C and the percentage of Treg cells in groups D to F; RT-qPCR was used to measure the relative expression levels of T-box transcription factor （T-bet）， interferon-γ （IFN-γ）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in groups A to C and the relative expression levels of forkhead box P3 （Foxp3） and IL-10 in groups D to F; immunofluorescent staining was used to measure the positive rate of Th1 cells in groups A to C and the positive rate of Treg cells in groups D to F. ResultsFlow cytometry showed that group C had a significantly lower percentage of Th1 cells than group B （F=46.91，q=7.95，Plt;0.05）， and group F had a significantly higher percentage of Treg cells than group E （F=145.20，q=8.64，Plt;0.05）. RT-qPCR showed that group C had significantly lower relative expression levels of T-bet， IFN-γ， and TNF-α than group B （F=15.77-862.50，q=7.05-26.34，Plt;0.05）， and group F had significantly higher relative expression levels of Foxp3 and IL-10 than group E （F=38.25，49.24，q=4.65，7.64，Plt;0.05）. Immunofluorescence assay showed that group C had a significantly lower positive rate of Th1 cells than group B （F=11.64，q=4.50，Plt;0.05）， and group F had a significantly higher positive rate of Treg cells than group E （F=20.31，q=4.64，Plt;0.05）. ConclusionBaicalein has an inhibitory effect on the differentiation of Na?ve CD4+ T cells into Th1 cells and a promotional effect on the differentiation of Na?ve CD4+ T cells into Treg cells.

［KEY WORDS］Baicalin; Th1 cells; T-lymphocytes， regulatory; Cell differentiation; In vitro

CD4+T細胞在機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮至關重要的作用[1-2]。Na?ve CD4+T細胞被激活后，可分化為多種亞群，包括Th1、Th2、Treg和Th17細胞等[3]。這些亞群可以分泌不同的細胞因子，影響肺炎以及自身免疫性心肌炎等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。其中，Th1亞群主要通過分泌γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素2（IL-2）等細胞因子發(fā)揮促炎作用，其特征性轉錄因子為T盒子轉錄因子（T-bet）[7-8]；Treg亞群則主要通過分泌IL-10和轉化生長因子-β（TGF-β）來發(fā)揮抑炎的作用，其特征性轉錄因子為叉頭框蛋白P3（Foxp3）[9-10]。對Na?ve CD4+T細胞分化過程的干預在炎癥性疾病的靶向治療方面具有重要意義。

黃芩素屬于黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要活性成分之一[11-12]，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種生物學活性，對骨關節(jié)炎、狼瘡性腎炎等炎癥性疾病具有治療作用[13-15]。研究表明，黃芩素可通過降低膿毒癥小鼠胰腺組織中Th1細胞的比例，從而緩解其體內(nèi)的炎癥反應[16]；黃芩素還可通過提高小鼠結腸組織中Treg細胞的比例，從而緩解炎癥性腸病的進展[17]。然而，黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響目前鮮有報道。本研究通過體外實驗探究黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響，旨在為炎癥性疾病治療策略的制定提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1動物來源

6～8周齡BALB/c雄性小鼠共10只，體質量18～20 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，飼養(yǎng)于溫度25 ℃、濕度50%、12/12 h晝夜光照環(huán)境下。

1.2藥物和試劑

黃芩素（MB6699，純度≥98%，細胞實驗）購自大連美侖生物技術有限公司，IL-2（212-12-5UG）、IL-12（210-12-2UG）、TGF-β（100-21）購自美國Peprotech公司，抗小鼠CD3抗體（100238）、抗小鼠CD28抗體（102102）、抗小鼠IL-4抗體（504122）、APC/CYanine7-抗小鼠CD3抗體（100222）、FITC-抗小鼠CD4抗體（100406）、PE-抗小鼠CD25抗體（102007）、PE-抗小鼠IFN-γ抗體（505808）、APC-抗小鼠Foxp3抗體（320013）、布雷非德菌素A（420601）、小鼠CD4+T細胞分選試劑盒（480006）均購自美國BioLegend公司，佛波酯/離子霉素混合物（CS1001）購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，RNA提取試劑盒（19221ES50）購自上海翌圣生物科技股份有限公司，F(xiàn)oxp3抗體（sc-166212）購自美國Santa公司，T-bet抗體（bs-3599R）和FITC標記的羊抗兔IgG抗體（bs-0295G-FITC）購自北京博奧森生物技術有限公司，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG抗體（511101）購自成都正能生物技術有限公司。

1.3細胞分組及處理

小鼠經(jīng)腹腔注射200 μL戊巴比妥鈉注射液處死以后，剝離出其脾臟，置于含有500 μL PBS的1.5 mL EP管中，并用研磨棒充分研磨；加入紅細胞裂解液后1 500 r/min離心2 min，棄去上清液，以PBS重懸后獲得單細胞懸液。按照小鼠CD4+T細胞分選試劑盒說明書從單細胞懸液中分離得到Na?ve CD4+T細胞，并將其分為A～F組，每組設3個復孔。A組細胞接種在包被有抗小鼠CD3抗體（5 mg/L）的96孔板（每孔1×106個細胞）或6孔板中（每孔1×107個細胞），并加入含抗小鼠CD28抗體（2 mg/L）、10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；B組細胞在A組的基礎上再加入IL-2（4 μg/L）、IL-12（10 μg/L）和抗小鼠IL-4抗體（10 mg/L）；C組細胞在B組的基礎上再加入黃芩素（12 μmol/L）[18]。D組細胞的培養(yǎng)體系與A組相同；E組細胞在D組的基礎上再加入IL-2（4 μg/L）和TGF-β（1 μg/L）；F組細胞在E組的基礎上再加入黃芩素（12 μmol/L）。上述所有抗體和細胞因子的濃度均為終濃度。將各組細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)檢測。

1.4流式細胞術檢測Th1和Treg細胞表型

取96孔板中培養(yǎng)72 h的A～C組細胞，于培養(yǎng)基中加入1×佛波酯/離子霉素混合物及布雷非德菌素A（5 mg/L），置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，于4 ℃下以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。取96孔板中培養(yǎng)了72 h的D～F細胞于4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清液。A～C組孔板中加入APC/CYanine7-抗小鼠CD3抗體和FITC-抗小鼠CD4抗體，D～F組孔板中加入APC/CYanine7-抗小鼠CD3抗體、FITC-抗小鼠CD4抗體和PE-抗小鼠CD25抗體，置于4 ℃下避光染色30 min。6組細胞均置于4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入4%多聚甲醛100 μL于室溫下避光固定8 min，再于4 ℃下1 000 r/min離心5 min除去殘留多聚甲醛。然后再分別向A～F組細胞中每孔加入0.2% Triton-PBS溶液于4 ℃下透化10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。A～C組加入PE-抗小鼠-IFN-γ抗體，于4 ℃下避光染色1 h；D～F組加入APC-抗小鼠Foxp3抗體，于4 ℃下避光染色2 h。6組細胞均于4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量PBS細胞重懸沉淀。然后使用流式細胞儀（Beckman CytoFLEX）和FlowJo V10軟件分析計算IFN-γ+/CD3+CD4+細胞的百分比（Th1細胞百分比）和Foxp3+CD25+/CD3+CD4+細胞的百分比（Treg細胞百分比）。

1.5RT-qPCR檢測各組細胞中各細胞因子水平

取6孔板中培養(yǎng)72 h的A～F組細胞，用RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，并通過逆轉錄試劑將總RNA逆轉錄成cDNA，根據(jù)實時定量PCR擴增預混合溶液說明書配置反應體系，使用熒光定量PCR儀（LightCycler 96）進行檢測，采用2－△△CT的方法計算目的基因的相對表達水平。引物名稱及其序列詳見表1。

1.6免疫熒光染色檢測各組細胞各轉錄因子表達

6孔板培養(yǎng)72 h的A～F組細胞1 500 r/min離心2 min，棄上清液，以PBS重懸后獲得單細胞懸液。取5～10 μL的單細胞懸液滴加于載玻片上面，風干后滴加4%多聚甲醛室溫固定30 min。而后滴加0.2% Triton-PBS溶液室溫透化10 min。再滴加10%山羊血清，室溫封閉30 min。于A～C組細胞涂片上滴加兔抗T-bet抗體，D～F組細胞滴加鼠抗Foxp3抗體，4 ℃下孵育過夜。滴加攜帶FITC熒光的相應二抗，37 ℃水浴1 h。滴加DAPI染液，于4 ℃下避光染色10 min。使用抗熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡（Nikon，DS-Ri2）下觀察細胞染色情況，F(xiàn)ITC熒光陽性的細胞為T-bet陽性細胞或Foxp3陽性細胞。Th1細胞陽性率=（T-bet陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%；Treg細胞陽性率=（Foxp3陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。1.7統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較使用單因素方差分析，多重比較采用Tukey多重比較檢驗，以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1流式細胞術檢測黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響

流式細胞術檢測結果顯示，A～C組中Th1細胞百分比分別為（5.42±1.05）%、（31.87±4.46）%、（16.44±3.59）%，各組比較差異具有顯著意義（F=46.91，Plt;0.05），其中B、C組顯著高于A組，C組顯著低于B組（q=5.68～13.64，Plt;0.05）。D～F組細胞中Treg細胞百分比分別為（6.38±1.20）%、（38.03±4.61）%、（56.07±3.75）%，各組比較差異有顯著性（F=145.20，Plt;0.05），其中E、F組顯著高于D組，且F組顯著高于E組（q=8.64～23.80，Plt;0.05）。

2.2RT-qPCR檢測黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，A～C組中T-bet、IFN-γ、TNF-α的相對表達水平比較差異有顯著性（F=15.77～862.50，Plt;0.05），其中B組均顯著高于A組，C組均顯著低于B組（q=6.70～58.64，Plt;0.05），見表2。D～F組細胞中Foxp3的相對表達水平分別為1.02±0.01、1.98±0.12、2.57±0.36，IL-10的相對表達水平分別為0.98±0.07、1.14±0.01、1.34±0.02，各組比較差異具有顯著意義（F=38.25、49.24，Plt;0.05），E、F組Foxp3和IL-10的相對表達水平均顯著高于D組，F(xiàn)組均顯著高于E組（q=4.65～14.02，Plt;0.05）。

2.3免疫熒光染色實驗檢測黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1和Treg細胞分化的影響

免疫熒光染色實驗結果顯示，A～C組細胞的Th1細胞陽性率分別為（3.66±1.39）%、（28.71±10.29）%、（11.87±4.27）%，各組比較差異有顯著性（F=11.64，Plt;0.05），其中B、C組Th1細胞陽性率顯著高于A組，C組顯著低于B組（q=2.19～6.69，Plt;0.05），結果見圖1Ⅰ。而D～F組細胞的Treg細胞陽性率則分別為（1.33±0.58）%、（7.75±1.47）%、（14.56±4.11）%，各組比較差異有顯著性（F=20.31，Plt;0.05），其中E、F組Treg細胞陽性率顯著高于D組，F(xiàn)組顯著高于E組（q=4.38～9.01，Plt;0.05），結果見圖1Ⅱ。

3討論

炎癥反應本質上是機體對某些刺激因素的防御反應[19-20]。在正常狀態(tài)下，炎癥反應主要表現(xiàn)為保護和修復作用，但是過度激活和持續(xù)過久的炎癥反應則會對機體造成不同程度的損傷[21]。研究表明，CD4+T細胞在機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用[22-23]。未受抗原刺激的CD4+T細胞為Na?ve CD4+T細胞，受不同抗原刺激后將分化為不同亞群，包括Th1、Th2、Treg和Th17細胞等[3]。研究顯示，CD4+T細胞不同亞群可通過分泌各類因子調控多種類型炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，如結腸炎、肝炎等[24-25]。其中，Th1亞群主要通過分泌IFN-γ和TNF-α參與促炎相關的免疫應答，特征性轉錄因子為T-bet[26]；Treg亞群則主要是通過分泌IL-10來發(fā)揮抑制炎癥的作用[27]，其細胞表面特異性表達CD25[28]，特征性轉錄因子為Foxp3[29]。調節(jié)Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞和Treg細胞的分化能夠影響炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。

黃芩素作為黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，在骨關節(jié)炎、肝炎等多種炎癥性疾病中表現(xiàn)出抗炎作用[30-31]。研究顯示，黃芩素可通過激活軟骨細胞中AMPK/Nrf2/HO-1通路緩解患者和小鼠骨關節(jié)炎的癥狀[13]；在小鼠肝炎模型中，黃芩素還可通過激活巨噬細胞中TrKB-CREB1信號軸，上調巨噬細胞表面髓樣細胞觸發(fā)受體2的表達，從而抑制炎癥、緩解肝損傷[32]。此外，黃芩素可以通過影響CD4+T細胞各亞群比例發(fā)揮抗炎作用。在膿毒癥小鼠模型中，黃芩素可通過抑制胰腺組織內(nèi)RhoA-ROCK通路，降低Th1和Th17細胞的比例，并且提高Treg細胞比例，從而降低胰腺的炎癥反應[16]；在結腸炎小鼠模型中，黃芩素可通過激活結腸內(nèi)芳香烴受體，調節(jié)Th17和Treg細胞比例及相關促炎因子和抗炎因子IL-10、TGF-β間的平衡，從而降低機體的炎癥反應[33]。但是關于黃芩素是否通過影響Na?ve CD4+T細胞的分化從而緩解炎癥反應尚不明確。

本研究通過體外實驗探究黃芩素對于Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞和Treg細胞分化的影響。其中，在細胞培養(yǎng)體系中加入IL-2、IL-12和抗小鼠IL-4抗體，以誘導Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞分化，加入IL-2和TGF-β以誘導Na?ve CD4+T細胞向Treg細胞分化。通過流式細胞術、免疫熒光染色和RT-qPCR三種方法檢測A～C組中Th1細胞和D～F組中Treg細胞的分化情況。結果顯示，B組中Th1細胞百分比，促炎因子IFN-γ、TNF-α和Th1特征性轉錄因子T-bet的相對表達水平，Th1細胞陽性率均顯著高于A組，說明成功誘導了Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞分化；C組中上述指標均顯著低于B組，說明黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞的分化具有抑制作用。E組中Treg細胞百分比，抑炎因子IL-10和Treg特征性轉錄因子Foxp3的相對表達水平，Treg細胞陽性率均顯著高于D組，說明成功誘導了Na?ve CD4+T細胞向Treg細胞分化；F組中上述指標均顯著高于E組，說明黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Treg細胞分化具有促進作用。

綜上，黃芩素對Na?ve CD4+T細胞向Th1細胞分化具有明顯抑制作用，對Na?ve CD4+T細胞向Treg細胞分化具有明顯促進作用。本研究結果有望為黃芩素調節(jié)Th1/Treg平衡的作用研究提供理論支持。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2024762）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理守則》的條例進行。

作者聲明：佟慧敏、王爽參與了研究設計；佟慧敏、李玲參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 李京蔓 厲建強）