牡荊素對小鼠煙曲霉菌性角膜炎的保護作用及其機制

［摘要］目的探究牡荊素對小鼠煙曲霉菌性角膜炎的保護作用及其機制。方法采用CCK-8實驗檢測牡荊素對HCECs及RAW264.7細胞細胞存活率的影響；將C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組、煙曲霉菌性角膜炎組及牡荊素處理組（小鼠球結膜下注射100 mg/L的牡荊素10 μL，每天1次，連續3 d），采用臨床評分法評估小鼠真菌性角膜炎的嚴重程度；采用蘇木精-伊紅（HE）染色檢測小鼠角膜炎癥細胞浸潤情況；采用平板計數實驗檢測小鼠角膜真菌載量；采用實時熒光定量PCR方法檢測小鼠及RAW264.7細胞IL-1β、IL-6、MIP-2和LOX-1 mRNA水平的變化；采用蛋白免疫印跡實驗檢測RAW264.7細胞中LOX-1蛋白表達情況。結果牡荊素低于100 mg/L時對HCECs細胞活性無明顯影響，牡荊素低于150 mg/L時對RAW264.7細胞活性無明顯影響。與煙曲霉菌性角膜炎組小鼠相比，牡荊素處理組小鼠角膜炎病程進展較慢，小鼠角膜炎癥細胞浸潤水平較低，小鼠角膜真菌載量明顯減少（t′=19.27，P＜0.05）；同時牡荊素處理組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、MIP-2和LOX-1 mRNA的表達水平與煙曲霉菌性角膜炎組小鼠相比均明顯降低（t=4.95～6.15，P＜0.05）。此外，牡荊素預處理后的RAW264.7細胞IL-1β、IL-6、MIP-2和LOX-1的mRNA及LOX-1蛋白水平與菌絲刺激組相比明顯降低（t=-64.68～40.02，P＜0.05）。結論牡荊素對煙曲霉菌刺激的RAW264.7細胞及真菌性角膜炎小鼠角膜具有保護作用，其機制可能是通過下調RAW264.7細胞以及小鼠角膜IL-1β、IL-6、MIP-2及LOX-1的mRNA和模式識別受體LOX-1蛋白表達而實現的。

［關鍵詞］真菌性角膜炎；煙曲霉菌；牡荊素；抗炎作用；LOX-1

［中圖分類號］R772.21［文獻標志碼］A

Effect of vitexin on Aspergillus fumigatus keratitis in mice and its mechanism" XU Haining， YI Wendan， JIA Yiyi， LI Cui， YIN Min， GU Lingwen， ZHAO Guiqiu（Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the protective effect of vitexin against Aspergillus fumigatus （A. fumigatus） ke-ratitis in mice and its mechanism. MethodsThe effect of vitexin on the survival rate of human corneal epithelial cells （HCECs） and RAW264.7 cells was evaluated using Cell Counting Kit-8. Mice were divided into three groups： control group， A. fumigatus keratitis group， and vitexin-treated group （10 μL of 100 mg/L vitexin was injected subconjunctivally once a day for 3 consecutive days）. The severity of fungal keratitis （FK） was evaluated using clinical scores. Hematoxylin-eosin staining was used to detect the inflammatory cell infiltration in the mice. Plate counting was used to determine corneal fungal load in the mice. Changes in the mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， MIP-2， and LOX-1 in the mice and RAW264.7 cells were measured using quantitative real-time PCR. The expression level of LOX-1 protein in RAW264.7 cells was determined using Western blotting. ResultsVitexin did not have a significant effect on the viability of HCECs cells at a concentration lower than 100 mg/L and did not have a significant effect on the viability of RAW264.7 cells at a concentration lower than 150 mg/L. Compared with A. fumigatus keratitis group mice， vitexin-treated mice showed a slower course of keratitis progression， decreased inflammatory cell infiltration in the cornea， and a significantly reduced corneal fungal load （t′=19.27，Plt;0.05）. Meanwhile， the mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， MIP-2， and LOX-1 in the vitexin-treated group were significantly reduced compared with those in A. fumigatus keratitis group （t=4.95-6.15，Plt;0.05）. The mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， MIP-2， and LOX-1 and the protein expression level of LOX-1 were significantly reduced in vitexin-treated RAW264.7 cells compared with those in hyphae-stimulated cells （t=-64.68-40.02，Plt;0.05）. ConclusionVitexin has a protective effect on A. fumigatus-stimulated RAW264.7 cells and FK in mice cornea， which may be achieved by downregulating the mRNA expression of IL-1β， IL-6， MIP-2， and LOX-1 and the protein expression of LOX-1 in pattern recognition receptors in RAW264.7 cells and the cornea in mice.

［KEY WORDS］Fungal keratitis; Aspergillus fumigatus; Vitexin; Anti-inflammation; LOX-1

真菌性角膜炎（fungal keratitis，FK）是角膜損傷致盲的主要原因，發病率大約占感染性角膜炎的40%，最常見的致病菌為鐮刀菌屬和曲霉菌屬[1-2]。真菌侵襲角膜后，機體會產生相應的免疫炎癥反應，過度炎癥反應是導致失明的主要原因之一[3-5]，即使及時消除了致病真菌，角膜的炎癥反應仍然會繼續存在或進一步發展[6]。因此，尋找有效抑制角膜炎癥反應的藥物，對治療FK具有重要意義。

牡荊素是一種生物活性黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和神經保護等多種藥理作用，且因為安全系數較高，牡荊素被認為是治療多種炎癥性疾病的潛在藥物[7-8]。但牡荊素能否在FK中發揮保護作用尚未可知。本研究通過構建小鼠FK模型，同時以煙曲霉菌感染小鼠巨噬細胞，探究牡荊素對小鼠FK的保護作用及其可能的機制。

1材料和方法

1.1實驗材料

牡荊素購于美國新澤西州MCE公司，RNAiso Plus reagent購買于寶生物工程（大連）有限公司，LOX-1單克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗小鼠多克隆抗體（GAPDH）、羊抗兔二抗購于武漢Elabscience公司。8周齡C57BL/6雌鼠（SPF級）36只均通過了嚴格的生產許可和檢驗檢疫，購于北京斯貝福生物技術有限公司。實驗前小鼠均適應性喂養1周，行裂隙燈檢查眼部無明顯病變和畸形后用于后續實驗。小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海生化細胞所干細胞庫，永生化的人角膜上皮細胞（HCECs）由廈門大學饋贈，標準煙曲霉菌株（編號3.0772）購于中國微生物保藏中心。

1.2牡荊素處理細胞濃度的篩選

RAW264.7細胞和HCECs細胞均接種于96孔板，分別置于DMEM高糖培養液（含10% FBS）以及DMEM/F12混合培養液（含5% FBS）中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞融合度約達80%時，將HCECs細胞分為A1～I1組（每組設置6個復孔），RAW264.7細胞分為A2～I2組（每組設置6個復孔）。A1、A2組更換為原培養液，B1、B2組更換為含有0.1% DMSO的培養液，C1～I1組、C2～I2組分別替換為含有不同濃度牡荊素（12.5、25、50、100、150、200和250 mg/L）的培養液，繼續上述條件恒溫培養24 h。然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，嚴格按照CCK-8試劑盒說明書的要求，于恒溫箱中培養2 h。采用酶標儀測量波長450 nm處各孔吸光度值。選擇牡荊素對細胞最大無毒質量濃度用于后續實驗。

1.3菌絲制備

煙曲霉菌于Sabouraud瓊脂培養基中37 ℃恒溫培養2～3 d，收集菌絲研磨后分為兩份，一份用無菌PBS配制成濃度為3×1011 CFU/L的活煙曲霉菌絲懸液，另一份置于體積分數0.75乙醇中過夜，洗除乙醇后，然后使用DMEM培養液配成濃度為3×1011 CFU/L的滅活煙曲霉菌絲懸液。

1.4小鼠的分組和動物模型的構建

將C57BL/6雌鼠隨機分為A～C組，每組12只。第1天，A組小鼠不做任何處理；B、C組小鼠腹腔內注射8%的水合氯醛0.08 mL麻醉，在顯微鏡下以板層刀刮除左眼中央角膜上皮層，形成直徑2 mm的圓形缺損，再以1 mL針頭于角膜缺損處做“井”字形劃痕，深度達淺基質層，取活煙曲霉菌絲懸液5 μL滴于角膜缺損處，覆蓋上角膜接觸鏡后，使用5-0線縫合小鼠眼瞼。第2天拆除B、C組小鼠的縫線，打開眼瞼，以微量注射器于A、B組小鼠的球結膜下注入含0.1% DMSO的PBS溶液10 μL，于C組小鼠球結膜下注入100 mg/L牡荊素10 μL，均每天1次，連續3 d。分別于第2天拆除小鼠縫線時和第4天處理結束時，通過裂隙燈觀察A、B、C組小鼠角膜前節并拍照，參照文獻[9]對小鼠角膜潰瘍進行臨床評分。拍照完成后頸椎脫臼法處死各組小鼠，用于后續實驗。

1.5蘇木精-伊紅（HE）染色觀察角膜炎癥細胞浸潤情況

分別從B、C組小鼠中隨機取出3只，剝離左眼眼球，用PBS沖洗后，置于4%多聚甲醛中室溫放置3 d，摘除小鼠晶狀體，將眼球進行石蠟包埋，切成6 μm厚的切片后，依次用體積分數為1.00、0.95、0.90、0.85的乙醇溶液浸泡切片各5 min，蒸餾水洗滌2 min。蘇木精溶液染色5 min，流水沖洗2 min。伊紅溶液染色2 min，流水沖洗2 min。再依次使用體積分數為0.85、0.90、0.95、1.00的乙醇對切片進行脫水，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察角膜切片的染色情況并進行拍照。

1.6平板計數實驗檢測角膜真菌載量

分別從B、C組小鼠中隨機取出3只，剝離左眼眼球，用刀片沿角鞏膜緣取出各小鼠角膜，分別置于200 μL的PBS溶液中研磨后，接種于Sabouraud瓊脂培養基上，置于恒溫箱37 ℃孵育24～36 h，定時觀察培養基上煙曲霉菌菌落形成情況，并計算CFU數目。

1.7RAW264.7細胞培養和刺激

將RAW264.7細胞接種于12孔板或6孔板中，待細胞融合度約達80%時分為D～G組，每組設3個復孔。D組細胞中加入含有0.1% DMSO的細胞培養液，E組細胞中加入含150 mg/L的牡荊素細胞培養液；F、G組細胞中先分別加入含0.1% DMSO及150 mg/L牡荊素的細胞培養液，37 ℃預處理2 h后，再分別加入滅活煙曲霉菌菌絲懸液60、90 μL，培養8 h后進行后續實驗。

1.8實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測小鼠角膜以及RAW264.7細胞中IL-1β、IL-6、MIP-2和LOX-1 mRNA的表達水平

將接種于12孔板中的D～G組RAW264.7細胞，每孔加入500 μL RNAiso Plus reagent以提取細胞總RNA。A、B、C組各取6只小鼠，剝離左眼眼球，并且用刀片沿角鞏膜緣取出小鼠角膜，置于800 μL RNAiso Plus reagent中提取總RNA。測定細胞和組織中的RNA純度及濃度，使用HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑反轉錄為cDNA。最后，使用羅氏LightCycler 96儀進行RT-qPCR。引物名稱及序列見表1。以β-actin為內參，計算目標基因相對表達量。

1.9蛋白質印跡法檢測RAW264.7細胞中LOX-1蛋白表達水平

將接種于6孔板的D～G組RAW264.7細胞，使用無菌PBS洗滌3次后，每孔中加入蛋白提取液（RIPA組織蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的配置比例為98∶1∶1）100 μL，提取細胞總蛋白，使用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。配制SDS-PAGE分離膠以及濃縮膠，將40 μg總蛋白加入SDS-PAGE膠中，110 V恒壓電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。PVDF膜室溫封閉2 h以后，分別加入特異性一抗LOX-1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，使用ECL顯色劑顯影，檢測蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.10統計學處理

采用SPSS 26.0統計軟件分析數據，呈正態分布的計量資料以±s表示。兩組間的比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1牡荊素處理細胞濃度篩選結果

CCK-8實驗的結果顯示，A1～I1組中HCECs細胞的吸光度值分別為2.60±0.04、2.56±0.10、2.57±0.08、2.53±0.15、2.51±0.09、2.53±0.15、2.43±0.14、2.24±0.12、2.04±0.15，各組間比較差異具有顯著性（F=13.40，P＜0.05），其中A1組與B1～F1組細胞的吸光度值比較差異無顯著性（P＞0.05），G1～I1組細胞的吸光度值均顯著低于A1組（t=5.88～8.22，P＜0.05）。A2～I2組RAW264.7細胞的吸光度值分別為3.46±0.16、3.36±0.08、3.50±0.13、3.34±0.11、3.51±0.07、3.46±0.14、3.46±0.13、3.07±0.04、2.82±0.16，各組間比較差異有顯著性（F=11.10，P＜0.05），其中A2組與B2～G2組吸光度值比較差異無顯著性（P＞0.05），H2、I2組吸光度值顯著低于A2組（t=5.25、6.53，P＜0.05）。根據以上結果，確定牡荊素對HCECs細胞的最大無毒質量濃度為100 mg/L，同時對于RAW264.7細胞的最大無毒質量濃度為150 mg/L，因此后續實驗采用100 mg/L質量濃度的牡荊素處理小鼠角膜組織，采用150 mg/L質量濃度的牡荊素處理RAW264.7細胞。

2.2小鼠角膜炎癥程度、真菌載量及角膜組織HE染色結果

實驗第2天時，A組小鼠角膜無明顯異常；B組和C組小鼠角膜潰瘍面積及其程度比較均無顯著差異（圖1A、B）；第4天時，C組小鼠角膜潰瘍面積較B組明顯減小，潰瘍程度明顯減輕（圖1C、D）。第2天時B、C組小鼠角膜臨床評分分別為（7.50±0.55）、（7.67±0.52）分，差異無顯著性（P＞0.05）；至第4天時B、C組小鼠角膜臨床評分分別為（6.83±0.75）、（4.67±0.52）分，差異有顯著性（t=7.48，P＜0.05）。HE染色結果顯示，C組小鼠角膜組織中炎細胞浸潤比B組顯著減少（圖1E、F）。平板計數實驗結果顯示，第4天時B組和C組小鼠的角膜組織CFU數目分別為2 573.33±413.60和56.33±10.26（圖1G、H），與B組相比較，C組小鼠角膜真菌載量明顯減少（t′=19.27，P＜0.05）。

2.3牡荊素對小鼠角膜組織中炎癥因子及LOX-1 mRNA表達的影響

A～C組小鼠角膜組織中各炎癥因子及LOX-1 mRNA表達比較差異均具有顯著意義（F=97.15～156.84，P＜0.05）；其中，與A組相比，B組及C組小鼠角膜組織中各炎癥因子及LOX-1 mRNA表達均明顯升高（t=－41.41～－14.06，P＜0.05），與B組相比，C組各炎癥因子及LOX-1 mRNA表達明顯下降（t=4.95～6.15，P＜0.05）。見表2。

2.4牡荊素對滅活煙曲霉菌菌絲處理RAW264.7細胞炎癥反應的影響

D～G組RAW264.7細胞中各炎癥因子mRNA和LOX-1蛋白表達量比較差異均具有顯著性（F=425.61～1 329.44，P＜0.05），其中D組與E組細胞中各炎癥因子mRNA和LOX-1蛋白表達量比較差異無顯著性（P＞0.05），D組與F組、F組與G組細胞中各炎癥因子mRNA和LOX-1蛋白表達量比較差異具有顯著性（t=－64.68～40.02，P＜0.05）。見表3。

3討論

FK是一種復雜的難治性角膜病變性疾病，過度炎癥反應是疾病進展和加重的重要原因[3-5]。牡荊素是一種黃酮類化合物，在多種細胞及動物炎癥模型中均發揮抗炎作用。然而，牡荊素在FK中的作用及其機制尚不清楚。

本研究首先探究了牡荊素對細胞的最大安全濃度。根據CCK-8實驗結果，牡荊素對HCECs的最大無毒質量濃度為100 mg/L，對RAW264.7細胞的最大無毒質量濃度為150 mg/L。因此，后續選擇100 mg/L牡荊素用于煙曲霉菌性角膜炎小鼠動物實驗研究，選擇150 mg/L牡荊素用于RAW264.7細胞的體外實驗。

在本研究中，與煙曲霉菌性角膜炎組小鼠相比較，牡荊素處理組的小鼠角膜潰瘍面積明顯減小，潰瘍程度明顯減輕，小鼠角膜潰瘍臨床評分更低，角膜炎癥細胞浸潤更少，提示牡荊素可以有效抑制FK的進展。既往研究還發現，牡荊素在腹膜炎、肺水腫和腎損傷等多種疾病中均發揮抗炎和保護作用[7]。DAS等[10]研究發現，牡荊素通過降低金黃色葡萄球菌表面的疏水性抑制其毒力，并干擾其在宿主中生物膜的形成。本研究結果顯示，牡荊素處理組較煙曲霉菌性角膜炎組小鼠角膜真菌載量明顯減少，提示牡荊素可以有效降低煙曲霉菌感染后角膜的真菌負荷。綜合目前的研究結果可以推測，牡荊素不僅具有抗細菌作用，還可能具有潛在的抗真菌特性。

炎癥因子是體內炎癥反應啟動和維持的主要承擔者。研究表明牡荊素能抑制多種炎癥因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的產生[11-13]。為進一步揭示牡荊素保護煙曲霉菌感染后角膜炎的機制，本研究通過RT-qPCR的方法，檢測了各種炎癥因子的表達情況。結果顯示牡荊素處理能明顯降低RAW264.7細胞的IL-1β、IL-6、MIP-2 mRNA的表達；本研究進一步檢測了牡荊素在煙曲霉菌性角膜炎小鼠中是否能夠影響炎癥因子的水平，結果顯示牡荊素能抑制小鼠FK中炎癥因子IL-1β、IL-6和MIP-2的mRNA表達。以上結果表明，牡荊素可以通過抑制小鼠FK及滅活菌絲刺激的巨噬細胞炎癥因子的水平發揮其抗炎作用。

LOX-1蛋白主要表達于血管內皮細胞表面，是血管內皮細胞表面氧化型低密度脂蛋白的主要受體。此外，LOX-1蛋白也可以識別包括高級糖基化終產物、中性粒細胞、老化/凋亡的細胞、病原微生物、內毒素等的多種配體，發揮復雜的炎癥調控作用[14]。研究表明，LOX-1也表達于正常的人和小鼠角膜中，以及RAW264.7和HCECs等細胞中，在FK中可作為模式識別受體被激活后，參與炎癥反應的調控[15-17]。當LOX-1表達被抑制后，炎癥因子的表達水平也隨之降低[16，18-19]，提示LOX-1可能在調控煙曲霉素感染誘導的炎癥因子的上調中發揮作用。因此，本研究又進一步采用RT-qPCR和蛋白質印跡法檢測了牡荊素在煙曲霉菌性角膜炎小鼠及滅活菌絲刺激的巨噬細胞中LOX-1 mRNA及其蛋白的表達情況。實驗結果顯示，煙曲霉菌性角膜炎小鼠及滅活菌絲刺激的RAW264.7細胞中LOX-1 mRNA表達水平較對照組明顯升高；在煙曲霉菌感染的RAW264.7細胞中，LOX-1蛋白水平與對照組相比也顯著升高，與既往研究結果一致[20-21]。以上的研究結果提示，牡荊素可能是通過抑制小鼠或者RAW264.7細胞的LOX-1的表達發揮抗菌作用。既往有研究結果表明，抑制FK小鼠角膜或角膜細胞中的LOX-1水平，可對小鼠角膜細胞發揮保護作用，其機制可能是通過抑制促炎細胞因子的釋放來實現的[20-21]，與本研究結果也基本一致。以上結果表明，牡荊素可能通過抑制LOX-1蛋白表達致炎癥因子水平降低，在FK中發揮其抗炎作用。

綜上所述，牡荊素能有效抑制煙曲霉菌感染引起的角膜炎癥細胞浸潤進而發揮其抗炎作用；牡荊素還能明顯降低FK小鼠角膜及煙曲霉菌處理的RAW264.7細胞中促炎因子IL-1β、IL-6和MIP-2 mRNA的表達水平，其機制可能與抑制LOX-1的蛋白表達有關。本研究結果為牡荊素治療FK的臨床研究提供了一定的實驗依據。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會批準（文件號QYFYWZLL27288）。所有實驗過程均遵照美國眼科和視覺研究協會（ARVO）制定的動物使用原則和標準進行。

作者聲明：徐海寧、易雯丹、賈奕奕、尹敏參與了研究設計；徐海寧、易雯丹、賈奕奕、李翠、趙桂秋、顧凌雯參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）