米諾環素對腦出血小鼠認知功能障礙的影響及其機制

［摘要］目的探討米諾環素（Mcy）對腦出血（ICH）小鼠認知功能障礙的影響及其機制。方法將C57BL/6J雄性小鼠隨機分為A～E組，每組20只。A組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，B組小鼠尾靜脈注射自體血構建ICH模型，C、D組小鼠在B組基礎上每天分別灌胃20、50 mg/kg的Mcy，E組小鼠在D組基礎上再腹腔注射5 μL含有12 μg MK-2206的DMSO溶液，共14 d。處理結束后依據改良神經病學嚴重程度評分（mNSS）評估各組小鼠神經損傷情況，采用水迷宮實驗檢測各組小鼠的認知能力，計算各組小鼠腦組織含水量，采用HE染色方法觀察各組小鼠海馬組織的病理形態，采用TUNEL法檢測各組小鼠海馬組織中神經細胞凋亡情況，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組小鼠海馬組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平，采用Western blot方法檢測各組小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2、磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）及p-Akt蛋白水平。結果神經損傷評估結果顯示，C、D組小鼠mNSS評分較B組顯著降低（q=22.925、55.457，Plt;0.05），E組小鼠mNSS評分較D組顯著升高（q=44.448，Plt;0.05）；水迷宮實驗結果顯示，與B組比較，C、D組小鼠逃避潛伏期、探索時間延長（q=22.169～91.845，Plt;0.05），穿越次數增加（q=18.347、41.936，Plt;0.05）；與D組比較，E組小鼠逃避潛伏期、探索時間延長（q=30.765、85.881，Plt;0.05），穿越次數減少（q=39.315，Plt;0.05）；腦組織含水量和TUNEL染色檢測結果顯示，C、D組小鼠腦組織含水量、海馬組織神經細胞凋亡率較B組降低（q=7.269～33.327，Plt;0.05），E組小鼠腦組織含水量、海馬組織神經細胞凋亡率較D組升高（q=9.957、31.004，Plt;0.05）；ELISA及Western blot實驗檢測結果顯示，與B組比較，C、D組小鼠海馬組織中MDA含量、Bax和PTEN相對表達量降低（q=10.734～22.978，Plt;0.05），SOD和GSH-Px水平、Bcl-2相對表達量及p-Akt/Akt值升高（q=11.862～31.997，Plt;0.05）；與D組比較，E組小鼠海馬組織中MDA含量、Bax和PTEN相對表達量升高（q=14.766～20.400，Plt;0.05），SOD和GSH-Px水平、Bcl-2相對表達量及p-Akt/Akt值降低（q=24.007～30.370，Plt;0.05）。結論Mcy可抑制ICH模型小鼠海馬組織神經細胞凋亡，進而減輕海馬組織損傷，提高學習和記憶能力，改善認知功能障礙，其作用機制可能與其抑制PTEN并激活PI3K/Akt信號通路有關。

［關鍵詞］米諾環素；腦出血；PTEN磷酸水解酶；原癌基因蛋白質c-akt；信號傳導；認知障礙；疾病模型，動物

［中圖分類號］R743.34;R741［文獻標志碼］A

Effect of minocycline on cognitive dysfunction in mice with intracerebral hemorrhage and its mechanismLI Yangyang， FANG Jian， WANG Xiaoxue（Department of Neurology for the Elderly， The First Affiliated Hospital of Henan University， Kaifeng 475001， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of minocycline （Mcy） on cognitive dysfunction in mice with intracerebral hemorrhage （ICH） and its mechanism. MethodsMale C57BL/6J mice were randomly divided into groups A， B， C， D， and E， with 20 mice in each group. The mice in group A were given injection of normal saline via the caudal vein， those in group B were given injection of autologous blood via the caudal vein to establish a model of ICH， those in groups C and D were given Mcy by gavage every day at a dose of 20 mg/kg and 50 mg/kg， respectively， in addition to the treatment in group B， and those in group E were given intraperitoneal injection of 5 μL DMSO solution containing 12 μg MK-2206 in addition to the treatment in group D; the course of treatment was 14 days for all groups. After treatment， modified Neurological Severity Score （mNSS） was used to assess nerve injury of mice in each group; the water maze test was used to evaluate the cognitive ability of mice in each group; brain water content was calculated for mice in each group; HE staining was used to observe the pathological morphology of hippocampal tissue; the TUNEL method was used to measure neuronal apoptosis in hippocampal tissue of mice in each group; ELISA was used to measure the levels of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， and malondialdehyde （MDA） in hippocampal tissue of mice， and Western blot was used to measure the protein expression levels of Bax， Bcl-2， phosphatase and tensin ho-molog （PTEN）， protein kinase B （Akt）， and phosphorylated Akt （p-Akt） in hippocampal tissue. ResultsNerve injury assessment showed that groups C and D had a significantly lower mNSS score than group B （q=22.925，55.457，Plt;0.05）， and group E had a significantly higher mNSS score than group D （q=44.448，Plt;0.05）. The water maze test showed that compared with group B， groups C and D had significantly longer escape latency and exploration time （q=22.169-91.845，Plt;0.05） and a significantly higher number of crossings （q=18.347，41.936，Plt;0.05）， and compared with group D， group E had significantly longer escape latency and exploration time （q=30.765，85.881，Plt;0.05） and a significantly lower number of crossings （q=39.315，Plt;0.05）. The results of brain water content and TUNEL staining showed that compared with group B， groups C and D had significantly lower brain water content and neuronal apoptosis rate in hippocampal tissue （q=7.269-33.327，Plt;0.05）， and compared with group D， group E had significantly higher brain water content and neuronal apoptosis rate （q=9.957，31.004，Plt;0.05）. ELISA and Western blot showed that compared with group B， groups C and D had significantly lower content of MDA and relative expression levels of Bax and PTEN in hippocampal tissue （q=10.734-22.978，Plt;0.05） and significantly higher activities of SOD and GSH-Px， relative expression level of Bcl-2， and p-Akt/Akt ratio （q=11.862-31.997，Plt;0.05）， and compared with group D， group E had significantly higher content of MDA and relative expression levels of Bax and PTEN in hippocampal tissue （q=14.766-20.400，Plt;0.05） and significantly lower activities of SOD and GSH-Px， relative expression level of Bcl-2， and p-Akt/Akt ratio （q=24.007-30.370，Plt;0.05）. ConclusionMcy can inhibit neuronal apoptosis in the hippocampus of ICH mice， thereby alleviating hippocampal injury and improving learning and memory abilities and cognitive dysfunction， possibly by activating the PI3K/Akt signaling pathway after inhibiting PTEN.

［KEY WORDS］Minocycline; Cerebral hemorrhage; PTEN phosphohydrolase; Proto-oncogene proteins c-akt; Signal transduction; Cognition disorders; Disease models， anima

腦出血（ICH）是指原發性而非外傷性腦實質出血[1]，ICH后會引發腦組織血腫，導致顱內活性氧增加，促進顱內氧化應激，進而導致繼發性神經損傷[2]。已知ICH患者的病死率高達35%～52%，出院后患者也可能同時伴有不可逆的神經功能損傷和相關后遺癥，預后較差[3]。統計結果顯示，ICH患者中19.0%～63.3%患者在發病后4年之內會出現認知障礙，并且認知障礙可能會造成患者生活質量的下降以及生存期縮短[4]。磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）是一種腫瘤抑制基因，是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途徑的負調節因子，可使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸去磷酸化，抑制Akt活性[5]。研究顯示，抑制PTEN表達能夠減輕蛛網膜下腔出血大鼠的白質軸突損傷和神經元凋亡，改善ICH后大鼠的繼發性海馬組織損傷和認知功能障礙[5-6]。米諾環素（Mcy）屬于四環素類抗生素，可促進創傷性腦損傷小鼠的神經功能恢復，使腦神經血管重塑[7]；還可改善阿爾茨海默癥小鼠的認知功能障礙以及減輕老年大鼠ICH后的腦積水癥狀[8-9]。但是關于Mcy對ICH小鼠認知功能障礙的作用機制是否與PTEN/PI3K/Akt通路有關目前尚不明確。本研究通過建立ICH小鼠模型，探討Mcy對ICH小鼠認知功能障礙的影響及其具體影響機制，旨在為ICH臨床治療策略的研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠100只，8周齡，體質量22～25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。所有小鼠均飼養于河南大學實驗動物中心，飼養環境：溫度為24～26 ℃，濕度為50%～60%，12/12 h晝夜光照節律，小鼠自由飲食。

1.2主要試劑及儀器

Mcy片劑（規格：0.1 g/片，丹東醫創藥業有限責任公司，國藥準字H10940263）；MK-2206（美國MedChemExpress公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（上海源葉生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海弗元生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；PTEN、Akt、p-Akt兔單抗和GAPDH兔多抗（英國abcam公司）；過氧化物酶標記酶標儀（上海帝肯實驗器材有限公司）；ChemiDoc MP System全能型成像系統（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1ICH模型制備以及各組小鼠的處理將C57BL/6J小鼠適應性飼養1周以后，禁食不禁水12 h，隨機分為A～E組，每組20只。B～E組小鼠參照相關文獻[10]建立ICH小鼠模型并通過Bederson神經功能分級[11]驗證模型是否成功，1～3級為ICH模型構建成功；A組小鼠則以生理鹽水代替自體血注射；C、D組小鼠分別灌胃20、50 mg/kg的Mcy[11]并注射5 μL DMSO溶液；E組小鼠在灌胃50 mg/kg Mcy 30 min后，腹腔注射12 μg的MK-2206（溶于5 μL DMSO溶液）[12]；A、B組小鼠灌胃等劑量生理鹽水，并注射5 μL DMSO溶液；以上處理均每天1次，共14 d。各組小鼠于末次給藥12 h后根據改良神經病學嚴重程度評分（mNSS）[2]評估神經損傷情況。

1.3.2Morris水迷宮實驗[13]檢測各組小鼠認知和學習記憶能力各組小鼠神經功能評估結束后，首先對小鼠進行4 d的訓練，第5天時記錄小鼠找到水下固定平臺的時間（逃避潛伏期），第6天時撤去水下固定平臺，記錄小鼠入水后首次經過平臺的時間（探索時間）以及2 min內穿越平臺的次數（穿越次數）。

1.3.3檢測各組小鼠腦組織含水量每組隨機取5只小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后頸椎脫臼處死，分離腦組織稱取濕質量，將腦組織置于85 ℃烘箱中干燥24 h后稱取干質量，計算腦組織含水量。腦組織含水量（%）=（濕質量－干質量）/濕質量×100%。

1.3.4HE和TUNEL染色觀察各組小鼠海馬組織病理形態及神經細胞凋亡情況剩余小鼠按1.3.3中的方法處死，于無菌環境下解剖小鼠腦組織并分離海馬組織，每組隨機取5只小鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定過夜，各組剩余小鼠的海馬組織置于－80 ℃保存備用。將多聚甲醛中的海馬組織進行常規石蠟包埋切片，再脫蠟水化后，每只小鼠的切片隨機分為兩份。一份進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察各組海馬組織的病理形態；另一份進行TUNEL染色，于熒光顯微鏡下觀察各組海馬組織神經細胞凋亡情況，并計算神經細胞凋亡率。

1.3.5ELISA法檢測各組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px和MDA水平隨機選取1.3.4中各組凍存的5只小鼠的海馬組織進行稱重，按1∶9（質量/體積）比例加入預冷PBS緩沖液中研磨，在4 ℃下離心10 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測上清液當中SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.3.6Western blot實驗檢測各組小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2、PTEN、Akt、p-Akt蛋白的表達水平取1.3.4中凍存的各組剩余的5只小鼠海馬組織加入RIPA裂解液，超聲粉碎后勻漿，4 ℃下離心，取上清液，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。各蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，置于5%脫脂牛奶中4 ℃下封閉過夜；TBST洗滌后，加入相應的一抗（稀釋比例1∶1 000的Bax、Bcl-2、PTEN、Akt、p-Akt），室溫下孵育1 h；TBST洗滌后，再加入二抗繼續室溫孵育1 h，ECL試劑避光顯影。以GAPDH為內參照，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，并計算各目的蛋白的相對表達量。

1.4統計學處理

采用Graphpad prism 8.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組之間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用Tukey檢驗。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1Mcy對各組小鼠神經功能損傷影響

A～E組小鼠mNSS評分分別為（1.36±0.15）、（12.75±1.17）、（7.64±0.59）、（3.28±0.34）、（10.87±1.03）分，各組比較差異具有顯著意義（F=805.341，Plt;0.05）；其中與A組相比，B組小鼠的mNSS評分顯著升高（q=66.701，Plt;0.05）；與B組相比，C組和D組小鼠的mNSS評分顯著降低（q=22.925、55.457，Plt;0.05），且D組小鼠的mNSS評分顯著低于C組（q=25.532，Plt;0.05）；同時與D組相比較，E組小鼠的mNSS評分顯著升高（q=44.448，Plt;0.05）。

2.2Mcy對各組小鼠認知能力影響

5組小鼠逃避潛伏期、探索時間、穿越次數比較差異均具有顯著意義（F=347.982～2 111.114，Plt;0.05）；與A組相比，B組小鼠的逃避潛伏期和探索時間顯著延長，而穿越次數顯著減少（q=42.844～99.417，Plt;0.05）；與B組相比，C組和D組小鼠逃避潛伏期和探索時間顯著減少，穿越次數顯著增多（q=18.347～91.845，Plt;0.05），且D組和C組差異顯著（q=15.527～59.164，Plt;0.05）；與D組相比，E組小鼠逃避潛伏期和探索時間顯著延長，穿越次數顯著減少（q=30.765～85.881，Plt;0.05）。見表1。

2.3Mcy對各組小鼠腦含水量影響

A～E組小鼠腦組織的含水量分別為（58.94±3.75）%、（86.62±5.21）%、（71.83±4.65）%、（62.98±3.72）%、（83.24±5.18）%，各組間比較差異有顯著性（F=35.594，Plt;0.05）；與A組相比，B組小鼠腦組織含水量顯著升高（q=13.604，Plt;0.05）；與B組相比，C組和D組小鼠的腦組織含水量顯著降低（q=7.269、11.618，Plt;0.05），且D組顯著低于C組（q=4.350，Plt;0.05）；與D組相比，E組小鼠的腦組織含水量顯著升高，差異均具有顯著意義（q=9.957，Plt;0.05）。

2.4Mcy對各組小鼠海馬組織病理形態影響

HE染色結果顯示，A組小鼠海馬區神經元排列緊密，細胞結構正常，細胞核清晰；與A組相比，B組小鼠海馬區神經元排列不規則，大量神經元退化，細胞核固縮，且染色加深；與B組相比，C、D組小鼠海馬組織損傷出現不同程度的減輕，神經元排列逐漸規則，細胞核固縮減輕，未見明顯的水腫；與D組相比，E組小鼠神經元損傷嚴重，與B組形態相似。見圖1。

2.5Mcy對各組小鼠海馬組織神經細胞凋亡影響

A～E組小鼠海馬組織神經細胞的凋亡率分別為（2.27±0.21）%、（38.69±2.43）%、（25.38±1.95）%、（11.72±1.23）%、（36.81±2.26）%，各組間比較差異有顯著性（F=381.568，Plt;0.05）；與A組相比，B組小鼠海馬組織神經細胞凋亡率顯著升高（q=45.005，Plt;0.05）；與B組相比，C、D組小鼠海馬組織神經細胞凋亡率均顯著降低（q=16.447、33.327，Plt;0.05），且D組低于C組（q=16.880，Plt;0.05）；此外，與D組相比，E組小鼠海馬組織神經細胞凋亡率顯著升高（q=31.004，Plt;0.05）。見圖2。

2.6Mcy對各組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px和MDA水平影響

5組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA水平比較差異有顯著性（F=132.530～240.371，Plt;0.05）；與A組相比，B組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低，MDA水平顯著升高（q=24.893～33.185，Plt;0.05）；與B組相比，C、D組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px水平顯著升高，MDA水平顯著降低（q=11.862～30.650，Plt;0.05），且D組和C組差異顯著（q=6.481～15.977，Plt;0.05）；與D組相比，E組小鼠海馬組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低，MDA水平顯著升高（q=20.401～28.631，Plt;0.05）。見表2。

5組小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2、PTEN、Akt的相對表達量及p-Akt/Akt比值比較差異具有顯著性（F=70.350～266.677，Plt;0.05）；與A組相比，B組小鼠海馬組織Bax、PTEN相對表達量顯著升高，Bcl-2相對表達量及p-Akt/Akt比值顯著降低（q=18.501～34.709，Plt;0.05）；與B組相比，C、D組小鼠海馬組織中Bax、PTEN的相對表達量顯著降低，Bcl-2相對表達量及p-Akt/Akt比值顯著升高（q=8.735～31.997，Plt;0.05），且C組和D組比較差異具有顯著性（q=6.863～16.812，Plt;0.05）；與D組相比，E組小鼠海馬組織中的Bax、PTEN相對表達量顯著升高，Bcl-2相對表達量以及p-Akt/Akt的比值顯著降低（q=14.766～30.370，Plt;0.05）。詳見圖3和表3。

3討論

近幾十年研究資料顯示，ICH患者具有較高的相關死亡率和發病率，患者不僅有再出血的風險，且發生動脈缺血事件的風險也高于普通人群[14]。腦組織血腫部位的周圍水腫是ICH繼發性腦損傷的可量化標志之一，其主要表現為腦組織的含水量增加[15]。目前ICH尚無特效治療方法，現有療法雖能夠顯著降低患者的死亡率，但對預后的改善效果有限。即使通過手術清除血腫，ICH患者的神經功能缺損也會持續惡化，主要是由于ICH后繼發性腦損傷致神經元丟失，進一步致神經功能發生不可逆的損傷[16]。目前研究顯示，Mcy可通過降低ICH小鼠中細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑的表達，減輕血腦屏障破壞，緩解神經炎癥，抑制神經細胞變性和死亡，進而發揮神經保護作用[17]。Mcy還可通過抑制腦小血管周圍細胞外基質的降解，降低腦淀粉樣血管病相關ICH的復發風險[18]。基于此，本研究通過建立ICH小鼠模型探討Mcy對于小鼠認知功能障礙的影響，結果顯示B組小鼠的神經功能損傷評分升高，且在水迷宮實驗中逃避潛伏期和探索時間增長，穿越平臺的次數減少，腦含水量升高，說明ICH小鼠模型建立成功。當Mcy低、高劑量干預后，小鼠神經功能損傷評分顯著降低，腦含水量下降，逃避潛伏期和探索平臺時間縮短，2 min內穿越平臺次數增多，且高劑量Mcy干預的小鼠上述各指標變化幅度均高于低劑量干預小鼠。上述結果提示Mcy能夠顯著提高ICH小鼠學習和記憶能力，減輕腦血腫周圍組織的水腫，從而改善小鼠認知功能障礙，且高劑量Mcy效果更好。

神經細胞凋亡是ICH后血腫周圍組織損傷的主要機制，ICH后誘導神經細胞凋亡的因素很多，如細胞因子刺激、血液成分的誘導以及各種基因調節作用，包括促進凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達[19-20]。本研究結果顯示，相較于B組，C組和D組小鼠海馬組織神經元損傷減輕，腦含水量下降，且神經細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2表達升高，提示Mcy能夠抑制ICH小鼠的神經元凋亡，進而改善小鼠的神經功能障礙。已知氧化應激在ICH引發腦水腫和繼發性腦損傷中也起著重要作用[21]。ICH后會產生大量的自由基，導致脂質過氧化水平升高，MDA是臨床研究中最常用的脂質過氧化生物標志物，而SOD和GSH-Px是維持抗氧化防御系統穩態的重要抗氧化酶[21-22]。本研究結果顯示，C組和D組小鼠海馬組織中SOD和GSH-Px水平較B組升高，MDA水平較B組降低，提示Mcy抑制了ICH小鼠的氧化應激反應，進而抑制了其神經元凋亡。

近年來，PTEN被發現是具有脂質/蛋白質雙特異性磷酸酶活性的癌基因，可以參與多種疾病的發展，與氧化應激和炎癥也密切相關，在神經系統疾病的發生發展中有重要作用[23]。PTEN作為Akt信號通路的上游負調節因子，可通過抑制Akt活性，間接抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化。在創傷性腦損傷小鼠中，PTEN缺失可通過持續激活Akt/mTOR通路，促進軸突再生和皮質重映射，從而改善預后[24]。近期有研究發現，在帕金森病毒素（6-羥多巴胺或魚藤酮）致小鼠神經元損傷模型中，過氧化氫酶和Mito-TEMPO（一種線粒體特異性超氧化物清除劑）等抗氧化劑的加入可通過調節PTEN/Akt通路介導的自噬，抑制神經元凋亡[25]。另外，左西孟旦可能通過調控PTEN/Akt信號通路調節鐵死亡，顯著減輕慢性缺氧大鼠的腦損傷程度[26]。本研究結果顯示，與B組比較，C、D組小鼠海馬組織PTEN表達顯著降低，p-Akt/Akt比值顯著升高，且D組變化幅度大于C組，表明Mcy可以通過調節PTEN/Akt信號通路發揮神經保護作用，并且高劑量效果更好。為了進一步證實PTEN/Akt信號途徑在Mcy改善ICH小鼠認知功能障礙中的作用，本研究在Mcy治療的基礎上又通過Akt抑制劑進行了回補實驗，結果顯示，相較于D組小鼠，E組中Mcy對ICH小鼠認知功能障礙、神經損傷以及氧化應激反應的改善作用被逆轉，且PTEN的表達升高，進一步說明Mcy改善ICH小鼠認知功能障礙的作用機制可能與抑制PTEN并激活PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，Mcy可通過調節ICH模型中小鼠海馬組織的氧化和抗氧化平衡，抑制神經元凋亡，提高小鼠的學習和記憶能力，進而改善ICH模型小鼠的認知功能障礙，其作用機制可能與抑制海馬組織中PTEN表達并激活PI3K/Akt信號通路有關。然而關于Mcy對ICH后認知功能障礙的具體影響機制較為復雜，還需要后續進行進一步深入研究和完善。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有動物實驗均已通過河南大學第一附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號202205-078）。所有實驗過程均遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》進行。

作者聲明：李陽陽、方建參與了研究設計；李陽陽、王曉雪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）