腦蛋白水解物-Ⅰ對D-半乳糖致PC12細胞衰老的影響及其機制

［摘要］目的探討腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）對D-半乳糖（D-Gal）致PC12細胞衰老的影響及其機制。方法將PC12細胞分為對照組（常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（D-Gal誘導）、低濃度組和高濃度組（在模型組基礎上分別給予60、120 mg/L的CH-Ⅰ）。利用β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色法檢測各組PC12細胞衰老率，采用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，采用Western Blot方法檢測各組細胞中p-STAT3、TERT相對表達水平，采用PCR-ELISA法檢測各組細胞中端粒酶的活性。結果與對照組相比，模型組細胞衰老率和凋亡率顯著升高（tLSD=27.03、17.77，Plt;0.05），端粒酶活性顯著下降（tLSD=6.21，Plt;0.05）。與模型組相比，低、高濃度組SA-β-Gal細胞衰老率和凋亡率均明顯降低（tLSD=7.74～21.43，Plt;0.05），端粒酶活性均顯著升高（tLSD=2.01、2.49，Plt;0.05），細胞中TERT、p-STAT3相對表達水平顯著升高（tLSD=2.21～6.03，Plt;0.05）。結論CH-Ⅰ可能是通過促進STAT3磷酸化，上調PC12細胞的TERT表達和端粒酶活性，從而減輕D-Gal誘導的PC12細胞衰老。

［關鍵詞］細胞衰老；PC12細胞；腦蛋白水解物-Ⅰ；半乳糖；端粒酶

［中圖分類號］R329.25［文獻標志碼］A

Effect and mechanism of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ on senescence of PC12 cells induced by D-galactose" YANG Guangwen， NI Qinshuai， WANG Yuanming， ZHU Lin， QIAO Bing（Department of Radiology， The Sixth Peoples’ Hospital of Qingdao， Qingdao 266023， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ （CH-Ⅰ） on senescence of PC12 cells induced by D-galactose （D-Gal）. MethodsPC12 cells were divided into control group （routine culture）， model group （induced by D-Gal）， low concentration group （treated with 60 mg/L CH-I in addition to the treatment in the model group）， and high concentration group （treated with 120 mg/L CH-I in addition to the treatment in the model group）. SA-β-Gal staining was used to measure the senescence rate of PC12 cells in each group; flow cytometry was used to measure the apoptosis rate of cells in each group; Western blot was used to measure the relative expression levels of phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 （p-STAT3） and telomerase reverse transcriptase （TERT） in PC12 cells， and PCR-ELISA was used to measure the activity of telomerase in each group. ResultsCompared with the control group， the model group had significant increases in the senescence rate and apoptosis rate of cells （tLSD=27.03，17.77，Plt;0.05） and a significant reduction in telomerase activity （tLSD=6.21，Plt;0.05）. Compared with the model group， the low and high concentration groups had significant reductions in the senescence rate and apoptosis rate of SA-β-Gal cells （tLSD=7.74-21.43，Plt;0.05） and significant increases in telomerase activity （tLSD=2.01，2.49，Plt;0.05） and the relative expression levels of TERT and p-STAT3 in cells （tLSD=2.21-6.03，Plt;0.05）. ConclusionCH-Ⅰ may alleviate the senescence of PC12 cells induced by D-Gal by promoting STAT3 phosphorylation， upregula-ting the expression of TERT， and increasing telomerase activity.

［KEY WORDS］Cellular senescence; PC12 cells; Cerebroprotein hydrolysate-1; Galactose; Telomerase

隨著年齡的不斷增長，人類大腦中的神經元數量逐漸減少，大腦體積逐漸減小，大腦呈衰老狀態(tài)，學習和記憶能力下降，阿爾茨海默病（AD）或帕金森病等中樞神經系統(tǒng)退行性疾病的患病率可能逐漸增高[1-3]。研究發(fā)現，人腦內端粒酶活性降低或者水平下降均可導致神經元衰老和死亡，致認知功能衰退[4]，同時腦損傷等因素也會顯著影響端粒酶的表達水平[5]。SHIM等[6]的研究發(fā)現，端粒酶逆轉錄酶（TERT）是端粒酶的主要酶催化亞單位，可抑制AD大鼠海馬神經細胞凋亡和缺血性神經細胞死亡[7]。目前關于緩解神經元衰老或損傷的有效藥物或方法鮮有報道。腦蛋白水解產物-Ⅰ（CH-Ⅰ）是從豬腦中提取的多肽混合物，具有抑制神經炎癥等作用[8]。研究顯示，CH-Ⅰ在腦卒中和AD等疾病的治療中具有潛在的應用價值[9-10]。WU等[11]研究結果顯示，CH-Ⅰ具有抑制血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡的作用，其作用機制與激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路有關；CH-Ⅰ還可通過提高端粒酶的活性從而抑制小鼠海馬神經元細胞衰老[12-13]，但以上作用機制均不甚明確。本研究通過D-半乳糖（D-gal）誘導PC12細胞構建衰老模型，探究CH-Ⅰ的神經保護作用及其可能機制。

1材料和方法

1.1細胞、試劑及儀器

PC12細胞（大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株）購買于上海賽百慷生物技術股份有限公司。CH-Ⅰ注射液（#0190501-1，30 mg/支）購自河北智同生物制藥股份有限公司，D-gal（K1915124，純度≥99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色試劑盒（C0602）購買于上海碧云天生物技術有限公司，p-STAT3（Tyr705，AF3293）、β-actin（AF7018）抗體購自美國Affinity公司，TERT抗體（NB100-317）購買于美國Novus公司。酶標儀（SYNERGYH1）購買于美國Bio-Tek公司，垂直電泳儀（PowerPacTMHC）購買于美國Bio-Rad公司，光學顯微鏡（IX-70）購買于日本Olympus公司，流式細胞儀（CytoFLEXS）購自美國Beckman Coulter公司。

1.2SA-β-Gal染色檢測PC12細胞衰老率

PC12細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含有5%胎牛血清）中，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至對數生長期時，每孔按1×105個細胞的密度接種于6孔板中，分為對照組、模型組、低濃度組和高濃度組。對照組于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；模型組經20 g/L的D-Gal誘導48 h成功后[14]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；低濃度組和高濃度組經20 g/L的D-Gal誘導48 h成功后，分別加入60、120 mg/L的CH-Ⅰ繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據SA-β-Gal染色試劑盒說明書進行染色后，于光學顯微鏡下計數衰老細胞，并計算細胞衰老率。衰老細胞率=（藍染細胞數量/總細胞數量）×100%。實驗重復3次，結果取平均值。

1.3流式細胞術檢測PC12細胞凋亡率

取各組處理結束的PC12細胞以2.5%胰酶（不含EDTA）消化后，4 ℃下1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。用預冷的PBS洗滌2次，再次4 ℃下1 000 r/min離心 5 min，棄上清液。嚴格按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒的說明書操作要求進行染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，使用CytExpert軟件分析計算細胞凋亡率。實驗重復3次，結果取平均值。

1.4Western Bolt法檢測PC12細胞蛋白表達

取各組處理結束的PC12細胞，加入RIPA裂解液，靜置5 min裂解細胞，移至新的EP離心管中，冰上靜置15 min，以12 000 r/min離心10 min，提取細胞當中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離各組蛋白樣品，電轉移至PVDF膜，室溫封閉2 h，洗膜后加一抗（TERT 1∶500、p-STAT3 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然后加山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1.5 h。使用ECL發(fā)光液顯色，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達水平。實驗重復3次，結果取平均值。

1.5PCR-ELISA法檢測PC12細胞端粒酶活性

取各組處理結束的PC12細胞，向EP管中加入PCR-ELISA試劑盒自帶的裂解液，充分裂解細胞后，加入至含有端粒酶底物的試管中，使用熒光定量PCR儀進行擴增，具體儀器程序設置如下：預變性94 ℃ 30 s；變性94 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 30 s，共30個循環(huán)。以RNA酶滅活的裂解物為陰性對照，試劑盒獲得的提取物作為陽性對照。向上述PCR產物（50 μL）中加入變性試劑25 μL和雜交緩沖液25 μL（共100 μL）搖床振蕩孵育2 h，加入100 μL抗地高辛過氧化物酶溶液搖床振蕩30 min，隨后進行TMB顯色液顯色。使用酶標儀分別在波長450、690 nm處測定樣品的吸光度（A）值，并計算各樣本的相對吸光度值，以相對吸光度值作為端粒酶相對表達量即端粒酶活性，以相對吸光度值大于0.2為端粒酶陽性。相對吸光度值=（樣品A450nm－樣品A690nm）－（陰性對照A450nm－陰性對照A690nm）。實驗重復3次，結果取平均值。

1.6統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組細胞衰老率比較

對照組、模型組及低、高濃度組細胞衰老率分別為（15.67±2.08）%、（54.33±4.04）%、（42.33±2.76）%、（34.67±1.53）%，各組間比較差異有顯著性（F=121.00，Plt;0.05）；其中與模型組細胞相比較，對照組細胞以及低、高濃度組細胞衰老率均顯著降低（tLSD=7.74～27.03，Plt;0.05），與低濃度組相比較，高濃度組細胞衰老率顯著降低（tLSD=7.66，Plt;0.05）。見圖1，圖中箭頭指向的藍染細胞為衰老細胞。

2.2各組細胞凋亡率比較

對照組、模型組及低、高濃度組細胞凋亡率分別為（9.39±2.93）%、（43.90±5.31）%、（26.20±4.15）%、（20.27±3.20）%，各組間比較差異有顯著性（F=32.21，Plt;0.05）；其中與對照組相比，模型組細胞凋亡率明顯增高（tLSD=17.77，Plt;0.05），而與模型組相比，低、高濃度組細胞凋亡率明顯降低（tLSD=8.25、21.43，Plt;0.05），低、高濃度組比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖2。

2.3各組細胞中端粒酶活性比較

對照組、模型組和低、高濃度組細胞的端粒酶活性分別為1.15±0.19、0.65±0.17、0.77±0.16、0.85±0.19，各組間比較差異具有顯著性（F=4.32，Plt;0.05）；其中與對照組相比，模型組細胞端粒酶活性顯著降低（tLSD=6.21，Plt;0.05），與模型組相比較，低、高濃度組細胞端粒酶活性顯著升高（tLSD=2.01、2.49，Plt;0.05），低、高濃度組比較差異無顯著性（P＞0.05）。

2.4各組細胞中TERT、p-STAT3蛋白相對表達水平比較

對照組、模型組和低、高濃度組細胞的TERT蛋白相對表達水平分別為0.34±0.12、0.16±0.06、0.25±0.05、0.27±0.06，p-STAT3蛋白相對表達水平分別為0.64±0.09、0.51±0.07、0.81±0.09、0.92±0.10，各組間比較差異具有顯著性（F=7.65、9.24，Plt;0.05）；其中與對照組相比較，模型組細胞中的TERT和p-STAT3蛋白相對表達水平顯著降低（tLSD=2.61、2.36，Plt;0.05）；與模型組比較，低、高濃度組細胞中TERT和p-STAT3蛋白相對表達水平均顯著升高（tLSD=2.21～6.03，Plt;0.05）；低濃度組與高濃度組無顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

3討論

PC12細胞是目前用于研究神經細胞損傷機制及藥物對神經細胞保護作用的理想細胞模型。D-Gal是一種還原糖，動物實驗中長期高濃度給藥后可在體內轉化為半乳糖，而半乳糖又可以增加活性氧自由基（ROS）的生成。HONG等[15]的研究顯示，D-Gal在PC12細胞和小鼠體內的異常聚集可能會導致神經系統(tǒng)的衰老。因此，本研究以D-Gal誘導PC12細胞構建細胞衰老模型，結果顯示，給予PC12細胞D-Gal處理后，PC12細胞衰老率顯著增加，這與既往的研究結果相似[16]。

XING等[17]研究顯示，CH-Ⅰ在年齡相關性疾病的治療中具有類神經營養(yǎng)因子的作用。為了研究CH-Ⅰ對衰老神經元的保護作用及其可能作用機制，本研究采用SA-β-Gal染色檢測CH-Ⅰ是否具有影響PC12細胞衰老的作用，結果顯示CH-Ⅰ可以明顯地降低D-Gal誘導的PC12細胞衰老率，提示CH-Ⅰ可以緩解神經元細胞衰老。為了進一步研究CH-Ⅰ對PC12細胞凋亡的影響，本研究使用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示CH-Ⅰ可以顯著地抑制D-Gal誘導的細胞凋亡。以上結果提示CH-Ⅰ對D-Gal誘導的細胞衰老和凋亡具有一定的保護和抑制作用。

既往研究證實，端粒酶在腦衰老（如AD）中有重要作用，TERT是端粒酶的關鍵結構和主要調節(jié)亞基。在SD大鼠腦缺血損傷模型中，通過誘導神經元中的TERT表達，可以顯著降低大鼠缺血性神經元的損傷程度[18]。臨床病理研究顯示，在AD患者的海馬神經元中，端粒酶活性和TERT水平均顯著降低[19]。由此推測通過恢復端粒酶活性和提高TERT表達水平，也許能夠阻止神經元的老化。目前，利用神經損傷模型以探究端粒酶和TERT在神經系統(tǒng)中的作用已取得了一定的進展[20-21]。新近研究也顯示，通過藥物影響端粒酶活性可以起到一定的抗衰老作用[22-23]。為了研究CH-Ⅰ對衰老神經元的保護作用機制，本研究又進行了PCR-ELISA和Western Blot實驗，結果顯示，與模型組比較，低、高濃度組中PC12細胞的端粒酶活性顯著增高，TERT表達水平顯著升高，提示CH-Ⅰ可能是通過增強TERT表達和提高端粒酶活性而發(fā)揮神經保護作用。既往研究表明，TERT受多種轉錄因子的調控，STAT3與TERT的調控密切相關，其磷酸化后可促進TERT表達，增加端粒酶活性[24]。本研究結果顯示，與模型組比較，低、高濃度組PC12細胞中p-STAT3蛋白相對表達水平顯著升高，這提示CH-Ⅰ提高衰老PC12細胞中端粒酶活性可能是通過促進STAT3蛋白磷酸化，繼而上調TERT的表達實現的。

綜上所述，CH-Ⅰ可以減輕D-Gal誘導的PC12細胞衰老和細胞凋亡，其具體作用機制可能與促進STAT3磷酸化，進而上調PC12細胞中TERT表達水平和端粒酶活性有關。本研究為CH-Ⅰ用于衰老相關神經系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎，并為CH-Ⅰ的臨床應用提供了新思路。

作者聲明：楊光文、朱琳、喬兵參與了研究設計；楊光文、王圓明、朱琳、倪欽帥參與了論文寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）