結直腸癌組織中天冬酰胺合成酶的表達及其臨床意義

［摘要］目的探討天冬酰胺合成酶（ASNS）在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的表達及其與患者臨床病理特征和預后的關系。方法收集2017年1月－2018年12月在本院手術切除的143例原發性CRC患者的石蠟組織樣本及臨床病理資料，采用免疫組織化學法檢測CRC組織及其癌旁正常組織中ASNS表達水平，并分析CRC中ASNS的表達與患者臨床病理特征以及預后的關系。結果CRC腫瘤組織中ASNS表達水平顯著高于癌旁正常組織（χ2=28.078，Plt;0.05）；CRC腫瘤組織中ASNS的表達水平與患者的TNM分期、淋巴結轉移及脈管癌栓顯著相關（χ2=7.042～10.724，Plt;0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，CRC腫瘤組織中ASNS高表達的患者無病生存期更短（χ2=6.440，Plt;0.05），而ASNS的表達水平對于CRC患者總生存期無影響（P＞0.05）。結論ASNS在CRC腫瘤組織中高表達，且ASNS的表達水平與患者無病生存結局更差有關，可作為預測CRC預后的潛在生物學指標。

［關鍵詞］結直腸腫瘤；天冬酰胺連結酶；免疫組織化學；腫瘤分期；淋巴轉移；脈管癌栓；預后

［中圖分類號］R375.34［文獻標志碼］A

Expression of asparagine synthetase and its clinical significance in colorectal cancer tissue" YAO Yifan， LI Na， RAN Wenwen， ZHAO Han， XING Xiaoming （Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of asparagine synthetase （ASNS） in colorectal cancer （CRC） and its association with the clinicopathological features and prognosis of patients. MethodsParaffin-embedded tissue samples and clinicopathological data were collected from 143 patients with primary CRC who underwent surgical resection in our hospital from Ja-nuary 2017 to December 2018. Immunohistochemistry was used to measure the expression level of ASNS in CRC tissue and adjacent normal tissue， and the association of ASNS expression in CRC tissue with the clinicopathological features and prognosis of patients were analyzed. ResultsThe expression level of ASNS in CRC tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue （χ2=28.078，Plt;0.05）， and the expression level of ASNS in CRC tissue was significantly associated with TNM stage， lymph node metastasis， and vascular tumor thrombus （χ2=7.042-10.724，Plt;0.05）. The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with a high expression level of ASNS in CRC tumor tissue tended to have a shorter disease-free survival time （χ2=6.440，Plt;0.05）， while the expression level of ASNS had no influence on the overall survival time of CRC patients （Pgt;0.05）. ConclusionASNS is highly expressed in CRC tissue， and the expression level of ASNS might be associated with the poorer disease-free survival of patients. Therefore， it can be used as a potential biomarker for predicting the prognosis of CRC.

［KEY WORDS］Colorectal neoplasms; Aspartate-ammonia ligase; Immunohistochemistry; Neoplasm staging; Lymphatic metastasis; Vascular tumor thrombus; Prognosis

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種全世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤[1]。手術是原發性CRC的首選治療方案，其次是輔助放射治療及藥物治療[2]。然而，對于晚期、復發或轉移的CRC患者，目前的治療方案療效有限[3]。因此，深入探討CRC發生發展的分子機制，尋找可靠的預后標志物，開發新治療靶點，是改善患者預后的關鍵。

腫瘤發生發展需要相應的能量代謝及物質基礎，谷氨酰胺是腫瘤細胞生長代謝所必需的關鍵營養物質，相較于正常細胞，腫瘤細胞新陳代謝更快，對谷氨酰胺的需求更高[4]。因此，研究腫瘤組織中谷氨酰胺的代謝狀況，對于揭示結直腸癌的生長代謝特征以及深入理解結直腸癌的發病機制具有重要意義。天冬酰胺合成酶（ASNS）基因位于人類染色體7q21.3上[5]，其編碼的蛋白屬于氨基酸轉移酶家族成員，由2個結構域組成：N端催化谷氨酰胺水解，C端催化天冬氨酸（Asp）的羧酸鹽與腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）反應生成天冬酰胺。ASNS的主要功能是以ATP依賴性方式催化Asp轉化為天冬酰胺（Asn），參與了細胞的氨基酸代謝以及能量代謝等[6]。研究發現，ASNS在多種腫瘤組織中高表達，例如胃癌[7]、黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10-11]等，其表達水平升高可加速腫瘤的發生發展。然而，ASNS在CRC患者腫瘤組織中的表達情況及其與患者預后的關系尚未可知。本研究首先檢測ASNS在CRC腫瘤組織中的表達水平，并分析其表達水平與患者臨床病理特征的關系及對患者預后的影響。

1材料與方法

1.1GEPIA數據庫分析

基于GEPIA數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析ASNS在結腸癌（COAD）和直腸癌（READ）組織及其癌旁正常組織的表達情況。

1.2臨床組織樣本的收集

收集2017年1月－2018年12月于青島大學附屬醫院接受手術切除治療的143例原發性CRC患者的石蠟組織樣本（腫瘤組織及癌旁正常組織）和臨床病理資料（包括患者性別、年齡及腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、神經侵犯、脈管癌栓情況），并且隨訪患者的預后情況，末次隨訪時間為2024年1月5日。所有患者術前均未行新輔助治療，無結直腸癌家族史，未合并其他惡性腫瘤。

1.3組織芯片制備及免疫組織化學染色

將患者的腫瘤組織及癌旁正常組織石蠟樣本制備成厚4 μm、直徑2.0 mm的組織芯片，經脫蠟水化處理后，以EDTA修復液（pH值為9.0）對切片高壓修復2 min，置于3%過氧化氫溶液中室溫反應30 min。以PBS洗滌3次后，使用5%牛血清白蛋白封閉10 min，滴加ASNS一抗稀釋液（1∶600），4 ℃孵育過夜。滴加通用型二抗37 ℃反應30 min，滴加DAB試劑顯色。經蘇木素復染后，用中性樹膠封片。

使用光學顯微鏡觀察切片的染色情況，染色結果由2位病理醫師采用雙盲法進行評分，當評分不一致時，再增加1位病理醫師進行判讀。以腫瘤細胞的細胞質和（或）細胞核內出現棕黃色顆粒作為ASNS染色陽性，無著色為ASNS染色陰性。染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時陽性細胞比例評分：陽性細胞比例lt;25%為1分，25%≤陽性細胞比例lt;50%為2分，50%≤陽性細胞比例lt;75%為3分， 75%≤陽性細胞比例≤100%為4分。綜合得分計算方法：染色強度評分×陽性細胞比例評分。根據腫瘤組織中ASNS的綜合得分將所有患者分為兩組，ASNS無-低表達組（1～3分）和ASNS高表達組（4～12分）。

1.4統計學處理

采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析，使用Graphpad Prism 7軟件繪圖。兩組間比較采用Pearson χ2檢驗。Kaplan-Meier法和Log Rank檢驗用于生存分析，所有檢驗為雙尾，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1GEPIA數據庫分析結果

COAD和READ腫瘤組織中ASNS基因表達水平顯著高于正常組織（Plt;0.05）。

2.2ASNS在臨床樣本中的表達水平

免疫組織化學染色的結果顯示，143例原發性CRC患者癌旁正常組織當中ASNS高表達者36例（25.17%），ASNS無-低表達者107例（74.83%）；腫瘤組織中ASNS高表達者80例（55.94%），ASNS無-低表達者63例（44.06%）。CRC腫瘤組織當中ASNS高表達者比例顯著高于癌旁正常組織（χ2=28.078，Plt;0.05）。見圖1。

2.3CRC腫瘤組織中ASNS表達水平與患者臨床病理特征的關系

腫瘤組織中ASNS表達水平與患者的TNM分期、淋巴結轉移以及脈管癌栓有關（χ2=7.042～10.724，Plt;0.05），而與患者年齡、性別及腫瘤大小、分化程度、神經侵犯情況無顯著相關性（P＞0.05）。見表1。

2.4CRC腫瘤組織中ASNS表達水平與患者預后的關系

CRC患者隨訪時間1～84月，中位隨訪時間62（35，72）月。截至隨訪結束，ASNS無-低表達組患者的中位無病生存時間64（60，71）月，無病情進展患者39例；復發/轉移患者20例（腸局部復發3例，腸周淋巴結轉移4例，遠處肝轉移8例，肺轉移4例，骨轉移1例），其中18例患者死亡；另有4例患者失訪。ASNS高表達組患者的中位無病生存期55（24，74）月，無病情進展患者28例；復發/轉移患者44例（腸局部復發12例，腸周淋巴結轉移5例，遠處肝轉移13例，肺轉移10例，骨轉移4例），其中18例患者死亡；另有8例患者失訪。Kaplan-Meier生存分析顯示，相較于ASNS無-低表達組的患者，ASNS高表達組患者無病生存期更短（χ2=6.440，Plt;0.05），兩組患者的總生存期無顯著統計學差異（P＞0.05）。見圖2。

3討論

CRC作為臨床上常見的惡性消化道腫瘤，其治療手段包括放療和免疫治療等，但患者的生存率和疾病控制情況仍然有待提高。本研究發現ASNS在CRC組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織，且與患者的TNM分期、淋巴結轉移及脈管癌栓顯著相關，ASNS高表達的患者無病生存期更短。

ASNS是一種在ATP依賴性反應中將天冬氨酸和谷氨酰胺轉化為天冬酰胺和谷氨酸的酶，但其功能不僅限于催化天冬酰胺的合成，其還參與了細胞的代謝調節[12]。腫瘤組織中ASNS基因表達水平均顯著高于癌旁正常組織。雖然ASNS在CRC中作用及機制研究尚未明確，但在其他實體腫瘤中已有相關研究。DENG等[13]發現p53的缺失可以導致腫瘤細胞內氨代謝重組，破壞腫瘤細胞內外環境中天冬酰胺和天冬氨酸的平衡狀態，促進腫瘤細胞的增殖，p53的缺失可以上調ASNS的表達。LI等[8]研究顯示，敲降ASNS基因表達可以抑制黑色素瘤細胞和表皮樣癌細胞的生長，并誘導黑色素瘤細胞在G0/G1細胞周期停滯，說明ASNS可能會促進黑色素瘤細胞的增殖。通過調節ASNS的活性或表達水平，可以影響腫瘤細胞對氨基酸的利用，從而干擾其代謝適應性[14]。

腫瘤細胞常處于低氧和營養缺乏的微環境中，因此它們通過加強糖酵解過程來滿足其快速增殖和細胞分裂的能量需求。研究表明，在葡萄糖缺乏條件下，增強ASNS的表達可以促進JNK/SAPK活化，保護胰腺癌細胞免受由葡萄糖剝奪和順鉑誘導的細胞凋亡，ASNS在胰腺癌細胞中可能起到抗凋亡作用，可促進胰腺癌細胞增殖及腫瘤形成[10]。這表明ASNS在調節葡萄糖代謝通路中發揮作用，影響腫瘤細胞對葡萄糖的利用和能量的產生。ASNS在腫瘤細胞的應激響應和凋亡調節當中起到促進作用[15]。研究表明，ASNS的表達水平在細胞應激的條件下上調，從而保護腫瘤細胞免受應激損傷，而ASNS的過度表達與細胞凋亡逃逸和治療抵抗相關[15-17]。研究結果顯示在GEPIA數據庫中COAD和READ組織中ASNS基因表達水平均顯著高于正常組織。基于上述結果，本研究進一步收集并檢測了本院143例原發性CRC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織樣本。免疫組化檢測結果顯示，腫瘤組織中ASNS高表達者占比55.94%，癌旁正常組織ASNS高表達者占比25.17%，腫瘤組織中ASNS高表達比例顯著高于癌旁正常組織，與先前研究結果基本一致。另外本研究中，腫瘤組織中ASNS表達水平與CRC患者的TNM分期、淋巴結轉移及脈管癌栓顯著相關，與患者年齡、性別及腫瘤大小、分化程度、神經侵犯情況無顯著相關性，表明ASNS高表達者腫瘤的生物學行為更差，上述結果均提示ASNS可能在腫瘤進展中發揮一定作用，也與先前的研究結果基本一致。基于上述研究結果，我們推測ASNS高表達在CRC中可能起促癌作用，ASNS有望成為CRC治療的潛在靶點。

ASNS是否在不同腫瘤中具有相似的生物學功能，且是否與患者預后緊密相關是一個值得關注的問題。GAN等[18]研究顯示，ASNS可以作為腎透明細胞癌患者的獨立預后因素。另有研究發現乳腺癌組織中ASNS的表達水平與患者的腫瘤分期及淋巴結轉移有關，ASNS陽性是乳腺癌患者不良生存預后的獨立因素[19-20]。而在非實體腫瘤中，有研究發現在急性淋巴細胞白血病中，ASNS的表達水平往往較低[21]。本研究中ASNS高表達組患者相較于ASNS無-低表達組，其無病生存期顯著縮短，表明了ASNS高表達與CRC患者預后不良有關，與先前ASNS在實體腫瘤中提示不良預后的研究結果基本一致。

ASNS在腫瘤進展中的調控作用為未來的腫瘤治療策略提供了新的視角。一方面可通過開發特異性的ASNS抑制劑干擾腫瘤細胞對天冬氨酸的合成，從而抑制腫瘤生長和增殖，削弱其代謝適應性和生存能力[22-25]；另一方面可采用聯合治療策略，將ASNS抑制劑與其他治療方法（如化療藥物或放療）相結合，可能產生協同效應，提高治療效果[6，14]。ASNS抑制劑可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，從而降低治療劑量和副作用。

綜上所述，ASNS在CRC患者腫瘤組織中呈高表達，且ASNS高表達與CRC的浸潤、轉移及患者的不良預后相關。未來的研究工作將進一步探索ASNS在CRC中的作用機制，從而為CRC的防治提供新思路。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL28161）。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：邢曉明、姚一凡、冉雯雯、趙涵參與了研究設計；姚一凡、李娜參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）