DPM1基因單核苷酸多態性與兒童過敏性紫癜的相關性

［摘要］目的探討DPM1基因單核苷酸多態性與兒童過敏性紫癜的相關性。方法選擇2021年4月—2022年3月于青島大學附屬醫院接受診治的過敏性紫癜兒童156例作為病例組，另外選擇同期體檢健康的兒童152例作為對照組。根據患兒是否出現腹痛和關節疼痛的癥狀分為有腹痛亞組、無腹痛亞組和有關節痛亞組、無關節痛亞組；按照患兒是否伴有紫癜性腎炎將其分為紫癜性腎炎亞組與非紫癜性腎炎亞組。收集各組臨床資料，并從受試者外周血中提取全血DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術對DPM1基因的rs73909842位點進行基因型鑒定和統計學分析。結果病例組rs73909842基因型C/G、G/G、C/C頻率與對照組相比，差異具有統計學意義（χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292～5.208，P＜0.05）；等位基因C頻率與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162～4.337，P＜0.05）。rs73909842基因型及等位基因頻率在各臨床亞組中差異無統計學意義。結論DPM1基因rs73909842位點的SNP多態性與兒童過敏性紫癜的發病相關，等位基因C可能是其易感基因。

［關鍵詞］IgA血管炎；甘露糖基轉移酶類；多態性，單核苷酸；基因型；等位基因；基因頻率；兒童

［中圖分類號］R725.546［文獻標志碼］A

Association between DPM1 gene single nucleotide polymorphism and Henoch-Schnlein purpura in childrenGAO Xin， ZHANG Qiuye， CHANG Hong， BAI Cui， WANG Dahai， SHAO Leping， LIN Yi （Department of Nephrology， Rheumatology and Immunology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the association between DPM1 gene single nucleotide polymorphism and Henoch-Schnlein purpura in children. MethodsA total of 156 children with Henoch-Schnlein purpura who were diagnosed and treated in The Affiliated Hospital of Qingdao University from April 2021 to March 2022 were enrolled as case group， and 152 healthy children who underwent physical examination during the same period of time were enrolled as control group. According to the presence or absence of the symptoms of abdominal pain and joint pain， the children were divided into abdominal pain group， non-abdominal pain group， joint pain group， and non-joint pain group; according to whether a child was comorbid with purpura nephritis， they were divided into purpura nephritis group and non-purpura nephritis group. Related clinical data were collected from each group; whole blood DNA was extracted from the peripheral blood of subjects， and the iMLDRTM multiplex SNP typing technique was used to determine the genotype of the rs73909842 locus of the DPM1; a statistical analysis was performed. ResultsThere were significant differences in the frequency of C/G， G/G， and C/C genotypes at the rs73909842 locus between the case group and the control group （χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292-5.208，Plt;0.05）， and there was also a significant difference in the frequency of C allele between the two groups （χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162-4.337，Plt;0.05）. There were no significant diffe-rences in the frequencies of genotypes and alleles at the rs73909842 locus between the above clinical subgroups. ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the DPM1 gene at the rs73909842 locus was associated with the onset of Henoch-Schnlein purpura in children， and allele C may be a susceptible gene.

［KEY WORDS］IgA vasculitis; Mannosyltransferases; Polymorphism， single nucleotide; Genotype; Alleles; Gene frequency; Child

兒童過敏性紫癜（Henoch-Schnlein purpura，HSP），是一種由IgA為主的免疫復合物介導的小血管炎[1]，是兒童時期最常見的系統性血管炎。該病冬季多見，發病人數呈逐年上升趨勢[2]。目前認為HSP并非單純的過敏性疾病，可能與感染、遺傳、食物、藥物、腸道微生態失衡等多種因素有關[3]。

HSP患兒IgA1分子絞鏈區半乳糖基化不全是HSP及紫癜性腎炎（HSPN）的重要發病機制[4]。半乳糖基化不全的異常IgA1分子無法及時被清除，誘發自身免疫反應，導致循環免疫復合物的形成。循環免疫復合物會沉積于腎小球系膜組織上，從而引起HSP患兒腎臟損傷，繼而引起補體活化等一系列病理過程[5]。有研究表明，除半乳糖基化異常外，HSP患兒可能還存在其他類別的糖基化異常，比如甘露糖基化異常[6]。多萜醇磷酸甘露糖酶復合物（DPMS）是蛋白進行甘露糖基化修飾過程中必需的一種酶，且在蛋白的甘露糖基化修飾中起關鍵作用。DPMS由多個亞基組成，DPM1是其主要的催化亞基，由DPM1基因編碼[7]。推測DPM1基因的單核苷酸多態性（SNP）可能與HSP的發生相關。本研究擬對比HSP患兒與健康兒童DPM1基因rs73909842位點SNP的差異，以期從遺傳學角度探討DPM1基因與HSP以及HSPN之間可能的關系。

1對象與方法

1.1對象與分組

選取2021年4月—2022年3月于青島大學附屬醫院確診的HSP患兒156例為病例組。納入標準：符合歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）和歐洲兒科風濕病學會（PReS）共同制定的HSP診斷標準[8]。排除標準：①合并其他腎臟疾病者；②合并呼吸、消化、血液、神經系統疾病者；③合并有腫瘤者；④合并自身免疫性疾病者；⑤臨床資料不完整者。同時選取152例同期體檢健康兒童為對照組。納入標準：同一時間段內于青島大學附屬醫院體檢健康且年齡、性別與病例組相匹配的兒童。排除標準：①近期尿檢異常者；②合并感染者；③合并有其他系統疾病者；④肝、腎功能不全者；⑤臨床資料不完整者。病例組患兒男90例，女66例，年齡（8.10±3.30）歲，對照組兒童男86例，女66例，年齡（8.10±3.90）歲，兩組研究對象的性別、年齡相比較差異無顯著性（P＞0.05）。

病例組患兒確診后隨訪至少６個月，根據隨訪期間患兒的臨床表現分為如下亞組：根據是否出現腹痛分為有腹痛亞組62例，無腹痛亞組94例；根據有無關節疼痛分為有關節痛亞組74例，無關節痛亞組82例；根據是否合并HSPN分為HSPN亞組48例，非HSPN亞組108例。HSPN的診斷標準具體參考中華醫學會兒科學分會制定的HSPN診治循證指南[9]。

1.2DPM1基因SNP位點的確定

通過1000 Genomes數據庫（www.internationalgenome.org）、NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）篩選目標SNP位點，設置目標人群為中國北京漢族，最小等位基因頻率（MAF）≥0.05，最小連鎖不平衡相關程度（r2）≥0.8，由此方法篩選出rs2235739、rs2281282、rs7274624、rs73909842、rs2294902、rs7267115位點，隨后通過PLINK軟件對這6個位點進行質控，設定SNP缺失率≤5%，哈迪-溫伯格平衡定律檢測無顯著偏離（P＞0.05），因此最終確定用于后續檢測的DPM1基因SNP位點為rs73909842。

1.3DNA提取及基因型檢測

所有研究對象空腹采集靜脈血2 mL，嚴格按照Flexi-gene DNA Kit（Qiagen）試劑盒操作步驟提取靜脈血中DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術檢測DNA樣本中rs73909842位點的所有基因型和等位基因，通過建立共顯性、顯性、隱性三種遺傳學模型，比較rs73909842位點基因型頻率和等位基因頻率在各組間是否存在差異。

1.4統計學處理

使用SPSS 29.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例（率）表示，各組間基因頻率的比較采用χ2檢驗。SNP位點與各組之間的關聯強度通過比值比（OR）及95%CI評估。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1病例組與對照組rs73909842位點基因頻率的比較

通過比較病例組與對照組的基因型頻率發現，在顯性模型中，相較于對照組，病例組患兒的C/G與G/G基因型頻率之和明顯降低，而C/C基因型頻率明顯升高（χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292～5.208，P＜0.05）。比較兩組兒童等位基因頻率發現，病例組患兒等位基因C頻率明顯升高，等位基因G頻率明顯降低，差異具有顯著性（χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162～4.337，P＜0.05）。見表1。

2.2各亞組患兒rs73909842位點基因頻率比較

有腹痛亞組與無腹痛亞組，有關節痛亞組與無關節痛亞組，以及HSPN亞組與非HSPN亞組患兒rs73909842位點的基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表2。

3討論

HSP在兒童時期多見，每100 000例兒童中約有3～7例患病，好發年齡約為4～6歲[10]，男女比例約為1.51[11]。當HSP患者體內存在異常IgA分子時，可刺激機體產生抗IgA的抗體，形成免疫復合物介導靶器官損傷[4，12]。糖基化修飾是機體內蛋白質修飾的重要形式，機體內與生命活動相關的蛋白中有超過一半的蛋白質需要在翻譯后進行糖基化修飾[13]，免疫球蛋白分子也是如此。異常糖基化過程參與了多種病理過程，與多種腫瘤、傳染性疾病、遺傳性疾病以及自身免疫性疾病的發生密切相關[14-15]。目前已知HSP患者IgA1分子部分鉸鏈區域出現O-連接聚糖的異常糖基化，主要表現為半乳糖基化不全，是導致機體免疫紊亂并形成免疫復合物的基礎[16]。本團隊前期研究發現，除半乳糖（Gal）外，HSP患兒血清中甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）濃度亦顯著高于正常兒童[6]，提示除Gal外，Man、GlcN、GalN相關的異常糖基化可能也參與了HSP的發生發展。

機體蛋白質的甘露糖基化修飾是一個非常復雜的過程，其中DPMS起著最為關鍵的作用，也是這一過程的限速酶[17]。DPMS是產生甘露糖基供體的關鍵酶，用于糖基磷脂酰肌醇、N-聚糖以及蛋白O-和C-甘露糖基化。DPMS由三個亞基組成，包括DPM1、DPM2和DPM3。DPM1是DPMS的主要催化亞基，DPM2和DPM3是幫助DPM1穩定表達并使其發揮催化活性的調節亞基[18]。DPM1基因異常可能影響DPM1的正常表達，從而影響甘露糖基化的過程。

SNP是指DNA中單個核苷酸變異引起的序列改變，是人類群體表型變異的主要來源[19]。許多遺傳性疾病、癌癥和免疫系統疾病都與基因序列中的突變密切相關，因此SNP檢測在疾病診斷、治療等方面具有重要參考價值[20]。近些年來，與HSP發病相關的SNP位點陸續被發現。XU等[21]的研究發現IL-17A rs2275913的多態性與HSP易感性顯著相關；YU等[22]的研究發現MCP1/CCL2基因多態性與HSP易感性相關，RANTES/CCL5基因多態性可能與HSP嚴重程度和HSPN的發生有關。檢索NCBI數據庫發現，人類基因組中DPM1基因的多態性位點共有161個，但目前為止尚無DPM1基因多態性位點與疾病易感性相關的文獻報道，本研究通過檢索1000 Genomes數據庫（www.internationalgenome.org）、NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）篩選SNP位點，從而最終選定rs73909842作為本研究的目標SNP位點。采集所有研究對象的外周血樣本并提取DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術檢測病例組和對照組DPM1基因rs73909842位點所有基因型和等位基因，比較各組間基因型頻率和等位基因頻率是否存在統計學差異。結果顯示，與對照組相比，病例組患兒DPM1基因rs73909842位點的G/G與C/G基因型頻率之和明顯降低，C/C基因型頻率明顯升高，并且病例組患兒等位基因C頻率高于對照組、等位基因G頻率低于對照組，故推測DPM1基因rs73909842位點SNP與HSP的易感性有關，攜帶DPM1基因rs73909842位點等位基因C的兒童發生HSP的風險性升高，提示rs73909842位點等位基因C可能是HSP的危險因素之一，而等位基因G可能為保護性因素。比較有腹痛亞組與無腹痛亞組、有關節痛亞組與無關節痛亞組、HSPN亞組與非HSPN亞組患兒rs73909842位點的基因型頻率及等位基因頻率發現各組間無顯著差異，提示本研究尚未發現DPM1基因在SNP與HSP的臨床表現之間存在相關性。

rs73909842位于DPM1基因3′端側翼序列。側翼序列是指基因第一個和最后一個外顯子外側不被轉錄的非編碼區，分為5′端側翼序列和3′端側翼序列，其上有許多調控序列，包括啟動子、增強子、終止子、RNA裂解信號等，調控基因的表達[21]。有研究表明CTLA4基因近端3′側翼區域的等位基因變異與系統性紅斑狼瘡的發生密切相關[22]。本研究發現，與對照組相比較，病例組患兒的DPM1基因rs73909842位點的G/G與C/G基因型頻率之和明顯降低，C/C基因型頻率明顯升高，因此可以推測DPM1基因rs73909842位點多態性可能通過改變位于3′端側翼區的基因調控序列進而影響DPM1基因的表達，但還需要進行更加深入的研究，以闡明DPM1基因表達的分子基礎。

綜上所述，DPM1作為參與甘露糖基化反應的重要亞基，其基因多態性與兒童時期HSP的發生緊密相關。DPM1基因rs73909842位點等位基因C可能是兒童HSP易感的危險因素，而等位基因G則為保護性因素。該位點基因多態性可能通過改變3′端側翼區的基因調控序列，影響基因表達從而致患者甘露糖基化異常，形成異常糖基化的IgA1分子作為自身抗原與特異性抗體相結合，形成的免疫復合物無法被及時清除而致病。目前DPM1基因rs73909842位點的功能相關性模型尚未建立，仍需進一步研究。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL27001）。所有受試患兒家屬均簽署知情同意書。

作者聲明：所有作者均參與了研究設計；高鑫、林毅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻］

[1]黎書，王崢. 兒童過敏性紫癜診療指南解讀[J/OL]. 中華婦幼臨床醫學雜志（電子版）， 2014，10（6）：733-736.

[2]吳天慧，李志輝，段翠蓉，等. 3 482例小兒過敏性紫癜流行病學分析[J]. 實用預防醫學， 2014，21（8）：978-980.

[3]王志梅，王巖. 過敏性紫癜的病因分析[J]. 中國中西醫結合兒科學， 2019，11（1）：41-44.

[4]PILLEBOUT E， SUNDERKTTER C. IgA vasculitis[J]. Semin Immunopathol， 2021，43（5）：729-738.

[5]HEINEKE M H， BALLERING A V， JAMIN A， et al. New insights in the pathogenesis of immunoglobulin A vasculitis （Henoch-Schnlein purpura）[J]. Autoimmun Rev， 2017，16（12）：1246-1253.

[6]王志亮，盛楷迪，林毅，等. 過敏性紫癜患兒血清降解單糖水平的變化及意義[J]. 中國當代兒科雜志， 2022，24（8）：894-898.

[7]MAEDA Y， KINOSHITA T. Dolichol-phosphate mannose synthase： Structure， function and regulation[J]. Biochim Biophys Acta， 2008，1780（6）：861-868.

[8]OZEN S， RUPERTO N， DILLON M J， et al. EULAR/PReS endorsed consensus criteria for the classification of childhood vasculitides[J]. Ann Rheum Dis， 2006，65（7）：936-941.

[9]黃松明. 紫癜性腎炎診治循證指南（2016）[J]. 中華兒科雜志， 2017，55（9）：647-651.

[10]FELIX A， ASSAD Z， BIDET P， et al. Common seasonal pathogens and epidemiology of henoch-schnlein purpura among children[J]." JAMA Netw Open， 2024，7（4）：e245362.

[11]ONI L， SAMPATH S. Childhood IgA vasculitis （henoch schonlein purpura）-advances and knowledge gaps[J]. Front Pediatr， 2019，7：257.

[12]CHEN J Y， MAO J H. Henoch-Schnlein purpura nephritis in children： Incidence， pathogenesis and management[J]. World J Pediatr， 2015，11（1）：29-34.

[13]EICHLER J. Protein glycosylation[J]. Curr Biol， 2019，29（7）：R229-R231.

[14]MAGALHES A， DUARTE H O， REIS C A. The role of O-glycosylation in human disease[J]. Mol Aspects Med， 2021，79：100964.

[15]REILY C， STEWART T J， RENFROW M B， et al. Glycosylation in health and disease[J]." Nat Rev Nephrol， 2019，15（6）：346-366.

[16]NOVAK J， MOLDOVEANU Z， RENFROW M B， et al. IgA nephropathy and henoch-schoenlein purpura nephritis： Aberrant glycosylation of IgA1， formation of IgA1-containing immune complexes， and activation of mesangial cells[J]." Contrib Nephrol， 2007，157：134-138.

[17]MAEDA Y， KINOSHITA T. Dolichol-phosphate mannose synthase： Structure， function and regulation[J]." Biochim Biophys Acta， 2008，1780（6）：861-868.

[18]MAEDA Y， TANAKA S， HINO J， et al. Human dolichol-phosphate-mannose synthase consists of three subunits， DPM1， DPM2 and DPM3[J]. EMBO J， 2000，19（11）：2475-2482.

[19]NEININGER K， MARSCHALL T， HELMS V. SNP and indel frequencies at transcription start sites and at canonical and alternative translation initiation sites in the human genome[J]. PLoS One， 2019，14（4）：e0214816.

[20]龍波，陳仕國，馬顯光，等. 單核苷酸多態性檢測技術的研究[J]. 激光雜志， 2011，32（5）：48-49.

[21]XU H， PAN Y X， LI W， et al. Association between IL17A and IL17F polymorphisms and risk of Henoch-Schonlein purpura in Chinese children[J]. Rheumatol Int， 2016，36（6）：829-835.

[22]YU H H， LIU P H， YANG Y H， et al. Chemokine MCP1/CCL2 and RANTES/CCL5 gene polymorphisms influence Henoch-Schnlein purpura susceptibility and severity[J]. J Formos Med Assoc， 2015，114（4）：347-352.

[23]徐紀明，朱建樹，李夢真，等. 側翼序列獲取技術研究進展[J]. 遺傳， 2022，44（4）：313-321.

[24]CUNNINGHAME GRAHAM D S， WONG A K， MCHUGH N J， et al. Evidence for unique association signals in SLE at the CD28-CTLA4-ICOS locus in a family-based study[J]. Hum Mol Genet， 2006，15（21）：3195-3205.

（本文編輯耿波）