烏梅對柱狀黃桿菌抑菌效果研究

柱狀黃桿菌（Flavobacteriumcolumnare）廣泛分布于土壤和淡水環境中，是一種嚴格需氧的革蘭氏陰性菌，隸屬于擬桿菌門、黃桿菌綱、黃桿菌目、黃桿菌科，其形狀呈桿狀或球桿狀，以產生黃色色素為特征，具有滑動能力和團聚性，是一種常見魚類病原菌[1]。魚類在養殖過程中極易感染柱狀黃桿菌而暴發細菌性爛鰓病[2]。有報道指出，每年全球因感染柱狀黃桿菌而引起魚類死亡所造成的經濟損失數目巨大[3]，以前常使用化學藥品防治爛鰓病4，但其效果不明確且容易造成化學殘留，對水生生物以及人類健康有不好的影響；疫苗法則對操作手法要求較高，操作不當時特別容易造成魚類應激死亡[5]，且對人工需求量較高；抗生素因其在生物體內的殘留，被明令禁止添加在飼料中[6]

隨著限抗令的頒布和實施，急需尋找抗生素的替代品來提高養殖業的經濟效益，益生菌、酶制劑、中草藥等均可作為抗生素的替代品。中草藥具有毒副作用小、無殘留、對環境友好、成本低、無抗藥性的特點[7。用中草藥防治魚病，不但可以解決藥物殘留問題，而且還具有提高魚體免疫功能等作用，從而確保魚肉產品質量安全[8]

烏梅（Fructusmume）是我國傳統的藥食同源中藥，俗稱酸梅、黃仔等，為薔薇科梅的近成熟果實，主產于我國南方地區，包括四川、云南、貴州、安徽、福建等地，栽培資源豐富，呈橢圓形，表面烏黑色，氣微，味極酸，其主要化學成分有黃酮、有機酸、萜、多糖等[9]。烏梅具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生物學功能[10]。研究表明，烏梅能夠對嗜水氣單胞菌[11]、假單胞菌[12]等水生動物病原菌具有良好的抑菌效果，但在國內外有關烏梅抑制柱狀黃桿菌的研究還很少。因此，該試驗主要考察烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果，探討烏梅是否抑制柱狀黃桿菌，并初步探明其最低抑菌濃度，以期為烏梅用于防治柱狀黃桿菌引起的魚類細菌性爛鰓病提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料烏梅產自廣西，購自古慶堂旗艦店。柱狀黃桿菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為CGMCC1.1236820210106。主要儀器包括無菌操作臺（Telstar-BIOIIA）、漩渦振蕩儀（HX-C）、高溫高壓滅菌鍋（SANYO-PHCBI-MLS3750）、恒溫培養箱（上海一恒BPH-9042）低溫離心機（ 、鼓風干燥箱（101-OA）、可見光分光光度計（SELECTR-VR-2000）、顯微鏡（E100） pH測試筆（SJC-TDS-3）。

1.2 試驗方法

1.2.1R2A培養基的配制。參照中國普通微生物菌種保藏管理中心提供的R2A培養基配方配制液體培養基，稱取葡萄糖 0.50g 可溶淀粉 0.50g 示蛋白陳 0.50g 、酵母浸膏0.50g 、酸水解酪素 0.50g、丙酮酸鈉 ，溶解于 1000mL 蒸餾水中，調節pH至7.2后 滅菌 20min 。

1.2.2菌種的復活。先用 75% 乙醇脫脂棉對安瓿瓶外表面進行消毒，用火焰加熱安瓿瓶頂端，用少量無菌水滴加至剛受熱的安瓿瓶頂端使之破裂，用鑷子敲下破裂的安瓿瓶頂部，再吸取滅菌的R2A液體培養基 0.3mL ，注入安瓿瓶內，輕輕振蕩，并用移液槍反復吹打，使凍干菌體完全溶解。吸取全部菌懸液，移植于液體培養基試管中，在培養箱中 條件下培養 72h 。

1.2.3菌種的傳代培養。參照黃錦爐等[13]研究的Shieh配方，按照蛋白陳 、酵母浸膏 0.30蒸餾水 配制，溶解后用 調節 pH至7.2，分別按0.2ug/mL，20U/mL的濃度加人妥布霉素和多黏菌素，并在 下進行高溫滅菌 20min ，倒平板。在無菌操作條件下，將上述復活的菌液接種在平板上，進行傳代培養，用于平板抑菌試驗。

1.2.4烏梅的熬制。稱取 15g 煙熏烏梅肉（煙熏烏梅去核），加 400mL 蒸餾水熬制1h，蒸發濃縮至 150mL ，即濃度為 的烏梅水煎劑，移至錐形瓶，密封滅菌，冷卻后放置冰箱冷藏， 保存備用。

1.2.5液體培養基試管抑菌試驗

1.2.5.1未調節pH的液體培養基試管抑菌試驗。參照“1.2.1\"R2A培養基配方制作液體培養基。按照烏梅水煎劑與培養基 1：8＼ 、1：16＼ 、1：32＼ 、1：64＼ 、1：128＼ 、1：256的比例制作烏梅水煎劑液體培養基，分別加入 100uL相同濃度的柱狀黃桿菌菌液，在恒溫培養箱中 培養 后觀察。然后用各濃度比例烏梅水煎劑培養基作為對照組，借鑒麥氏比濁法在 測定各比例菌液的吸光度，以判定柱狀黃桿菌是否生長。

1.2.5.2未調節pH液體培養基的pH測定。使用pH測試筆對上述各濃度比例液體烏梅水煎劑培養基進行pH測定。分別配制pH為 4.00，6.86，9.18 的標準液，將pH測試筆分別伸入標準液中進行校準，伸入不同標準液前用蒸餾水清洗筆頭電極，并用擦鏡紙擦干。校準后，將pH測試筆伸人各液體培養基，輕輕晃動待數值穩定后進行讀數。

1.2.5.3調pH至7.2的液體培養基試管抑菌試驗。將 1：8 的液體藥物培養基的pH調節至7.2，然后用培養基等比稀釋至 1：16，1：32，1：64，1：128，1：256 ，再按照“1.2.5.1\"的操作步驟再次進行抑菌試驗，觀察結果。

1.2.6平板抑菌試驗。按\"1.2.1\"R2A配方制作培養基，分別按照 0.2，0.4，0.6mg/mL 加人烏梅水煎劑，調節pH至7.2，并按 1.5% 的比例加入瓊脂，121℃條件下滅菌 ，倒平板，制備出含有不同濃度的烏梅中藥平板。將平板上復活的菌落稀釋至 CFU/mL，分別取稀釋的菌液100uL接種涂布在各濃度的中藥平板上，在培養箱中 條件下培養 72h ，觀察拍照，并對菌落計算，計算抑菌率：

抑菌率 （對照組的菌落數-試驗組的菌落數）/對照組的菌落數 ？×100%

2 結果與分析

2.1柱狀黃桿菌復活液體培養基中觀察到培養基變渾濁，有連在一起的白色絮狀物。如圖1所示，固體培養基上的菌落形態為淡黃色點狀，菌落邊緣不整齊，呈假根狀向外延伸。如圖2所示，經過革蘭氏染色后觀察為紅色，確認是革蘭氏陰性菌，在液體培養基中為長桿狀，在固體培養基上稍短，與黃錦爐等[13的研究結果一致，均符合柱狀黃桿菌形態特征，可以用于后續抑菌試驗。

2.2 液體抑菌試驗

2.2.1烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果。由表1可知，在烏梅水煎劑添加比例為 1：128 時，吸光度為0，且肉眼觀察到試管完全透明，證明柱狀黃桿菌沒有生長；添加比例在 1：256 時吸光度較大，肉眼可以觀察試管明顯渾濁，證明柱狀黃桿菌生長良好。由此可知，未調節pH的液體藥物培養基的最低抑菌添加比例為1：128，即最低抑菌濃度為 0.775mg/mL 。

2.2.2烏梅對培養基pH的影響。由表2可知，原基礎培養基pH為7.2，烏梅水煎劑在添加比例為 1：8，1：16，1：32 1：64.1：128 時，液體培養基的H改變很大，pH分別為3.3、3.6、4.2、4.8、5.8；在添加比例為 1：256 時，對pH改變較小，pH為6.9。

2.2.3經調整pH后的烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果。由表3可知，經過調節pH的藥物培養基在添加比例為 1：64 即濃度為 1.54mg/mL 時，吸光度為0，試管透明，證明烏梅水煎劑在此濃度能夠完全抑菌；在添加比例為 1：128 ，即濃度為 0.775mg/mL 時，吸光度接近0，肉眼觀察試管也透明，證明柱狀黃桿菌幾乎沒有生長；在添加比例為 1：256 時，吸光度略小于對照組，但柱狀黃桿菌有明顯生長，證明此添加比例烏梅水煎劑的抑菌效果較差。

2.3平板抑菌試驗由表4可知，當烏梅水煎劑添加劑量至 0.6mg/mL 時，平板上沒有菌落生長，可以表明完全抑菌，即抑菌率達到 100% 。

2.4成本計算該試驗選用的烏梅的價格為37.8元/kg，經調查，市場上的烏梅價格平均在40.0元/kg左右。根據價格和試驗所得最小抑菌濃度，可以通過以下公式計算出最低抑菌成本：在調節pH的情況下最低抑菌成本 σ=σ 購買價格 抑菌濃度 =40.0 元 /kg×0.6mg/mL=0.024 元/L。

3討論

根據該試驗結果可知，烏梅對柱狀黃桿菌具有一定的抑菌作用。有機酸類、黃酮類、萜類、多糖類等化學成分為其主要的抑菌物質[9]?，F代藥理研究表明，烏梅具有調節免疫、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生物學功能[10]。張生元等[14]研究也表明，烏梅在（ 1625.5±563.1）mg/L 時能夠對鱖源柱狀黃桿菌起到抑菌效果。而該試驗結果表明烏梅在 時能夠完全抑菌，抑菌劑量的不同可能與烏梅的產地和炮制方法有關。陳蕾等[15]研究表明烏梅的產地不同，其有效成分含量存在一定差異，尤其是浙江及四川的烏梅枸橡酸和浸出物含量相對高。袁武會等[1研究指出烏梅炮制前后其有效成分含量有明顯的差別。另外烏梅炮制方法眾多，王璐等[17]研究表明不同炮制方法的烏梅對其藥理作用有一定的影響。盡管抑菌劑量有所差異，但是該研究和張生元等[14]的研究一致表明烏梅對柱狀黃桿菌有抑菌效果，而抑菌劑量不同的具體原因有待進一步研究。

根據黃錦爐等[13]的研究，當培養基中pH為5.5＼～6.2和8.6＼～9.2時，柱狀黃桿菌的生長嚴重受抑制； pH為6.2＼～7.4時逐漸增加培養基中的pH有利于柱狀黃桿菌的生長繁殖；而pH為8.0＼～8.6時柱狀黃桿菌的生長則因pH的升高而受抑制；最適合柱狀黃桿菌生長的pH為7.4。而烏梅有酸性，其對pH改變較大。根據羅新等[18的研究，烏梅是改變了培養基的pH從而使培養基的pH不在細菌的適宜范圍內，因此抑制了細菌的生長，與該試驗結果一致。在此次試驗內也可看出烏梅在高濃度時對pH的改變較大，因此在高濃度時烏梅的抑菌效果較好可能是其改變了pH和自身藥效的雙重效果；在低濃度時對pH改變較小，對抑菌效果的影響較小，主要是烏梅本身的藥效。

雖然目前關于烏梅對柱狀黃桿菌抑制效果的報道很少，但是烏梅抑制水生動物病原微生物的報道較多。侯天牧等[19]研究指出烏梅對于嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等氣單胞菌有很好的抑菌效果。鉏超等[20研究表明烏梅對于小瓜蟲也有滅殺效果。另外，根據該試驗的研究結果，大約需要 的烏梅能抑制柱狀黃桿菌，其抑菌成本為0.024元/L；據趙良煒等[2]的研究，氟苯尼考對柱狀黃桿菌的最低抑菌濃度為 1250mg/L ，按照水產專用氟苯尼考的市場價格計算，抑菌成本為0.2元/L，遠高于烏梅的抑菌成本。由此可見，烏梅在水生動物疾病防治方面有廣闊的應用前景。

另外，該研究還有一些不足之處。該試驗對烏梅采用人工去核，但實際應用時需要大量的烏梅，人工去核不便，沒有去核的烏梅在抑菌劑量上可能會有所改變。其次，該試驗僅采用體外抑菌，并沒有開展動物試驗，既沒有將烏梅添加到飼料中進行飼喂試驗，也沒有開展潑灑烏梅水煎劑用于防治爛鰓病的試驗，烏梅在實際生產中對柱狀黃桿菌引起的爛鰓病的防治效果還有待進一步研究，但是該研究為烏梅的實際應用奠定了理論基礎。

4結論

將烏梅熬制至 的濃度，分別以 1：8.1：16.1 ·32，1：64，1：128，1：256 的比例加入液體培養基，接種柱狀黃桿菌，培養 后觀察并測定吸光度，進而判定抑菌效果；測定上述不同添加比例烏梅液體培養基的pH，并開展調整pH至7.2后的抑菌試驗；分別以 0.2，0.4，0.6mg/mL 的濃度加入固體培養基中，開展平板抑菌試驗。結果表明： ① 烏梅對柱狀黃桿菌有較好的抑菌效果； ② 未調節pH的液體藥物培養基的最低抑菌添加比例為 1：128 ，即最低抑菌濃度為0.775mg/mL ③ 烏梅在添加比例高于 1：128 （即濃度為0.775mg/mL 時，對pH的影響較大，影響抑菌效果，在濃度較低時pH的改變對抑菌效果的影響較小； ④ 在烏梅濃度為0.6mg/mL 時，可以對柱狀黃桿菌完全抑菌。

參考文獻

[1]黃錦爐，汪開毓，黃藝丹，等.水生動物致病菌一柱狀黃桿菌研究進展[J].中國水產，2009（10）：59-61.

[2]王良發，謝海俠，張金，等.我國淡水魚類柱形病病原菌柱狀黃桿菌的遺傳多樣性[J].水生生物學報，2010，34（2）：367-377.

[3]CHOWDHURYMBR，WAKABAYASHIH.Survival of four majorbacteri-al fish pathogens in different types of experimental water[J].Bangladesh JMicrobiol，1990（7）：47-54.