青海地區藏茴香種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

ISSR Analysis of Genetic Diversity of Carum carvi L. Germplasm Resources in Qinghai Region

ZHENGMing-xian，YANGLi-na，HENNing-dongetal（ColegeofAgrcultureandAnimalHusbandryQinghai Universityining， Qinghai 810016）

AbstractObjective]Toexplorethegeneticdiversityandgeneticelationshipof15Carumcari germplasmsinQinghairegionandtopro vide theoretical support for the artificial cultivation of carvivarieties.[Method] DNA from 149 fresh leaves of C . carvi was extracted by modifiedCTABmethod，andthn10igeffciencISprimerswereusedfomleularlabeling.Result]Atotalof8412plymoicbnd were obtained，the total polymorphism ratio was 90.21% ，the average Nei’s gene diversity index （ ）was O.5O，the average Shannon’s information index （I） was O.75，and the genetic similarity coefficient among C . carvi germplasm was 0.84-0. 97. The genetic diversity index ）， intra-population genetic diversity index（ ），gene differentiation coefficient （ ）and gene flow （ ）were0.23，0.17，0.26 and1.42，respectively.Te5gerplasswerdvidedintothecategois.e49C.carindivualseredividdinto6ategories.Cocusione germplasm of wild .carvi in Qinghaiareahasrich geneticdiversityandthere isextensivegeneexchange between germplasms，ndthis gene exchangeshowsacertain gradual difusion lawinthesame direction intheregion，andtherichgenetic diversityof wild C . carvi in Qinghai area comes from the differences between individuals.

Key WordsCarum carvi L. ；Germplasm resource；ISSR molecular marker；Genetic diversity

藏茴香（CarumcarviL.），常生長于路旁、草原、山溝、河灘、山坡等處的二年或多年生草本植物，屬傘形科（Umbellif-erae）葛縷子屬（Carum），又名葛縷子，在青藏高原俗稱郭鳥、馬纓子[1]，種子呈長卵圓形，表面有縱棱，種皮深褐色[2]。藏茴香因其全草富含揮發性成分，氣味獨特，其種子提取精油具有多重作用，是傳統民俗佐料及藏藥資源之一，具有重要的藥用價值及民俗文化價值[3-7]。藏茴香在世界范圍內均有分布，在北歐、非洲、俄羅斯等地人工種植當地育成品種及品系[8-9]，在我國東北、華北、西北、四川、西藏等地的藏茴香種質基本處于未被開發的完全野生狀態[10]，藏茴香種質間親緣關系不明確，因此對藏茴香種質開展系統的鑒定和親緣關系分析十分必要，而傳統形態學等方面的親緣關系鑒定存在易受環境變化、地理因素限制等影響結果準確性。

隨著現代分子遺傳學及生物學的飛速發展，包括ISSR（inter simple sequence repeat） SSR（simple sequence repeat）、SNP（single nucleotide polymorphism）、RAPD （random ampli-fied polymorphic DNA）SRAP（sequence-related amplified pol-ymorphism）在內的DNA分子標記被大量開發，且廣泛應用于植物遺傳特性[1]、親緣關系分析[2]和遺傳多樣性研究[13]

ISSR標記技術無需事先獲得序列信息和引物設計，具有操作簡單、穩定性好、多態性高、廣泛試用等特點[14]，可以用于藏茴香種質親緣關系分析。

青藏高原地區具有豐富的藏茴香種質資源，這些種質間的親緣關系目前尚不清楚，國內對于青海地區藏茴香種質間親緣關系方面的研究鮮見報道，因此需要更準確和可靠的方法對其進行鑒定和親緣關系分析。該研究利用ISSR分子標記技術對15個不同生長地藏茴香種質的遺傳多樣性進行分析和評價，了解藏茴香種質的遺傳特點和親緣關系，以期為藏回香種質資源保護和有效開發提供理論支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料藏茴香種質材料為2018—2019年采自青海省（編號為Q1＼～Q13）、甘肅（編號為G1）、四川（編號S1）共15個不同居群（地區）的野生藏茴香種子，各種質來源地詳細信息見表1，藏茴香種質按居群劃分并編號。2020—2021年種植于青海省互助縣五十鄉巴洪村的試驗地（試驗地海拔 ，年降水量 550.7mm ，年均溫 ，無霜期 的積溫 的積溫 1452.4℃·d，土壤類型為黃黑土，土壤有機質含量2.52g/kg，pH7.9 ，耕作層 22cm ，全磷、全氮、全鉀含量分別為 1.91，1.88，25.42g/kg ；堿解氮、速效鉀和速效磷含量分別為118、168和 19.10mg/kg 。田間管理方法同當地常規，在藏茴香第一年營養生長期間，從15個藏茴香種質中分別隨機選取9＼～10個健康單株（共149個單株）的完全展開葉片，用 冰袋保存，帶回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1藏茴香總DNA提取與檢測。提取：藏茴香總DNA的提取采用周仙莉等[15提出的改良CTAB法。檢測：藏茴香DNA樣本的質量和濃度利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳及酶標儀（SpectraMax190）進行檢測；保存： 超低溫環境保存備用。

1.2.2PCR擴增。該研究從100個通用ISSR引物（UBC801＼～ UBC9OO，http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.PDF）中，篩選到10個擴增條帶清晰、多態性好的引物（表2）用于藏茴香種質的分析。參考田霞等[16]優化的藏茴香ISSR-PCR反應體系（25uL反應體系中，Taq酶 1.0U、0.6umol/L引物、Mg1.5mmol/LdNTPs0.2mmol/L，40ng 的DNA模板）進行PCR擴增。PCR反應程序：30次循環（ 5min 預變性， ；30s變性， S退火， 延伸， ）； 5min 延伸， 。PCR產物 保溫。PCR擴增產物在 1% 瓊脂糖凝膠板上進行電泳分析（ 電壓，電泳時間 50min，0.5×TAE 電泳緩沖液），凝膠成像系統檢測上記錄擴增產物的大小。

1.3數據分析對所得ISSR分子標記擴增帶譜，按照有無進行人工記錄，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”，在Excel中構建0、1數據矩陣。運行NTSYSpc2.10e進行遺傳相似度、遺傳距離計算和 UPGMA（unweighted pair-group method witharithmeticmeans）法構建聚類圖進行親緣關系分析和主成分分析；POPGENE32軟件計算Nei’s基因多樣性指數 、Shannon's信息指數 （I） ；MEGA64構建群體進化樹。

2 結果與分析

2.1藏茴香種質的遺傳多樣性分析該研究利用篩選的10個ISSR引物對15個藏茴香種質共149個個體（每個種質隨機選取10個個體，Q10號種質9個）中提取的DNA進行PCR擴增。以引物UBC854為例（圖1），擴增條帶清晰明亮，青海地區藏茴香的DNA片段主要集中在 250～2000bp 。

由表3可知，10個引物共檢測到9326個條帶，多態性條帶8413個，總多態性條帶比率為 90.21% ；平均多態性條帶為841個；多態性條帶比率為 72.41%～100.00% ，平均89.85% 。藏茴香種質Nei’s基因多樣性指數 ）平均為0.50，Shannon's信息指數 （I） 平均為 0.75 。可見，10個引物在供試的15個藏茴香種質中具有較好的多態性，不同藏茴香種質間在分子層面具有遺傳差異。

2.2藏茴香種質的親緣關系和遺傳分化分析藏茴香種質間的遺傳結構可知，15個藏茴香種質的總遺傳多樣性指數（ ？？？ ）、基因多樣性指數（ ）、基因分化系數（ ）和基因流（ ）分別為 0.23，0.17，0.26 和1.42。居群的遺傳多樣性有26.02% 存在于居群間，而 73.98% 存在于居群內部。基因分化系數（ 越低，基因流 ）反而越大，15個藏茴香居群間的平均基因流（ ）大于1，說明發生遺傳漂變的概率較小，藏茴香各種質間存在廣泛的基因交流。

注：M為DL2000Marker；49＼～50為Q5種質；51＼～60為G1種質；61＼～70為S1種質；71＼～72為Q6種質。

Note：Mis DL2000Marker；49-50wereQ5germplasm；51-60wereG1germplasm；61-70wereS1germplasm；71-72 wereQ6geplasm.

2.3藏茴香種質的遺傳距離和遺傳相似度從藏茴香15個種質的遺傳相似度和遺傳距離矩陣（表4）可以看出，15個藏茴香種質之間的遺傳相似系數為 0.84～0.97 ，平均為0.92；遺傳距離是 0.03～0.18 ，平均為 0.08 。其中遺傳相似度最大的是Q10號（烏蘭縣希里溝鎮郊區）和Q11號（都蘭縣夏日哈鎮）的種質樣本，相似系數為0.97，遺傳距離最小（0.03），說明Q10號和Q11號藏茴香種質間親緣關系最近，差異較小；而Q4號（同仁縣隆務鎮）和Q13號（囊謙縣香達鎮東郊）種質間的遺傳相似度最小，為0.84，遺傳距離最大（0.18），說明這2個藏茴香種質之間的親緣關系最遠，差異較大，從基因層面來說，二者的遺傳背景差異較大，遺傳距離較大。

2.4青海15個藏茴香種質間的聚類分析根據藏茴香居群遺傳聚類圖（圖2），在遺傳距離為0.04時，可以將15個藏茴香種質劃分為3大類。來自四川省阿壩縣（S1）和甘肅省甘南唐克（G1）居群被劃分為第I類；青海省同仁市隆務鎮（Q4）和青海省班瑪縣江日堂鄉（Q5）的2個居群被劃分為第I類；青海省其他11個居群（Q1、Q2、Q3、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10、Q11、Q12、Q13）劃分為第Ⅲ類。

2.5藏茴香149個個體間的聚類分析采用軟件NTSYSpc2.10e計算149個藏茴香個體的遺傳距離，并利用MEGA64構建樹狀聚類圖（圖3），149個藏茴香個體在遺傳距離為0.38時被劃分為6個類群。第I類是最大的類群，含109個藏茴香個體，占全部供試材料的 73.15% ，地理來源較為廣泛；第Ⅱ類為Q5號種質（班瑪縣江日堂鄉）的2個個體，占比1.34% ；第Ⅲ類含18個個體，占比 12.08% ，其中Q1號（祁連縣八寶鎮）5個、Q2號（門源縣青石嘴鎮馬場鄉）4個、Q3號（互助卓扎溝）1個、Q6號（達日縣窩賽鄉）4個、Q9號（共和縣青海湖）4個；第V類含2個個體，來自Q1號種質（祁連縣八寶鎮）；第V類有16個個體，Q12號（稱多縣稱文鎮西郊）6個、Q13號（囊謙縣香達鎮東郊）10個；第V類有2個個體，來自Q11號種質（都蘭縣夏日哈鎮），這一類群與其他遺傳距離最遠。

藏茴香個體聚類分析結果表明，來源地相同的藏茴香資源并不完全聚類于同一類群，青海同一藏茴香種質中的個體會分布于不同的類群中，而來自甘肅和四川的個體在分子層面親緣關系更近，都屬于第I類群。

2.6藏茴香個體的PCA分析為了更好地分析藏茴香種質資源間的遺傳關系，采用NTSYSpc2.10e軟件以第1主成分（方差貢獻率為 36.25% ）和第2主成分（方差貢獻率為12.65% ）作為二維坐標系構建二維散點圖（圖4），對供試藏茴香的全部個體間親緣關系進行比較。散點圖呈現出居群內部的遺傳差異大于居群間的差異（圖4），所得結果與上述群體基因分化系數、基因流結果一致，Q3、Q4、G1居群種質高度集中，表明其遺傳背景相似，親緣關系很近，Q1、Q9、Q10、Q11、Q12、Q13居群中個體間的遺傳差異較大，這與個體聚類分析的結果一致。

主成分分析能夠直觀反映出供試材料個體間的親緣關系，根據二維散點圖（圖4）可以看出149個藏茴香個體在各個象限均有分布，并且藏茴香各個種質的個體重合度較高，個體較為分散，表明供試藏茴香個體間的遺傳多樣性較為豐富，擁有廣闊的遺傳背景，其中距離越近的藏茴香個體間的遺傳背景相似，親緣關系較近。

3討論

近年來，隨著藏茴香提取物藥理作用、精油成分鑒定及生物學效應研究的深入，藏茴香種質的開發和利用價值越發受到重視。我國藏茴香資源豐富，基本處于野生未開發狀態，系統的遺傳學相關研究起步晚，基礎信息少；不同地區藏茴香種質存在形態差異不明顯、親緣關系不清問題，不利于藏茴香種質保護、開發和利用。豐富的遺傳多樣性是物種生存、適應和發展的前提[17]。ISSR分子標記具有多態性豐富、靈敏度高和穩定性高的優勢，在各種植物遺傳多樣性研究的領域中被廣泛應用[18]，該研究對收集到的15個不同來源地的藏茴香種質開展基于ISSR分子標記的遺傳多樣性及親緣關系研究，為藏茴香種質保護和開發利用提供基礎信息。

3.1藏茴香種質遺傳多樣性 Nei's基因多樣性指數

（204 ）[19]和Shannon's信息指數 可以表示物種的遺傳多樣性。該研究中10個ISSR引物擴增的多態性比率高達89.85% ，Nei’s基因多樣性指數 和Shannon's信息指數（I） 平均值分別為0.50和0.75；李昂[21利用SSR標記技術研究藏茴香種質的遺傳多樣性，并測得Shannon’s信息指數（I） 為0.26；Shannon's信息指數 （I） 可以與同類研究進行比較[20]，因此可以表明ISSR分子標記對藏茴香種質資源具有更好的鑒別能力，分析得到的遺傳多樣性更豐富。藏茴香種質的較高遺傳多樣性為未來的藏茴香種質鑒定、篩選培育提供了理論依據。

3.2藏茴香種質親緣關系與遺傳分化分析藏茴香15個藏茴香種質的親緣關系發現，藏茴香種質的遺傳相似度為0.84＼～0.97，而遺傳距離為 0.03～0.18，15 個藏茴香居群的平均相似度為0.92，其中遺傳相似度最大的是Q10號（烏蘭縣希里溝鎮郊區）和Q11號（都蘭縣夏日哈鎮），說明Q10號和Q11號種質親緣關系最近；而Q4號（同仁縣隆務鎮）和Q13號（囊謙縣香達鎮東郊）種質的遺傳相似度最小，說明這2個藏茴香種質之間的親緣關系最遠，差異較大。

基因流（ ）表示植物居群分化的重要指標，表示基因在居群間的交流程度， Ngt;1 時，基因在居群間有較大的流動性，有效防止居群分化[22]。該研究中 平均為1.42，說明15個藏茴香種質存在較強的基因交流。遺傳分化系數（204號 ）能衡量植物群體間的分化程度，為遺傳分化的研究提供有力的解釋和說明[23]。其取值為0＼～1，大致分為4個級別0lt;Glt;0.05、0.05G0.15lt;0.15G0.25和 0.25lt;Gst1.00，依次表達群體間遺傳分化水平較低、中度、較高、極高。該研究中 值平均為0.26，表示15個藏茴香種質存在極高的遺傳變異，這種變異來自居群間和居群內部，居群間的遺傳變異占 26.02% ，居群內部的變異占比 73.98% ，說明藏茴香的遺傳分化主要來源于居群內部的變異，這表明生活在相同地區和環境下的居群間基因交流十分普遍。而個體間強烈的變異導致青海地區藏茴香基因多樣性非常豐富，這也為藏茴香的人工育種提供了豐富的變異來源。同時種質間的基因交流也解釋了個體聚類分析和主成分分析時，同一種質的個體分布范圍很大，居群間重合度較高的現象。

3.3藏茴香種質間和個體間聚類分析種質間聚類分析將15個藏茴香種質分成3個類群，表現出地理位置相近的種質聚為同一類，如S1（四川阿壩）種質和G1（甘肅甘南）被劃分為第1類群，這2個種質分布的地理位置相鄰，遺傳距離相近，明顯有別于青海境內的其他種質；Q4和Q5為第I類群，分布于青海省東北部地區呈向北走向的地區； Q1～ Q3 種質、Q6＼～Q13種質為第Ⅲ類群，包括分布在青海東北部大部分地區的種質，該類群可分為2個亞群，第1亞群在青海省內呈西南向分布，第2亞群在青海省東北部地區呈東北向分布，很可能由于人為或自然因素進行種質遷移。

藏茴香個體間聚類將149個個體劃分為6個類群。而來源地相同的藏茴香個體并不完全聚類于同一類群，青海省內的藏茴香個體會分布于不同的類群中，而來自甘肅和四川的個體在分子層面親緣關系更近，都屬于第I類群。從個體層面分類，藏茴香的分布呈現出雜亂無序的現象，即遺傳分類并沒有明顯的地域差異性。這進一步說明藏茴香豐富的遺傳多樣性來自種群內部藏茴香個體間的差異。

3.4藏茴香個體間主成分分析主成分分析能夠直觀反映出供試材料間的親緣關系[24]，為了更好地驗證藏茴香種質資源間的親緣關系，構建二維主成分分析圖比較分析親緣關系，發現149個藏茴香個體的分布非常廣泛，個體間的遺傳差異大于居群間的遺傳差異，這一結果與個體聚類分析結果一致。因此在分子層面來源地的差異不能決定藏茴香的親緣關系，同一居群的個體與個體間的差異也有可能很大。造成這種現象的原因有很多，首先野生藏茴香遺傳信息復雜，單一的分子標記不能全面反映品種的遺傳信息；其次，生活在同一地理環境下的同一物種間更容易發生基因交流，導致即使生活的區域不同但在基因層面上并未表現出強烈的地域性；最后由于地域、空間和經費等諸多條件限制，能利用的野生藏茴香居群類型較少，尤其缺少青藏地區以外的野生藏茴香種質，因此可能沒有全面、準確地反映出藏茴香這一物種的遺傳特性。

4結論

青海地區野生藏茴香在分子層面的親緣關系并沒有明顯的地域差異性，所得結果與歐洲學者Laribi等[25]利用RAPD分子標記技術對5個居群的藏茴香進行聚類，類群間具有極強地域差異性的研究結果不相符合，可能原因是該研究中所用的藏茴香種質均采集自青藏高原地區，地理環境獨特，野生藏茴香種子在地區內進行普遍遷移，種質間存在廣泛的基因交流。從種質范圍來看，青海地區藏茴香種質的遷移具有一定的方向性，或呈東北，或呈西南，因此青海地區野生藏茴香可能是通過各種自然因素進行擴散繁衍，而種質間的遺傳差異性更多是種群內部個體基因突變、基因交流和自然環境影響共同作用的結果。該研究通過ISSR分子標記技術揭示了青海地區藏茴香種質的高遺傳多樣性和獨特的親緣關系，對于該地區藏茴香資源的科學開發利用具有借鑒意義，同時為其他地區野生藏茴香的種質鑒別、遺傳特性研究、資源保護等工作提供了科學依據。

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