2種方法測定抑菌劑對桑黃綠木霉的抑菌效果

Two Methods for Determining the Antibacterial Efect of Antibacterial Agents onPhellinus Trichoderma virens HUOXiu-juan，Mhuagui（1.Microbiologyesearchnstute，GuangiAcademyofAgriculturalSiences，Naninguangi ；2. Beijing Jingcheng Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 102600）

AbstractTrichodeastrainswereisolatedfromfungalpackagescontaminatedithTrichodermaspp.andgreenmoldspecimensofartifal lycultivatedpeliusfrutigoiesetsofnnfugiidesoTichodeairensu-3rdtedbbiiooe methodandgrowthatemethodTesultsshowdthatall5raisoficodeaisolatedwredentifedasrcoderiedoo toxicityestresultssowedtatprochloraz，gaoxiaolueijngtrchoderacid，carbendazimandhiopanate-methladstrongacteral efectonrichodermrensMu-3strain，andouldbeusedalteatelyorixedinchemicalcontrol.Relativelyspeakingtheiibitionzoe methodwasmoesuitablefoualitiest；tegowthatemetodouldauatelyfltteviuleeoftdrugtoteacteriah was not only suitable for qualitative test，but also suitable for quantitative test.

KeyWordsPhelinus；Trichoderma virens；Inhibitionzonemethod；Growthratemethod；Antibacterialefect；Toxicitytest

木霉（TrichodermaPers.）菌絲生長速度快，具有很強的寄生性，是香菇、平菇、金針菇、木耳、金耳、蛹蟲草、灰樹花、杏鮑菇和雙孢蘑菇等食用菌的致病菌和主要競爭性雜菌[1-8]。不同地方的木霉種類不一樣，其中綠色木霉（Tri-choderma viride）和哈茨木霉（T.harzianum）是優勢菌[9-10]在食用菌栽培過程中，木霉污染會發生在任何時期，典型表現為產生綠色、黃綠色霉層，污染菌包或培養料，侵染食用菌的菌絲體和子實體，引發病害，并造成減產，影響產品的產量和品質。防治木霉最常用的方法就是用殺菌劑進行環境消毒，降低菌原基數，減少因雜菌帶來污染或者侵染。殺菌劑毒力是評價其活性的重要參數，室內離體毒力測定方法因其快捷、靈敏和易操作，受到廣泛應用。傳統的殺菌劑室內毒力測定方法有抑菌圈法、孢子萌發法和生長速率法等[1]，生長速率法是將藥劑與培養基混合，以培養基上菌落的生長速度來衡量藥劑毒力大小。抑菌圈法又叫擴散法，是利用藥物在瓊脂平板中擴散使其周圍的細菌生長受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根據抑菌圈大小判定待測藥物抑菌效價的一種方法。

該研究從被致病木霉侵染的桑黃菌包和桑黃子實體上分離得到5個木霉菌株，并優選了施?？?、高效綠霉凈和多菌靈等9種高效、低毒低殘留的抑菌劑，分別用抑菌圈法和生長速率法測定這些抑菌劑對綠木霉 菌株的抑菌效果，對2種方法獲得的結果進行比較和評價，為殺菌劑室內生物測定提供參考，也為木霉等食用菌栽培中污染菌的科學防治提供依據。

1材料與方法

1.1桑黃寄生木霉菌株的分離純化和鑒定分別從南寧、龍州等試驗基地的試驗大棚選取被木霉污染的菌包和被木霉侵染的楊樹桑黃子實體病樣標本，在無菌工作臺上削去表面組織，用尖頭鑷子挑取病部桑黃組織，接種到PDA平板培養基上，置于（ 恒溫培養箱中進行黑暗培養 3～4d 等菌落中出現綠色孢子時，用鑷子挑取少量菌絲，在顯微鏡下觀察，根據分生孢子梗形態和分生孢子的形態大小鑒定木霉種類[12]，同時選取典型菌落進行轉管純化培養， 冰箱中保存備用。

1.2供試藥劑及其生產廠家多菌靈 50% 可濕性粉劑，江蘇藍豐生物化工有限公司；甲基硫菌靈 70% 可濕性粉劑，美國默賽技術公司：惡霉靈 30% 水劑，東莞市瑞德生物科技有限公司；中生菌素 3% 可濕性粉劑，東莞市瑞德生物科技有限公司；過氧化氫 3% 水劑，廣東南國藥業有限公司；綠霉霸50% 可濕性粉劑，永濟市君宏應用化工廠；高效綠霉凈可濕性粉劑，福建南平市農康生物技術有限公司；施?？?45% 水乳劑，蘇州富美實植物保護劑有限公司；勢克 25% 乳油，先正達投資有限公司。

1.3 生長速率法

1.3.1綠木霉菌株的活化。選取綠木霉 菌株作為試驗菌株，將其接種到PDA平板培養基中，置于 恒溫箱中黑暗培養3d，用直徑 5mm 打孔器打出菌餅，備用。

1.3.2抑菌試驗。采用無菌移液槍分別移取 1mL 已配制好各個濃度的9種測試藥劑，注人至 99mL 已滅菌冷卻至 的PDA培養基中，混勻，再將之均分到6個直徑為9cm 的培養皿中，制備含藥平板，以加 1mL 無菌水的PDA培養基為對照。待培養基凝固后，將木霉菌株接種至PDA含藥平板培養基中央，每個處理設3個重復。接種后，將其置于 的恒溫培養箱中黑暗培養，觀察2株木霉在不同濃度含藥平板上的生長情況。待對照長滿平板時停止培養。采用“十\"字測量法測量木霉菌落的直徑。

1.3.3數據處理與分析。計算菌落的平均直徑，并分別算出9種藥劑在系列濃度下的抑菌率。公式如下：

抑菌率 對照菌落直徑-處理菌落直徑 C ×100% 對照菌落直徑

1.4抑菌圈法

1.4.1供試木霉分生孢子懸浮液的制備。分別將木霉菌 接種到PDA平板，置于（ 恒溫箱中黑暗培養5d，觀察到菌落上產生大量綠色孢子后，在無菌條件下，用滅菌生理鹽水（ 0.9% NaCl）稀釋木霉分生孢子，混勻孢子懸浮液。通過血球計數板將木霉分生孢子懸浮液的濃度調整 個孢子/mL，備用。

1.4.2采用抑菌圈法（紙片擴散法）測定不同濃度抑菌劑的抑菌圈直徑。制備PDA平板培養基，用無菌的移液器吸取0.5mL 供試菌的孢子懸液，滴到PDA平板培養基上，用無菌涂布器輕輕將菌液均勻涂布于培養基表面。用滅菌濾紙片（圓形，直徑 50mm ）蘸取不同濃度的抑制劑，放置于平板培養基中央，每處理重復3次，以蘸取無菌水的濾紙片作為對照。然后將平板倒置于恒溫培養箱中， 恒溫箱中黑暗培養7d，采用“十\"字測量法測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1桑黃致病木霉的鑒定通過組織分離純化，從污染菌包和染病的桑黃子實體上共獲得5個致病木霉菌株，將分離純化的木霉菌株接種到PDA培養基上，等菌落表面形成大量綠色孢子時，挑取少量菌絲，在顯微鏡下觀察，根據分生孢子和分生孢子梗的形態特征，將上述5個菌株初步鑒定為綠木霉（Trichodermavirens）。

2.2利用抑菌圈法測試9種藥劑的不同濃度藥液對綠木霉的抑制效果由表1可知，在抑菌圈法試驗中，除過氧化氫外，其余8種殺菌劑對綠木霉 菌株均有不同程度的抑制作用，且隨著殺菌劑藥液濃度增加，抑制作用增強。其中，多菌靈200mg/L甲基硫菌靈200mg/L，$ 高效綠霉凈1mg/L 施保克 1mg/L 勢克 、惡霉靈 、中生菌素 綠霉霸 1000mg/L 及其更高濃度處理對綠木霉 均有明顯的抑制作用；然而，多菌靈 20mg/L 、甲基硫菌靈 20mg/L 、惡霉靈400和40mg/L、中生菌素 綠霉霸 勢克 0.1mg/L 和過氧化氫所有的濃度處理均未見明顯的抑菌圈，也未見明顯的抑制作用。此外，綠霉霸各濃度處理對綠木霉 Mu-3 雖然也有抑菌圈，但是抑菌圈不夠清晰，抑菌圈內部肉眼可見有菌絲生長，只是氣生菌絲很稀薄。

從抑菌濃度和相應的抑菌圈直徑2個方面進行綜合評估，9種供試藥劑對綠木霉 的抑制效果從大到小依次為施?？?gt; 高效綠霉凈 gt; 多菌靈 gt; 甲基硫菌靈 gt; 勢克 gt; 中生菌素 gt; 綠霉霸 惡霉靈 gt; 過氧化氫。

2.3利用生長速率法測試9種藥劑的不同濃度藥液對綠木霉的抑制效果由表2可知，在生長速率法試驗中，供試9種藥劑不同濃度藥液對綠木霉 Mu-3 菌株也有不同程度的抑制效果。同一種藥劑的抑制效果隨著藥液濃度升高，抑制作用增強。當藥劑濃度均為 20mg/L ，多菌靈、高效綠霉凈、施保克和勢克這4種藥劑處理的抑制率已為 100% ，接種菌塊無菌絲生長，甲基硫菌靈處理的抑制率為 84.47% ，中生菌素處理的抑制率僅為 64.75% ；當藥劑濃度為 時，過氧化氫和綠霉霸處理的抑制率均為 1.64% ，說明這2種藥劑的抑制效果偏低，近乎無效。

多菌靈 16mg/L 處理的抑制率為 86.78% ，甲基硫菌靈 處理的抑菌率為 78.10% ，說明多菌靈的抑菌效果比后者略高；高效綠霉凈 2mg/L 處理和勢克 2mg/L 處理的抑菌率分別為 84.84% 和 74.80% ，略低于多菌靈 處理的抑菌率，但前者的濃度僅為多菌靈的 1/8 ，當勢克和高效綠霉凈的濃度上升至 時，抑菌效果已達 100% ，說明高效綠霉凈和勢克的抑菌效果高于多菌靈；施?？?0.20mg/L 處理的抑菌率為 87.70% ，略高于多菌靈 16mg/L 處理的抑菌率（ 86.78% ），但多菌靈的濃度是施?？说?0倍，說明施?？藢G木霉 的抑菌效果很強，遠高于多菌靈。根據供試9種藥劑濃度和相應的抑菌率，抑菌效果從大到小依次為施保克 gt; 高效綠霉凈 gt; 勢克 gt; 多菌靈 gt; 甲基硫菌靈 gt; 中生菌素 gt; 惡霉靈 gt; 綠霉霸 gt; 過氧化氫。

2.42種室內生物測定方法的比較從表1和表2可以看出，抑菌圈法和生長速率法得到的結果相似，其中施?？恕⒏咝ЬG霉凈、勢克、多菌靈和甲基硫菌靈的抑菌效果較強，中生菌素、綠霉霸和惡霉靈的抑菌效果次之，過氧化氫的抑菌效果最差。

值得注意的是，在抑菌圈法中，多菌靈 20mg/L 、甲基硫菌靈 和中生菌素 處理均未觀察到抑菌現象，然而在生長速率法中，卻表現出比較好的抑菌效果，抑菌率分別為 100.00%.84.47% 和 72.20% ；在抑菌圈法中，惡霉靈 處理未觀察到明顯的抑菌現象，但生長速率法中，惡霉靈 處理的抑菌率已達 59.84% ，在抑菌圈法中，所有的過氧化氫處理（ 600～50000mg/L ）均未表現抑菌現象，而在生長速度法中，過氧化氫 500mg/L 處理的抑菌率為 37.70% 。造成上述現象的原因可能是由于濾紙片放置到培養基平板上后，紙片中所含的藥液被培養基的水分稀釋，并不斷向紙片周圍區域擴散，形成遞減的梯度濃度，該梯度濃度不僅與培養基的厚度有關，還與藥劑的擴散情況相關，從而影響到毒力測定的結果，且在浸泡藥液時很難控制藥劑在濾紙片上的吸附量，吸附量的差別導致重復性較差，因此抑菌圈法比較適合于定性試驗。相對而言，生長速率法能準確反映藥劑對病菌毒力的大小，不僅適合定性試驗，也適用于定量試驗。

在生長速率法中，高效綠霉凈 0. 01？0. 10？0. 50？1. 00 1.50.2.00mg/L 處理的抑制率分別為 71.31%.77.05%.80.33% 和 84.84% ，當高效綠霉凈濃度為10.00和 時，抑制率均為 100.00% 。由此可見，在一定的濃度條件下，藥劑抑制效果隨著濃度升高而增強，當藥劑濃度高于抑制率為 100% 的作用濃度時，用生長速率法已無法區分不同濃度處理在抑菌效果方面的差異。而在抑菌圈法中，隨著藥劑濃度的不斷升高，抑菌圈直徑相應變大，能簡單直觀地體現不同高濃度藥液處理在抑菌能力方面的差異。例如，高效綠霉凈 和 處理的抑菌圈直徑分別為0.97、1.80、2.27、2.30、2.63、2.83和 3.57cm 。

3結論與討論

該研究從污染菌包和桑黃子實體綠霉病標本上分離獲得綠木霉 菌株，分別用抑菌圈法和生長速度法測定了9種藥劑對綠木霉 菌株的抑菌效果，結果表明，抑菌效果較強的藥劑有施?？恕⒏咝ЬG霉凈、勢克、多菌靈、甲基硫菌靈。2種室內毒力測定的結果大致相同，略有差異。相對而言，生長速率法能準確反映藥劑對菌體毒力的大小，不僅適合定性試驗，也適用于定量試驗；抑菌圈法則比較適合于定性試驗。

多菌靈和甲基硫菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，自身含有或者通過生物轉化形成苯并咪唑基團，通過抑制病原菌細胞β-微管蛋白合成，阻止菌體的有絲分裂中紡錘體的形成，使病菌孢子萌發長出的芽管扭曲異常、芽管細胞壁扭曲等，從而使病菌不能正常生長達到殺菌效果[13-14]。施保克和勢克屬于麥角甾醇生物合成抑制劑，通過抑制細胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌細胞的生長[15]。高效綠霉凈的有效成分是異丁基苯甲基氨基甲酸酯，通過干擾菌絲的有絲分裂，達到抑菌的目的。上述5種抑菌劑為食用菌上常用的藥劑，殺菌譜廣，高效低毒。

在該研究中，惡霉靈的抑菌效果不佳，其主要原因可能與該藥劑的作用機理有關，惡霉靈是新一代內吸性殺菌劑和植物生長調節劑，作用機理獨特，施藥后被土壤中微量金屬元素活化后才能發揮其毒效[1]。此外，還可以在植株體內代謝形成糖苷，能提高作物的生理活性，促進生長[17] 。

過氧化氫的殺菌原理是利用強氧化性破壞菌體的蛋白質，但是過氧化氫在開放的常溫環境下容易分解為 和 ，安全性很高，無毒無殘留，殺菌持續時間相對不長。過氧化氫在pH小于3.5、溫度低于 條件下，性質最穩定[18]朱曉玲等[測定了過氧化氫等3種藥劑對香菇栽培中常見霉菌的抑菌效果，發現過氧化氫的抑菌效果較強。在該研究中，添加過氧化氫時，PDA培養基的溫度是 ，pH約為6，過氧化氫分解導致藥液作用濃度降低，這可能是該研究中過氧化氫抑菌效果較差的原因之一。

中生菌素是一種新型農用抗生素，其有效成分主要是N-糖苷類堿性水溶性物質，是一種殺菌譜較廣的保護性殺菌劑，通過抑制菌體蛋白質的生物合成，達到殺菌的效果，此外，該產品還具有一定的增產作用。

殺菌劑離體生物測定中反映的僅僅是藥劑與綠木霉生化靶標相互作用的結果，體現的是藥劑對病菌直接毒力的大小。然而生產上每一種殺菌劑的藥效都是藥劑、環境和病菌等多因素相互作用的結果，由于田間環境的復雜性，在某些時候，離體毒力測定結果與田間防治效果之間存在差別，有些殺菌劑應用離體測定有效，活體測定無效，而有一些殺菌劑在離體測定時不表現毒力，但活體測定時藥效很高[20]因此，室內毒力測定結果可以作為藥劑防治雜菌的參考，但在試驗使用時仍需要進一步的田間防效試驗。此外，在進行田間施藥時，還需要合理選擇不同作用機理的殺菌劑，輪換或者混配使用，以減輕或者避免病原菌產生抗藥性群體。

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