利水保肝巴布劑對肝腹水的藥效評價

Pharmacodynamic Evaluation of Lishui Baogan Cataplasm on Hepatic Ascites

DINGYanxia，WANGJial，SIYuhuan1，DUYaqingl，YUCongrui1，LIUChenl，WEIQiannan2 （1.School ofPharmacy，Henan University，Kaifeng475ooo，Henan，China；

2.MedicalResearch Center，theFirstAfiliatedHospitalofHenan University，Kaifeng 475ooo，Henan，China

Abstract：ObjectiveTinvestigatethfectofLsuBaoganctaplasmforthetreatmentofhepaticscitesMetodseouseodelfpatic asciteswasestablisdyH22mocelOedfterodelingtelankgroupndtheodelgrouperegivenblankmatrixaste，tositie drug group was given furosemide suspension ，and the low，mediumand high dose groups of cataplasm were given crude drug doses of 0.15 0 ， ，respectively，theadministrationareawas ，oncea day for1Odays.Thebodyweightof micewas weighed，theoalfesdtrfatndtiedife wereecodedo）tesd weredetectedyELISandtepathologicalchangesoflivertisueinmicewereobseredbHEsainingResultseiceinteblackgroup wereingodhealthithnoralweightandbdominalireumferenceandnosignsofdeathComparedwitheblackgrouptheweightand abdominal circumferenceof mice in thelow，mediumand high dose groups of cataplasm significantly increased .Compared with the blank group，the mortality rate of the model group was significantly increased，reaching 5 4 . 5 4 % .Compared with the blank group，the averageurine volume of mice in the model group decreased（ .Compared with the model group，the urine volume of the positive drug groupand the low，medium and highdosegousofaeddiofiddeoua to varying degrees，among which the ascites of the medium dose group decreased significantly（ .The serum ASTand ALT levels of mice in each dose group of cataplasm were reduced，while the TP level was increased .HE staining sections of liver tissue showed that compared with theodelgropivejuyiachoseoupofataplasmasllviatedtoringdgesConclusionLisuaogncaaplasmsiou effect on ascites and liver protection.

Keywords：Cataplasm；Hepaticascites；Pharmacodynamic evaluation

肝腹水是病理狀態(tài)下導致腹腔內(nèi)游離液體總量超過 2 0 0 m l 時的臨床癥狀。據(jù)報道2-4，肝腹水疾病的復發(fā)率和死亡率極高，約 1 5 % 的肝腹水患者在1年內(nèi)死亡， 4 4 % ～ 8 5 % 的肝腹水患者在5年內(nèi)死亡。因此，肝腹水的治療一直是臨床上關(guān)注的熱點和難點問題。目前，西醫(yī)治療主要以利水、緩解癥狀為主，臨床上多采用利尿劑，放腹水、加輸白蛋白等治療方式，雖各具優(yōu)點，但易造成感染，增加患者的痛苦，不利于病情的控制[5-7。中醫(yī)治療多采用中藥口服、中藥敷貼療法等，費用低，副作用小，增加患者的順應性，療效顯著[8-10]。利水保肝方是由《金匱要略》中的鱉甲丸和五苓散加減化裁而來，該方由鱉甲（醋炙）三七、豬苓、茯苓、附子（黑順片）白術(shù)、生姜、高良姜等8味中藥組成。在大學第一附屬醫(yī)院臨床治療肝腹水多年，對病毒性和酒精性肝硬化腹水具有顯著療效。原劑型臨床使用方法是將藥材粉碎成粗粉后加姜汁調(diào)為糊狀敷于臍部，存在療效不穩(wěn)、保質(zhì)期短、易過敏等問題。為了改善這些問題，課題組前期將此方制備成巴布劑。本研究采用H22肝癌細胞建立小鼠肝腹水模型，評價利水保肝巴布劑的利水和保肝功效，為后期臨床應用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物SPF級，KM小鼠66只，雌雄各半，體質(zhì)量 ，購于斯克貝斯生物科技有限公司[動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2020-0005]，飼養(yǎng)于大學SPF級動物房，環(huán)境溫度（ （ 2 4 ± 1 ） % ，濕度（ 5 5±5 ） % 。動物倫理批準號：2022-03-018。

1.2細胞小鼠肝癌細胞H22（CL-0341，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.3試劑利水保肝巴布劑（自制），呋塞米（ 2 0 m g / 片，上海朝暉藥業(yè)有限公司）；ELISA試劑盒TP、ALT、ALB和AST（生產(chǎn)批號： ； A 0 4 5 - l - l ， C 0 0 9 - 2 - l ， A 0 2 8 - 2-1和C010-2-1，南京建成生物工程研究所）。

1.4儀器萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；電子天平（慈溪市華徐衡器實業(yè)有限公司）；高速冷凍離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器股份有限公司）；潔凈工作臺（上海一恒科學儀器有限公司）；生物顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]；酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.5實驗方法

1.5.1巴布劑的制備白術(shù)、高良姜、生姜三味飲片粉碎成最粗粉，加水浸泡，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，備用。提取揮發(fā)油后的芳香水，過濾，得濾液I；豬苓、茯苓、附子（黑順片）和三七飲片粉碎成粗粉，鱉甲粉碎為超微粉，加 8 5 % 乙醇浸泡，回流，過濾，得濾液Ⅱ；醇提后的藥渣，加水煎煮，濾過，得濾液Ⅲ；將濾液I、Ⅱ和Ⅲ合并，減壓濃縮成浸膏， 冷藏，備用。將NP-700，氫氧化鋁分散至甘油 5 % 氮酮 + 5 % 丙二醇中，再加入揮發(fā)油，攪拌均勻，作為A相；卡波姆940加入適量蒸餾水，置于 水浴溶脹，作為B相；取EDTA-2Na，藥物浸膏，加入適量蒸餾水攪拌均勻，作為C相。將C相少量多次加入A相，攪拌均勻后，一起加入B相煉和、涂布，放置 置烘箱中 干燥 3 h ，冷卻后，蓋上蓋襯，即得。1.5.2分組、造模及給藥將66只KM小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥（呋塞米）組、巴布劑低、中、高劑量組，每組11只。除空白組外，其余組采用H22肝癌細胞造小鼠肝腹水模型。取H22肝癌細胞（ 肝癌細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，第5天出現(xiàn)明顯肝腹水癥狀（圖1）。造模 2 4 h 后，空白組、模型組給與空白基質(zhì)貼，陽性藥組灌胃呋塞米混懸液，每天給藥劑量為 6 m g / （ k g ？ d ） ，巴布劑低、中、高劑量組分別每天給藥劑量為 生藥 生藥 生藥 ，給藥面積 。每天給藥1次，連續(xù)給藥 1 0 d 。

1.5.3樣本收集與處理實驗期間觀察各組小鼠的活動狀態(tài)、死亡率等情況；每日用藥前稱量小鼠體質(zhì)量；使小鼠站立式，用軟尺測量其腹部最寬處，記錄小鼠腹圍變化。實驗第8天開始，隨機將小鼠放入代謝籠里，觀察各組小鼠 2 4 h 的尿量情況。各組動物于第10天禁食 2 4 h ，乙醚麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，ELISA法檢測ALT，AST、TP和ALB水平。小鼠取血后，沿腹中線剪開小鼠，用針管抽取腹水，測量腹腔積液。處死小鼠，取肝臟組織，觀察肝臟形態(tài)特征，取一部分肝臟組織進行HE染色切片，觀察各組小鼠肝組織變化情況。

1.6統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用軟件GraphPadPrism10.0進行分析，實驗結(jié)果以 表示， Plt;0 . 0 5 表明差異有統(tǒng)計學意義， Plt;0 . 0 1 表示統(tǒng)計學意義顯著，Plt;0 . 0 0 1 表示統(tǒng)計學意義極顯著。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察、死亡率比較與空白組相比，接種腹水的各組小鼠4d內(nèi)的外觀、精神狀態(tài)、進食無明顯變化。從第5天開始，與空白組相比，接種癌細胞的各組小鼠，肉眼可見小鼠的腹部隆脹，進食、進水量明顯減少，說明造模成功。第6＼～10天，模型組小鼠幾乎每天都有死亡，總死亡率高達 5 4 . 5 4 % ，各給藥組死亡率均低于模型組（ ？ Plt;0 . 0 5 ），小鼠死亡情況見表1。

2.2體質(zhì)量檢測結(jié)果體質(zhì)量變化結(jié)果見表2，與空白組相比，接種腹水的各組小鼠4d內(nèi)的體質(zhì)量無明顯變化。從第5天開始，與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量增加（ Plt;0 . 0 5 ） ，給藥組與模型組比較，體質(zhì)量略有降低，但無顯著差異。

2.3小鼠腹圍檢測結(jié)果腹圍變化結(jié)果見表3。與空白組相比，接種腹水的各組小鼠4d內(nèi)腹圍無明顯變化。從第5天開始，與空白組相比，模型組小鼠腹圍明顯增加（ Plt;0 . 0 5 ） ，給藥組與模型組相比，給藥組腹圍無明顯變化。

2.4尿量檢查實驗第8天各組小鼠 2 4 h 的尿量統(tǒng)計情況見圖2。與空白組相比，模型組小鼠平均尿量減少（ Plt;0 . 0 1 ？ ；與模型組相比，陽性藥組及巴布劑低、中、高劑量組尿量增多（ Plt;0 . 0 5 ） ，表明利水保肝巴布劑對腹水小鼠有明顯的利尿效果。

2.5腹水量的測量各組小鼠腹水量變化見圖3。結(jié)果表明，與模型組相比，陽性藥組和巴布劑低、中、高劑量組小鼠腹腔積液量均有不同程度降低，其中巴布劑中劑量組腹腔積液量降低趨勢明顯（ Plt;0 . 0 5 ） ），表明巴布劑能明顯減少小鼠腹水量。

注：與空白組相比， ；與模型組相比， 。

注：與模型組相比，

2.6肝組織HE染色肝組織病變情況見圖4?？瞻捉M肝小葉完整、結(jié)構(gòu)清晰，未見變性或壞死細胞。模型組肝臟組織水腫明顯，小葉內(nèi)肝細胞彌漫性水腫。巴布劑低、中、高劑量組與模型組相比，肝損傷程度減輕，肝細胞形態(tài)正常，小葉內(nèi)肝細胞輕度水腫。表明利水保肝巴布劑具有緩解肝臟損傷的作用。陽性藥組肝損傷改善不明顯。

2.7利水保肝巴布劑對肝腹水小鼠血清ALB、TP、AST、ALT的影響由表4可知，與空白組比，模型組小鼠血清TP含量降低（ ，AST，ALT含量升高中 （ Plt;0 . 0 0 1 ） ；與模型組比，巴布劑低、中、高劑量組有升高TP的趨勢，顯著下調(diào)AST和ALT含量（ Plt;0 . 0 1 ？ ）表明巴布劑低、中、高劑量組對H22瘤細胞所致的肝損傷有明顯的改善作用，而陽性藥組對血清TP、SLT、AST的影響不顯著。

3討論

中醫(yī)學認為，肝腹水屬于“嚴脹\"的范疇，是“風勞嚴膈\"四類疑難雜癥之一[12，13]。與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)，其主要病機為肝氣不暢，致使肝郁，肝郁日久，可致脾虛，水濕困脾，最終脾腎兩虛，水液不得疏泄，水停腹中而成嚴脹[4。肝硬化腹水病位在肝，因而肝臟必為治療之根本，故歸肝經(jīng)藥為首選。腹水是本病最突出、最主要的癥狀，故應以治水為先，脾為土，主運化水濕，應用歸脾經(jīng)藥物以健脾利濕，腎主水，應用歸腎經(jīng)藥物以益腎利水，針對水停腹中之標實和氣虛不運之本虛之證，利水滲濕藥與補氣（虛）藥應為主要藥物，取其標本兼治之意。治療上應分別治肝、治脾、治腎，益氣活血與扶正驅(qū)邪并重[5。方中鱉甲、田七，歸肝、腎經(jīng)，為活血祛、軟堅消積之效，以治療本病氣結(jié)血瘀之本，使肝臟變軟，脾臟回縮。茯苓、豬苓、白術(shù)，著眼肝脾，兼顧血水，方中重用白術(shù)增強補脾作用，以達扶脾利水、養(yǎng)血和肝之功。方中附子，能增強溫陽泄?jié)峁πВ?、高良姜，通陽化水，分消利導之功。因此，利水保肝巴布劑抗肝硬化腹水具有較好的理論基礎?，F(xiàn)代藥理表明鱉甲、田七等有抑制纖維組織增生，促進肝纖維化重吸收等作用[6，17]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為茯苓、豬苓皆有利尿作用，能促進 的排泄功能尤以豬苓為甚。

肝腹水是肝臟失代償?shù)囊粋€典型特征，約 2 0 % 的肝硬化患者伴有腹腔積液，腹腔積液可導致預后不良及高病死率[18]。本研究中模型組小鼠因腹水量過大，腹壓過高，體質(zhì)量增加過快，造成小鼠 5 0 % 以上的死亡率，與模型組相比，給藥組死亡率明顯降低。同時，利水保肝各給藥組 2 4 h 尿量均顯著增多，腹腔積液量明顯減少，說明該方具有顯著利尿作用，達到消除腹水、降低腹壓、減少死亡的目的。肝臟是生物代謝的主要部位，富含各種酶，其中轉(zhuǎn)氨酶是肝臟代謝中的主要酶。血清中的ALT或AST是肝細胞損傷程度的特異性指標[19]。除 γ 珠蛋白外，血清TP均由肝細胞合成，因此，測量血清蛋白水平可用于反映肝臟合成的狀態(tài)[2]。模型組AST、ALT明顯升高表明肝細胞受損，各巴布劑治療后，各給藥組小鼠ALT、AST含量明顯降低。模型組小鼠TP、ALB明顯降低，與模型組比較，利水保肝巴布劑各組TP、ALB均有上升，表明利水保肝巴布劑可改善肝硬化腹水模型的肝功能水平。肝臟病理HE染色表明，各劑量利水保肝巴布劑均可明顯延緩肝硬化病理進程。

綜上所述，本研究采用H22肝癌細胞腹腔注射方法成功建立了小鼠肝腹水模型，并用于探究利水保肝巴布劑藥效學考察。結(jié)果表明，利水保肝巴布劑具有很好的利尿和降低腹水功效，同時能明顯改善肝功能，保護肝臟。但是對于利水保肝巴布劑的利水通道和肝功能改善的作用機制需要進一步的研究。

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