基于血漿代謝組學探究神經酰胺與鹽敏感性高血壓的因果關聯

高血壓是心血管疾病和腎臟疾病的主要危險因素，也是過早死亡的重要原因，已成為全球公共衛生面臨的重大問題。大量流行病學和臨床研究已證實高鹽膳食與血壓升高之間的因果關系[2-3]。美國心臟協會將部分人群在鹽攝入量變化時表現出血壓水平變化的生理特征定義為血壓鹽敏感性（salt sensitivity of blood pressure，SSBP）[4。SSBP在個體間存在一定差異，根據鹽負荷和利尿后的血壓變化，可分為鹽敏感（saltsensitive，SS）個體和鹽抵抗（saltresistant，SR）個體[5。與SSBP相關的高血壓稱為鹽敏感性高血壓（salt sensitivehypertension，SSH），是原發性高血壓的一種中間遺傳表型。在高鹽攝人的情況下，鹽敏感個體的心血管系統調節功能受損，機體通過升高血壓促進鈉鹽排泄，從而誘發 。鹽敏感性遺傳流行病學研究表明，我國高血壓患者中SSH檢出率約為 。此外，與非SSH患者相比，SSH患者心臟、腎臟等靶器官的損害發生得更早，且損害程度更為嚴重[8。因此，早期識別SSH的生物標志物對其早期預防和精準診治具有重要意義。

代謝物位于基因調控網絡的下游，提供系統生物學的終端信息，且與高階表型密切相關。目前，代謝組學已廣泛應用于揭示復雜表型的生物標志物和致病機制，為深人理解疾病的潛在致病機制提供了寶貴的生物學見解[10-]。部分研究發現，谷氨酰胺、絲氨酸和 β- 氨基異丁酸[12-14]等代謝物與SSH顯著相關。然而，現有研究主要集中于SSBP代謝生物標志物的探索，而關于SSH代謝生物標志物的研究仍較為有限，且大多數研究為觀察性研究。孟德爾隨機化（Mendelianrandomization，MR）分析通過將遺傳變異作為工具變量，評估暴露和結局之間的因果關系。由于遵循等位基因隨機分配原則，MR能夠顯著降低混雜因素和反向因果關系的干擾，已廣泛應用于代謝物與心血管疾病因果關系的研究[15]。本研究基于血壓鹽敏感性系統流行病學隊列（SystemEpidemiologyStudyon SaltSensitivityofBloodPressure，EpiSS）基線調查數據，采用血漿代謝組學和全基因組檢測技術，結合關聯分析和MR分析方法，探索血漿代謝物與SSH之間的潛在因果關系，旨在為SSH的早期預防和精準診治提供新的證據和策略。

1資料與方法

1.1 研究對象

研究對象來自于EpiSS隊列基線調查[。納入標準： ① 年齡為35＼～70歲； ② 漢族； ③ 無血緣關系的獨立個體。排除標準： ① 孕婦； ② 腎臟疾病患者； ③ 惡性腫瘤患者； ④ 自主低鈉飲食的個體。共納入60名研究對象，分為鹽抵抗非高血壓組、鹽敏感非高血壓組、鹽抵抗高血壓組和鹽敏感高血壓組。本研究經首都醫科大學醫學倫理委員會批準（批號：Z2023SY025），所有參與者在加入研究前均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料及樣本采集

采用標準化問卷收集研究對象一般情況（姓名、性別、年齡、婚姻、教育水平、職業狀況等）、生活行為方式（吸煙、飲酒等）、疾病和健康狀況（患病史、家族史等）。使用真空抗凝采血管采集受試者 5mL 外周靜脈血液樣本，分離血漿用于代謝組學檢測，白細胞提取DNA用于基因分型檢測，所有樣本均保存在 冰箱中用于后續實驗。

1.2.2 鹽敏感性高血壓判定方法

采用改良Sullivan急性口服鹽水負荷及呋塞米排鈉縮容試驗（ModifiedSullivan'sAcuteOralSalineLoad and DiuresisShrinkage Test，MSAOSL-DST）判定 。具體步驟如下： ① 受試者靜坐 15min 后，測量基線血壓（ ）； ② 受試者在 30min 內飲用 1L0.9% 生理鹽水， 后再次測量血壓（ ），此為急性生理鹽水負荷期；③ 口服呋塞米 40mg 后 2h 測量血壓（ ），此為利尿縮容期。平均動脈壓（meanarterialpressure，MAP）=（ 1/3× 收縮壓） （ 2/3× 舒張壓）。 ， 。若 或 MAP-10mmHg，則定義為SS，其他個體定義為 。根據2018年《中國高血壓防治指南》[，原發性高血壓定義為在未使用降壓藥物的情況下，非同日3次測量血壓，收縮壓 ？140mmHg 和（或）舒張壓 ？90mmHg ，以及正在使用降壓藥物的高血壓患者。

1.2.3 血漿非靶向代謝組學檢測

使用UltimateTM3000超高效液相色譜串聯QExactiveTM四極桿-靜電場軌道阱高分辨率質譜儀（ThermoScientific，USA）在正離子和負離子檢測模式下進行非靶向代謝組學檢測。通過與人類代謝組數據庫（humanmetabolomedatabase，HMDB）和mzCloud在線數據庫對比化學式、保留時間和代謝途徑，以注釋代謝物結構。非靶向代謝組學共檢測到970種代謝物，其中944種為已知代謝物，26種為未命名代謝物。對代謝物相對豐度進行歸一化和對數轉換[18]，以減少樣本間批次效應和系統誤差。

1.2.4 DNA提取和全基因組檢測

采用全血基因組DNA提取試劑盒（磁珠法，AU18016，BioTeke，北京），提取基因組DNA，使用NanoDrop200O儀器（Thermo FisherScientific，美國）檢測DNA樣品的光密度（opticaldensity，OD）值，260/280比值在1.7至2.1之間表明DNA純度較高。采用IIlumineHD芯片試劑盒（Illumina，美國）對DNA進行基因分型檢測，并利用PLINKv1.9軟件對基因分型數據進行單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和樣本的質量控制，最終得到54例樣本和4241225個SNP位點供后續分析。

1.3 統計學分析

1.3.1 代謝物與SSH關聯性分析

計量資料采用均值和標準差（ ）表示，使用單因素方差分析進行組間比較；分類變量采用頻數和百分比 （n，%） 表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。采用多因素Logistic回歸模型調整年齡、性別和BMI后，分析代謝物與SSH之間的關聯，比值比（oddsratio，OR）和95% 置信區間（ 95% confidence interval， 95%CI ）用于評估代謝物與SSH之間的關聯強度。為控制多重比較帶來的假陽性結果，對所有 P 值進行FDR（1discoveryrate）校正，校正后的 P 值用于進一步判斷代謝物與SSH之間的統計學關聯。為評估不同組別之間代謝物的表達差異，使用小提琴圖對各組的代謝物表達水平進行可視化。均采用雙側檢驗，以 Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

1.3.2 單樣本孟德爾隨機化分析

利用PLINKv1.9軟件分別構建代謝物的遺傳風險評分（geneticriskscore，GRS）作為工具變量。簡單GRS通過計算每種代謝物的SNP風險等位基因的數量總和獲得；加權GRS則通過計算每種代謝物對應SNP的風險等位基因個數及其效應量β 的加權獲得。

采用兩階段最小二乘法（two-stageleastsquares，2SLS）分析代謝物與SSH之間的因果關系。2SLS方法包括兩個階段：第一階段，使用線性回歸模型評估GRS與代謝物之間的關聯強度，并估算代謝物的預測值；第二階段，采用Logistic回歸模型分析第一階段預測值與SSH之間的關聯。模型1調整年齡和性別；模型2調整年齡、性別、BMI、吸煙和飲酒狀況。OR值表示代謝物的GRS每增加單位標準差，患SSH風險增加的倍數。

1.3.3 兩樣本孟德爾隨機化分析

1.3.3.1 數據來源

代謝物神經酰胺Cer（d34：0）和Cer（d40：1）數據分別來自Cadby等[]和Harshfield等[2]的GWAS研究。以上GWAS數據可從GWASCatalog中免費獲?。╤ttps：//www.ebi.ac.uk/gwas/）。SSH的GWAS數據來自EpiSS研究，共包含1684例研究對象，其中198 例為 SSH患者。

1.3.3.2 工具變量選擇

本研究以代謝物為暴露因素，SSH為結局因素。首先，在全基因組范圍內，以 為閾值，篩選與代謝物顯著關聯的SNPs。根據 ， kb=10000 的標準，剔除存在連鎖不平衡的SNPs，確保所選SNPs之間相互獨立。使用 F 統計量評估工具變量的強度，當 F 統計量 gt; 10時，認為該工具變量是強工具變量。

1.3.3.3 統計方法

逆方差加權法（inversevarianceweighting，IVW）作為兩樣本MR分析的主要方法，同時采用MR-Egger回歸、加權中位數法（weightedmedianestimator，WME）、簡單模式（simplemode，SM）和加權模式（weightedmode，WM）作為補充方法，進行全面的評估。代謝物與SSH的因果關系采用OR值表示。采用Cochran's 檢驗及其P 值評估工具變量的異質性， Pgt;0.05 表示不存在顯著異質性。使用MR-Egger截距檢驗評估是否存在水平多效性。采用MR-PRESSO方法評估MR分析結果中可能存在的離群SNPs，進而檢驗MR分析結果的穩定性和可靠性。所有統計分析均使用R4.3.3軟件進行。

2 結果

2.1 一般情況

本研究共納入60例研究對象，年齡范圍為35＼～70歲，其中，鹽抵抗非高血壓組、鹽敏感非高血壓組、鹽抵抗高血壓組和鹽敏感高血壓組各15例。舒張壓、MAP、 和 在四組間的差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），其余變量在四組間的差異無統計學意義，見表1。

2.2 代謝物與SSH關聯分析

以代謝物水平為自變量，以是否患有SSH為因變量，調整年齡、性別和BMI進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，共有73種代謝物與SSH之間關聯存在統計學意義（ Plt;0.05 ）。經FDR校正后，神經酰胺 Cer（d34；0）， 和 ）仍與SSH呈顯著正相關，OR值（ 95%CI ）分別為1.55（1.36，1.76）和2.19（1.66，2.91），其余代謝物與SSH之間關聯未通過多重檢驗校正水平（表2）。神經酰胺Cer（d34：0）和Cer（d40：1）的表達水平如圖1所示，SSH組的神經酰胺Cer（d34：0）和Cer（d40：1）水平與其他三組之間均存在統計學差異（ Plt;0.05 ）。

2.3 單樣本孟德爾隨機化分析

Cer（d34：0）共納入55個工具變量， 共納入8個工具變量，分別計算其簡單GRS和加權GRS。單樣本MR模型調整年齡和性別后，Cer（d40：1）的簡單GRS[OR =2.627 ， 95%CI （1.953，3.535）]和加權GRS[OR ， 95%CI （1.217，8.125）]均與SSH存在因果關系（ Plt;0.05 ）；而Cer（d34：0）的簡單和加權GRS均未顯示與SSH之間存在因果關系（ Pgt;0.05 ）。在調整年齡、性別、BMI、吸煙和飲酒狀況后，Cer（d40：1）仍與SSH存在因果關系，簡單GRS的OR值為 （1.887，3.234）]，加權GRS的OR值為 （1.303，8.674）]（ Plt;0.05 ）；Cer（d34：0）與SSH之間無因果關系（ Pgt;0.05 ），見表3。

2.4 兩樣本孟德爾隨機化分析

IVW模型結果顯示，Cer（d34：0）和Cer（d40：1）與SSH無因果關系（ Pgt;0.05 ），使用MR-Egger回歸、WME、SM和WM法進行分析，亦未發現Cer（d34：0）和Cer（d40：1）與SSH之間存在因果關系；敏感性分析未發現異質性和多效性，MR結果穩健（ Pgt;0.05 ），見表4。

3 討論

本研究基于EpiSS研究數據，開展非靶向代謝組學和全基因組檢測，并采用Logistic回歸分析和MR分析方法，探討血漿代謝物與SSH之間的關聯和因果關系。關聯分析結果顯示，經FDR校正后，Cer（d34：0）和Cer（d40：1）與SSH之間存在正相關關系，可能是SSH的危險因素。單樣本MR分析結果表明，Cer（d40：1）與SSH存在因果關系，而Cer（d34：0）與SSH之間未發現直接的因果關系。通過利用公共數據庫中的代謝物GWAS數據進行兩樣本MR分析，并在嚴格質量控制和敏感性分析后，未能找到Cer（d34：0）和Cer（d40：1）與SSH之間存在因果關系的證據。

代謝組學作為反映機體內環境狀態變化的重要指標，不但檢測簡便，而且能夠在代謝物水平上放大基因和蛋白質表達的微小變化，從而更全面地反映細胞功能、細胞活動以及外暴露（如膳食攝入）的影響[21-22]。目前，代謝組學已廣泛應用于探索多種疾病表型的生物標志物和致病機制。Chen等[23]開展高血壓非靶向代謝物組研究，發現高血壓患者的6種血漿代謝物水平升高，37種血漿代謝物減少，這些代謝物可能成為高血壓治療和干預的潛在靶點。Shi等[3]對慢性飲食鹽負荷者開展非靶向代謝組學，結果發現2-甲基丁酰肉堿和異亮氨酸等代謝物與高血壓存在關聯。Zhang等[4通過代謝組學研究發現谷氨酰胺是SSBP的保護性代謝物，為識別SSBP生物標志物和探索SSH的致病機制提供了重要線索。

注：A.神經酰胺Cer（d34：O）；B.神經酰胺Cer（d40：1）；SRN.鹽抵抗非高血壓組；SSN.鹽敏感非高血壓組；SRH.鹽抵抗高血壓組；SSH.鹽敏感高血壓組； . . 。

本研究結果提示神經酰胺Cer（d34：0）和Cer（d40：1）可能是SSH的危險因素。神經酰胺作為構成鞘脂的重要組成部分，是游離脂肪酸豐度的細胞內信號，啟動細胞在生理或營養應激時應對脂質負擔的反應，在高血壓、動脈粥樣硬化、2型糖尿病和脂肪肝的病理生理過程中發揮重要作用[24。目前，神經酰胺已被證實是不良心血管疾病結局的準確生物標志物[25]。Lee等[26]發現，急性缺血性卒中患者發生卒中后的 48～72h 內，鞘氨醇-1-磷酸和超長鏈神經酰胺水平顯著降低，提示神經酰胺可能是急性缺血性卒中患者的潛在預后生物標志物。Mantovani等[27]則發現，對于確診或疑似冠狀動脈疾病的患者，血漿神經酰胺是應激性心肌灌注缺陷的獨立預測因子。

本研究進一步對識別到的SSH相關代謝物開展單樣本MR分析，結果表明Cer（d40：1）與SSH之間存在因果關系，提示神經酰胺可能在SSH的發生發展中起到重要作用。神經酰胺作為信號分子，參與缺血/再灌注和毒性損傷引起的急性腎損傷，進而導致SSH的發生[28]。然而，在兩樣本MR分析中并未發現兩者之間存在顯著的因果關系，可能與樣本量、數據來源和工具變量的差異有關。開展進一步的研究，特別是通過增加樣本量和優化工具變量，可能有助于更好地揭示神經酰胺在SSH中的潛在因果作用。此外，Cer（d34：0）與SSH之間未發現因果關系，這可能是由于兩者之間的因果關系受到SSH其他相關間接途徑的影響，從而導致兩者間存在相關性，但缺乏直接的因果關系。仍需進一步研究探索并驗證Cer（d34：0）與SSH之間的關系。

本研究也存在一定的局限性。首先，納入的研究對象樣本量較少，可能存在假陰性結果，限制了發現更多與SSH存在關聯的代謝物，未來需擴大樣本量并進行靶向代謝組學檢測進一步驗證研究結果。其次，由于代謝物的GWAS數據主要來自歐洲人群，后續應該在更大規模的亞洲人群中開展MR分析。

綜上所述，本研究基于非靶向代謝組學識別出神經酰胺Cer（d34：0）和Cer（d4O：1）是SSH相關的生物標志物，通過MR分析提示 水平與SSH的發生風險存在正向因果關系。該結果為SSH的早期篩查提供了代謝生物標志物，也為深入探索SSH的致病機制提供了新的思路。

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收稿日期：2025年01月12日修回日期：2025年03月10日本文編輯：桂裕亮 曹越