新型納米探針通過靶向MN受體抑制透明細胞腎細胞癌的應用研究

Application of innovative nanoprobes for targeted inhibition of clear cell renal cell carcinomaviaMN receptors

ZHU Hanwen， YAN Yishuo， QI Xin，LI Cong，WANG Ziqi DepartmentofUrology，HarbinedicalUniversityCancerHospital，Harbin5oo81，China Corresponding author： WANG Ziqi， Email： wangziqi@hrbmu.edu.cn

【Abstract】 Objective To evaluate the role of novel nanomaterial MN receptor targeted inhibition system （MTIS） in targeting and inhibiting clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）. Methods The microprobe MTIS was designed and implemented for use with ccRCC cell lines 786-O and Caki-1. The targeting efficacy of both MTIS and MN was examined through laser scanning confocal microscopy （CLSM）. CCK-8 and Transwell assays were conducted to confirm the inhibitory impact of MTIS on ccRCC.Additionally， the Renca cell line was utilized to induce subcutaneous tumors in mice， and MTIS was administered through tail vein injection to assess its therapeutic effect. Results The CLSM observations revealed that MTIS exhibited excellent colocalization with tumor cells. The results from CCK-8 and Transwell experiments further demonstrated that MTIS significantly inhibited the migration and invasion of tumor cells. Furthermore，the effective concentration of MTIS injected via tail vein at the tumor site in mice was observed using the in vivo imaging system （IVIS）.Notably， the tumor volume in mice after 14，21 and 28 days treated with MTIS were markedly smaller compared to the control group （Plt;0.05） .Conclusion The novel nanoprobe MTIS effectively targets cRCCcelsand demonstrates asignificant inhibitory effecton their migration and invasion.

【Keywords】Clear cellrenal cell carcinoma； Tumor imaging； Nanomaterials； Targeted inhibition； MN receptor

腎細胞癌（renalcell carcinoma，RCC）發病率在全球范圍內呈上升趨勢，主要與人口老齡化、高血壓、肥胖和環境暴露等因素有關[。其中透明細胞腎細胞癌（clearcell renal cell carcinoma，ccRCC）是RCC最常見的一種亞型，約占所有RCC病例的 。近年來，隨著影像學技術的發展，越來越多的早期ccRCC被發現[3，但其臨床治療面臨著巨大的挑戰，尤其在晚期和轉移性病例中，傳統放化療對ccRCC的療效有限[4]。作為一門新興技術，消融技術為腫瘤治療提供了新的選擇和治療方案[5，但該技術因腎腫瘤體積大、腎解剖位置深、脂肪覆蓋多以及傳統檢測手段CT、核磁共振等難以在術中良好定位和顯影等原因，并未在腎癌治療中得到廣泛應用。而近紅外熒光成像技術在實時指導腫瘤手術完整、安全切除等方面表現出巨大潛力，但因其靶向特異性不強、示蹤劑易清除、示蹤劑毒性不易控制等原因，也未能在臨床診療中廣泛應用，因此，尋找新的靶向腫瘤顯影方法及腫瘤治療方案成為研究重點。

MN/CA9是碳酸酐酶家族成員，是細胞表面糖蛋白和腫瘤相關抗原[，在ccRCC、尿路上皮癌和三陰性乳腺癌等多種實體瘤中表達，其在ccRCC中表達率高達 ，與腫瘤生長、侵襲和患者預后密切相關[1。其特異性成為ccRCC診斷和預后的重要生物標志物，同時也為該疾病的靶向治療提供了潛在的靶點[2]。基于此，研究團隊設計了新型納米材料MN受體靶向抑制系統（MNreceptortargetedinhibitionsystem，MTIS），能夠特異靶向并定位腫瘤，使腫瘤顯影，并具有抑制腫瘤生長的功能，為復雜的ccRCC診療提供了新的工具和方法，有望推動更精準的診斷和治療策略的發展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑與材料

1640細胞培養基（美國Gibco公司），5A細胞培養基（美國Gibco公司），Matrigel基質膠（美國康寧公司），無菌PBS緩沖液（大連美侖生物技術有限公司），胎牛血清（美國賽默飛世爾科技公司），多聚甲醛（中國白鯊生物科技有限公司），DAPI染色液（北京索萊寶科技有限公司），MN抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），0.2% 結晶紫溶液（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶（中國碧云天生物技術股份有限公司），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（中國碧云天生物技術股份有限公司）。

1.1.2 細胞來源及培養

786-O（ccRCC細胞系）、Caki-1（ccRCC細胞系）、Renca（小鼠腎癌細胞系）均購置于上海富衡生物科技有限公司。786-O、Renca細胞培養于含有 10% 胎牛血清、 1% 青霉素/鏈霉素的1640培養基中，Caki-1細胞在含有 10% 胎牛血清的5A細胞培養基中培養。所有細胞置于 、 的恒溫培養箱中培養。

1.1.3 實驗儀器

酶聯免疫吸附檢測儀（美國SpectraMax公司）， 細胞培養箱（中國博科控股集團有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanningconfocalmicroscope，CLSM）（德國蔡司公司），高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司），光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），IVIS成像系統（美國Spectrum公司）， 冰箱（中國海爾公司）。

1.1.4 實驗動物

雌性小鼠9只（遼寧長生生物技術股份有限公司），6周齡，獨立通風籠中飼養，定制飼料喂養，每3d更換食物、水、墊料。本研究已通過哈爾濱醫科大學附屬第四醫院倫理委員會審核批準（批號：2024-DWSYLLCZ-30）。

1.2 實驗方法

1.2.1TCGA數據庫腎癌基因數據分析

通過癌癥基因組圖譜（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）數據庫對ccRCC（KIRC/ccRCC）患者的基因表達數據進行差異分析，包括ccRCC樣本和癌旁正常組織樣本共604例，使用DESeq2篩選前20個差異表達顯著的基因，基因篩選標準為 P 值 ？0.05 ，通過R語言“ggplot2”包生成熱圖。使用泛腎癌隊列（ KICH+KIRC+KIRF ）進行癌和癌旁基因差異表達分析，包括887個RCC和129個癌旁正常樣本的表達譜數據。

1.2.2 納米探針的構建

MTIS納米探針購置于杭州丹港生物科技有限公司，通過固相法合成（SCYNTNHVPLSPKY-Cy）。1.2.3CLSM驗證納米材料與腫瘤細胞共定位

按照以下步驟評估MTIS的靶向能力：首先，將 個細胞均勻鋪展在CLSM專用培養Ⅲ中，并置于細胞培養箱中孵育 24h 。隨后，向培養皿中加入MTIS，并在 恒溫孵箱中孵育15min 。孵育結束后，使用PBS對培養Ⅲ進行3次洗滌，以去除未結合的MTIS。使用多聚甲醛對細胞進行 20min 的固定處理。固定完成后，向培養血中加入MN抗體，并將其置于 的冰箱中過夜孵育。 24h 后取出培養皿，并加入熒光二抗，在 下孵育 。熒光二抗能與MN抗體結合并發出熒光信號，可在顯微鏡下可視化觀察MN抗體與細胞內目標分子或結構的結合情況，

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞毒性

通過以下步驟評估MTIS在Caki-1細胞系中的細胞毒性：首先，將Caki-1細胞以每孔5000個細胞的密度精確接種在96孔板中。隨后，將細胞置于細胞培養箱孵育 24h ，使其達到合適的生長狀態和密度。將MTIS溶液加入含有細胞的孔中，使細胞暴露于MTIS中 15min 后，更換培養基并繼續培養 72h ，在 24h 、 48h 人 72h 等時間點測吸光度，以觀察MTIS對細胞長期生長的影響。而對照組則使細胞暴露于PBS 中 15min 其他處理方式與MTIS組相同。測定吸光度之前，向每個孔中加入CCK-8試劑，孵化 2h 后，使用微孔板讀數器在 450nm 波長處測量每個孔的OD值，并根據公式計算細胞存活率。

1.2.5 Transwell實驗檢測腫瘤細胞遷移和 侵襲

采用配備有8um孔徑聚碳酸酯膜的24孔Transwell小室系統，對細胞的遷移與侵襲能力進行體外評估。Transwell小室上室被預先均勻涂覆了一層Matrigel基質膠，以模擬細胞在體內的侵襲過程。在上室中接種 個細胞，并在添加了PBS、MTIS（濃度為 ）的含 10% 胎牛血清培養基中培養 24h 。培養結束后，使用 4% 多聚甲醛溶液對細胞進行固定處理，以確保細胞形態的穩定；使用 0.2% 結晶紫溶液對細胞進行染色。在光學顯微鏡下，對遷移到Transwell小室下表面的細胞進行檢查與計數，評估不同處理條件下細胞的遷移與侵襲能力。

1.2.6 小鼠皮下種瘤模型的構建

使用無菌注射器吸取含有 個細胞的懸液并注射至小鼠脅部皮膚下約 2～5mm 的深度，待腫瘤體積增長至約 時，隨機選取其中3只小鼠用于成像實驗，通過尾靜脈注射方式向小鼠體內注入熒光探針，以追蹤納米探針在體內的分布與代謝情況。在注射后的 、 、 /24h 四個時間點，使用IVIS活體成像系統對小鼠進行熒光成像分析，以觀察納米探針在腫瘤部位的積聚情況。為了評估MTIS的抗腫瘤效果，將其余6只小鼠隨機分為MTIS、PBS兩組，每組3只，每2d向小鼠體內注射1次納米探針，共計處理5次。在首次注射后的第28天，對小鼠實施安樂死，并仔細測量腫瘤體積，以此作為評估MTIS抗腫瘤作用的指標。

1.3 統計學分析

使用GraphPadPrism8.3.1軟件進行統計學分析。數據以均數和標準差（ ）表示，采用 t 檢驗和單因素方差分析進行組間差異比較。所有實驗均重復3次及以上，每個實驗的樣本量至少為3個樣本（ n？3 ）。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TCGA數據庫腎癌基因差異表達分析

如圖1所示，MN、NDUFA4L2、ANGPTL4、FABP7、NPTX2、CD70、SLC6A3等多個基因表達水平在ccRCC組織中顯著升高，其中，MN受體變化尤為突出，其logFC值高達7.370861，遠高于其他基因如NDUFA4L2（logFC：6.550539）、ANGPTL4（logFC：5.551 477）、FABP7（logFC：5.508645）和NPTX2（logFC：5.271748）。

利用TCGA數據庫對ccRCC及其癌旁組織進一步分析發現，MN受體在腫瘤組織中顯著高表達，而在正常組織中幾乎不表達（圖2）。鑒于此，本研究以MN受體為研究靶點，探討MN受體的功能、調控機制及其在ccRCC發生和發展中的作用。

2.2 MTIS細胞水平靶向效果檢測

在ccRCC細胞系786-O和Caki-1中，紅色熒光標記的MTIS與綠色熒光標記的MN受體高度重合，呈現出顯著的共定位現象，驗證了MN靶向基序所具備的精準且有效的靶向能力（圖3、圖4）。

2.3 MTIS抑制腫瘤細胞增殖

對Caki-1ccRCC細胞系進行時間梯度CCK-8細胞活性測定，結果顯示在 的觀察期內，MTIS顯著抑制了Caki-1細胞的增殖活動，而對照組細胞的增殖則未受到明顯影響，表明MTIS具有在特定時間內有效減緩Caki-1腫瘤細胞生長的能力（圖5）。

2.4MTIS抑制腫瘤細胞遷移和侵襲

如圖6所示，與PBS組相比，MTIS顯著降低了786-0細胞的遷移率和侵襲率，表明MTIS具有抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用。

2.5小鼠動物模型檢測MTIS靶向及抑制腫瘤能力

藥物在腫瘤組織中的積聚情況是評估其靶向治療效果的核心指標。通過靜脈注射對構建的異種移植瘤小鼠模型給予MTIS后，運用IVIS系統監測其在攜帶腫瘤的小鼠體內分布情況。結果如圖7所示，在小鼠腫瘤區域觀察到了強烈的熒光信號，熒光強度隨時間推移呈下降趨勢，證明了注：標尺： 50μm ，放大倍數： ×20 注： . 。

MTIS能有效且精準地靶向腫瘤組織。

靜脈注射研究結果顯示，相較于對照組，接受MTIS治療的小鼠腫瘤體積在治療后 14d 、21d和28d均顯著小于對照組，差異具有統計學意義，反映MTIS具有良好的抑制腫瘤生長的能力（圖8）。

3 討論

美國癌癥協會最新數據顯示，腎癌和腎盂癌是十大確診癌癥之一[13-14]。腎癌是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤，對醫療保健構成重大威脅[15]。盡管近年來在其分子機制、診斷和治療上取得了諸多進展，但仍面臨許多挑戰[。手術是RCC的首選治療手段，然而有 20%～40% 的RCC患者在接受手術后會遭遇腫瘤的復發與轉移。基于放療和細胞毒性化療藥物的傳統治療方案，對于RCC的療效并不顯著。隨著醫學的進步，靶向藥物應運而生并不斷發展，靶向治療通過精準打擊腫瘤細胞的特定分子通路，顯著提高了RCC的治療效果。其中包括針對哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）和酪氨酸激酶受體信號通路的藥物，這些新藥在治療RCC方面取得了一定程度的進展，但在使用過程中容易產生耐藥性，從而限制了長期的治療效果[7]，因此，仍需開發新的治療手段來克服目前的困境。

隨著納米技術時代的來臨，納米探針靶向治療作為癌癥治療領域的一項革新性突破，尤其在腎癌的治療上，已取得了較大的研究進展[18]。本研究結果亦發現，MTIS納米探針可以特異性靶向MN受體，精準識別和結合ccRCC腫瘤細胞；MTIS還可負載熒光染料，在體外細胞實驗中，利用CLSM獲取的圖像清晰揭示了MTIS納米探針憑借其特異性結構，能精準與MN受體實現特異性結合，且探針上修飾的熒光染料能使腫瘤細胞顯影，反映MTIS具有出色的靶向性能。

CCK-8實驗結果顯示，相較于對照組，MTIS組顯著抑制了腎癌細胞的增殖活動，且隨著處理時間的延長，MTIS對腎癌細胞增殖的抑制作用持續存在，表現出穩定的抑制效果。而在Transwell實驗中，MTIS有效削弱了腎癌細胞的遷移和侵襲能力，具體表現為穿透小室的細胞數量明顯減少。MTIS對腫瘤細胞的抑制作用得益于其具有較強的靶向且抑制MN受體的能力。MN是碳酸酐酶家族中的一個異構體，它是一種由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，在調節細胞增殖和轉化方面扮演著關鍵角色[19]。MN在多種癌癥中高度表達，尤其在宮頸癌中展現出促進細胞轉移的重要作用。研究表明，MN的過表達不僅增強了胞外信號調節激酶的磷酸化，誘導上皮間質轉化，還促進了細胞的遷移能力[20]。此外，一些研究已觀察到MN與多種細胞黏附及遷移相關分子如E-鈣黏蛋白、整合素等潛在的相互作用，從而促進腫瘤細胞遷移[2]。MN與缺氧、酸中毒、侵襲性及治療耐藥性相關，其可通過酶活性或非催化機制對癌癥進展產生實質性影響[22]。因此，靶向表達MN的腫瘤細胞有望成為多種治療環境中的有益策略，并與現有及新型療法相結合，為ccRCC治療提供新的視角。

體內實驗中，本研究發現MTIS能在小鼠的腫瘤部位形成明顯的濃聚，且MTIS組小鼠腫瘤體積顯著小于對照組，證明MTIS在抑制腫瘤生長方面具有良好效果。MTIS之所以能在ccRCC的治療中取得顯著成效，主要得益于納米探針的成像技術、藥物遞送和靶向治療作用[23]。這些優勢不僅顯著提高了治療效果，還有效降低了對正常組織的毒副作用，為MTIS在臨床應用中的廣泛推廣奠定了堅實的基礎。

本研究存在一定局限性，包括使用有限的ccRCC細胞系和小鼠模型可能難以完全代表人類ccRCC和腫瘤微環境；實驗技術如CLSM、CCK-8和Transwell實驗存在實驗條件選擇上的局限；MTIS在體內非目標組織中的分布情況以及最佳劑量與給藥方案的確定仍需進一步研究等。此外，MTIS作為新型藥物輸送和診斷工具，在生物安全性方面也存在毒性反應和代謝過快等局限，同時與現有靶向藥物相比，存在靶向性不夠精準、制備技術復雜、成本較高且穩定性較差等缺點。然而，隨著科技的進步和納米技術的深入研究，這些局限性有望逐步得到克服。

綜上所述，MTIS作為新型納米材料在ccRCC治療中展現出巨大的潛力，通過精準靶向、多重打擊機制、智能遞送與釋放以及實時影像監測，顯著提高了治療效果，減少了對正常組織的損傷。未來應用前景廣闊，包括個性化精準醫療、聯合治療策略、新型納米材料開發和臨床轉化與應用等，為腫瘤治療提供了新的方向和希望。

倫理聲明：本研究獲得了哈爾濱醫科大學附屬第四醫院倫理委員會審批（批號：2024-DWSYLLCZ-30）

作者貢獻：研究設計：祝漢文、王子琦；生物信息學分析：閆溢爍；實驗實施：祝漢文、齊鑫；數據收集與整理：祝漢文、閆溢爍、齊鑫；論文撰寫：祝漢文；論文修改與指導：李聰、王子琦；資金支持：王子琦

數據獲取：本研究中使用和（或）分析的數據已保存于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院分子探針與靶向診療重點實驗室數據庫中，并在論文中得到了完整呈現，如有需要，可聯系通信作者根據合理請求提供

利益沖突聲明：無

致謝：國家自然科學基金（82171999）提供的資金支持

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收稿日期：2024年11月22日修回日期：2025年01月16日本文編輯：桂裕亮 曹越