梨野生種質資源花粉形態掃描電鏡觀察

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A

Scanning Electron Microscopy Analysis of Pollen Morphology in Wild Pyrus Germplasm Resources

WANG Wencheng （Agriculture and Rural Comprehensive Service Center of Boxing County，Binzhou City，Shandong Province， Boxing Shandong 256500，China）

Abstract：【Objective】Toprovide palynological evidencefortheclassificationof Pyrus plants in China andatheoretical basis for the innovationand identification of Pyrus wild germplasm resources.【Methods】Pollen morphology is oneof the important bases for studying plant species classification. Scannng electron microscopy （SEM） was used toobserve the morphologyof 87types of Pyrus wild germplasmresources，comparing the size and external morphology of thepollen grains.【Results】 The results showed that the equatorial view of pollen of P_yrus wild germplasm resources were mostly oblong or elliptical，andthe polar view were trilobate circularor triangle withtheedgesof the threecorners are circulararch. There were 3- colporate，stripe ornamentationand perforationonthesurfaceofpolen grains.Thepolaraxisofthepolen grainsof87Pyrus wild germplasm resources was 38.25～45.52μm ，with an average of 41.13μm ； andthe equatorial axis was 18.47～24.57μm with an average of 20.49μm ，all of which belonged to medium spores. The width of the lirae was 0.18～0.26μm ， and the average value was 0.22μm ， the distance between twolirae was 0.20～0.29μm ，and the average value was 0.16μm . The hole diameter was 0.09～0.15μm ， the average value was 0.16μm ， the piercing frequency was 1.98～3.43/μm² ，and the average value was 2.55/μm² . There was no significant differences in shape，size and exine ornamentation of the same species of pollen andtherewasCertaindiferencesexistindiferentspecies.There weresignificantdiferences inthesizeandmorphologyof pollen grains between different types of pollen. The pollen characters of P . ussuriensis ， P . calleryana，P. pyrifolia，and P .bretschneideri soonallhad certain diferences.The clustering analysis basedon polln phenotypiccharacters showed that 6 species of Pyrus wild germplasm resources couldbedivided into 4 groups. Pyrus betuleafoliaand Pyrus caleryana were clustered intoone group，Pyrus bretschneideriand Pyruscommunis wereclustered intoanother group indicated thattheir phenotypic morphology wasclosely related.【Conclusion】The studywould provideagenetic basisfortheclasificationand identi

fication of pear wild germplasm resources.

Key words： Pyrus； pollen morphology； scanning electron microscope;genetic diversity; clustering analysis

梨屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomace-ae）梨屬（Pyrus）[1]。我國是梨屬植物的起源中心之一，資源非常豐富[2]。世界梨屬植物有30 余種，中國有14種[3]。研究梨屬植物的分類以及梨屬植物種間的親緣關系，對于種屬分類及種質鑒定具有重要的意義。形態學標記簡單直觀，是進行種質資源鑒定及分類的重要方式之一[4]。植物花粉的形態受基因型控制，不易受到外界環境的影響，是在長期進化過程中不斷演變而來的，具有穩定性和保守性[5-6]，且不同植物的花粉有著獨特的形態特征，因此可作為植物鑒定、探討植物分類的重要依據之一。其中，花粉外壁紋飾是目前公認的進行分類的最重要的依據之一[7]。目前，利用花粉形態學手段在果樹[8-15]、花卉[16-18]、蔬菜[19]等植物上均進行了大量的研究。其中對梨屬植物一些類型的花粉也進行了描述和研究，發現梨屬植物花粉具有一定的共同特征，但不同種間也有一定的差異性[20]。目前，梨屬植物花粉形態學研究主要應用于果樹分類及種間類群鑒別[21]、果樹種間親緣關系分析[22]、果樹系統學研究[23]等方面。我國對梨野生種質資源調查的不斷深人和新資源的增多，為更好地開發及利用梨野生種質資源提供了基礎條件。本研究應用掃描電鏡對山東省（我國）梨屬植物87份花粉進行了形狀、大小、紋飾的特征的觀察比較，試圖從花粉形態特征方面比較其異同，以期為我國梨屬植物的分類提供孢粉學依據并為梨屬植物的種質資源創新及鑒定提供依據。

1材料與方法

1.1材料

本試驗選取的87份花粉材料來源于全國各地，共6個種（見表1）：1）杜梨（ P . betulaefolia），51個野生類型；2）秋子梨（ P . ussuriensis），21個野生類型；3）砂梨（P．pyrifolia），1個栽培類型、4個野生類型；4）豆梨（ P . callery-ana），7個野生類型；5）白梨（ P .bretschnei-deri），1個栽培類型；6）西洋梨（ P .commu-nis），2個雜種類型。

1.2方法

試驗于2019年—2020年進行。選即將開放的花蕾，采其花藥，經室溫干燥后收集花粉，并于4^°C 低溫干燥貯藏。掃描時將供試的花粉均勻撒在粘有導電膠帶的樣品臺上，用洗耳球吹去多余的花粉，以免重疊。然后放人離子濺射儀內噴金，濺射真空度 6.67～13.3Pa ，電流 7～8mA ，濺射時間為 5min 。后置樣品于日本電子JEOL（SEM）Oxford（EDS）JEOL—7500F分析型場發射掃描電子顯微鏡下進行觀察記錄，加速電壓 20kV ，束流 80μA 。取有代表性的視野進行顯微照相。

1.3 數據采集與分析

用Image-ProPlus6.O對掃描電子顯微鏡所拍攝照片中花粉粒的極軸長度（P），赤道軸長度（E），極赤比 ?P/E） ，條脊寬，條脊距，穿孔徑和穿孔頻率7個表型形態進行測量。每個類型選取20個具有代表性的花粉粒。條脊、紋孔均選用花粉赤道面的中部位置進行測量。后在MicrosoftExcel2017中對數據進行分析基本數據統計分析，包括個性狀的最大值、最小值、均值。

聚類分析采用NTsys—2.10e軟件，利用Sim-ilarity中的Qualitativedata程序計算遺傳距離，然后采用Clustering中的SHAN程序按照類平均法（UPGMA）對遺傳距離矩陣進行聚類，并通過Graphics中的Treeplot程序生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1梨野生資源花粉粒的形狀及大小

對6個種的87份花粉資源進行掃描電鏡觀察，結果表明：不同類型或品種其花粉粒的形狀（見圖1）、大小（見表2）均有不同程度的差異。如圖1所示，梨屬植物花粉形態在掃描電鏡下觀察，其花粉粒的赤道面觀呈橢圓形或長橢圓形1 （1.65～2.19） ），極面觀大部分呈三裂圓形或三角形且3個角邊緣部分呈圓弧狀。本研究中的梨種質資源花粉粒的赤道面均具有3條孔溝，其方向沿極軸向兩極伸展。

如表2所示，87份梨屬植物資源的花粉極軸長 38.25～45.52μm ，平均值為 41.13μm ；赤道軸長 18.47～24.57μm ，平均值為 20.49μm ，均屬于中型孢子。

A1：杜梨群體 （×400） ；A2：杜梨赤道面觀 （×2000^? ；A3：杜梨極面觀 （×2000） ；Bl：秋子梨群體 （×400） ：B2：秋子梨赤道面觀 （×2000^? ；B3：秋子梨極面觀 （×2000） ；C1：豆梨群體 （×400） ； C2 ：豆梨赤道面觀 （×2000） ：C3：豆梨極面觀 （×3500^? ；D1：砂梨群體（ ×400^? ；D2：砂梨赤道面觀 （×2000） ；D3：砂梨極面觀 （×3500） ；E1：西洋梨群體 （×400） ；E2：西洋梨赤道面觀 （×2000^? ；E3：西洋梨極面觀 （×3500） ；F1：白梨群體 （×400） ；F2：白梨赤道面觀 （×2000^? ；F3：白梨極面觀 （×3500） 。

2.2梨野生資源花粉粒的表面紋飾

梨屬植物花粉粒表面具有條紋狀紋飾和穿孔。如圖1所示，不同類型花粉間的外壁紋飾差異較大，條脊的方向有縱向平行、交叉分支與弧狀等類型。條脊寬度為 0.18～0.26μm ，平均值為 0.22μm ，條脊距為 0.20～0.29μm ，平均值為 0.16μm 。穿孔有圓形、橢圓形與不規則形等形狀。在溝間區赤道附近較平的部位穿孔較稀，在溝間區兩側邊緣和近極區等部位較密。穿孔徑為 0.09～0.15μm ，平均值為 0.16μm ，穿孔頻率為 1.98～3.43 個 /μm² 平均值為2.55個/ μm² 。不同類型或品種其花粉表面的紋飾和穿孔都存在著差異。杜梨花粉粒外壁兩端為簸箕指紋狀紋飾，中間條紋與極軸方向平行；秋子梨花粉粒外壁條紋與極軸方向平行，條紋清晰；豆梨花粉粒外壁條紋中部與赤道軸方向平行，邊緣與極軸方向平行；砂梨花粉粒外壁條紋中間為圓弧狀，兩端與極軸方向平行；西洋梨花粉粒外壁條紋交叉分支；白梨花粉粒外壁條紋不規則，縱橫交錯。

2.3梨野生資源種間花粉粒大小及形狀差異分析

通過對供試的梨野生資源的6個種花粉粒的極軸、赤道軸、條脊寬、條脊距、穿孔徑和穿孔頻率進行統計分析（見表3）。結果表明，極軸以鴨梨最長，杜梨最短；赤道軸以砂梨最長，杜梨最短；

極軸與赤道軸的比值（P/E），以秋子梨最大，以砂梨最小；杜梨、豆梨的條脊距均較短，砂梨的條脊距明顯較長。條脊寬以鴨梨最長，以秋子梨、西洋梨最短；穿孔徑以秋子梨最大，以鴨梨最小；穿孔頻率則以鴨梨最高，以西洋梨最低。

杜梨花粉粒的赤道面觀為橢圓形，極面觀為三裂圓形。極軸長為 36.31～43.49μm ，平均值為40.16μm ，赤道軸長為 17.78～22.95μm ，平均值為 20.29μm ，極軸與赤道軸之比為1.98。花粉粒表面條脊方向較平直，有分枝，條脊寬為 0.19～ 0.28μm ，平均值為 ，條脊距為 0.14～ 0.21μm ，平均值為 0.17μm 。穿孔徑為 0.11～ ，平均值為 0.13μm ，穿孔頻率為 2.11～ 3.44個/ μm² ，平均值為2.69個/ ，有的類型穿孔比較少。

秋子梨極軸長為 39.63～45.30μm ，平均值為42.66μm ，赤道軸長為 18.48～22.39μm ，平均值為 20.39μm ，極軸與赤道軸之比為2.09。條脊寬為 0.16～0.21μm ，平均值為 0.18μm ，條脊距為 0.12～0.18μm ， 0.15μm 。穿孔徑為 0.15～ 0.23μm ，平均值為 0.18μm ，穿孔頻率為 1.91～ 2.41個/ ′μm² ，平均值為2.16個 ′μm² 。

與杜梨相比，秋子梨的花粉粒與稍大，條脊距較小，條脊寬較窄。赤道面觀多為長橢圓形，極面觀為三角形與杜梨差別較為明顯。砂梨花粉粒的赤道面觀多數為長橢圓形，少數為橢圓形；極面觀相似。白梨花粉粒的赤道面觀與杜梨相似多數為橢圓形；極面觀與杜梨略有區別為鈍三角形。花粉粒較大，花粉粒表面條脊方向與杜梨相似。豆梨花粉粒的赤道面觀多數為長橢圓形或橢圓形；極面觀為三裂圓形。花粉粒較杜梨大，條脊方向與杜梨相似。西洋梨花粉粒的赤道面觀和極面觀與杜梨相似。花粉粒較杜梨相比略大，花粉粒表面條脊方向與杜梨不同，多交叉分枝，或呈回旋狀，穿孔較多較大。

2.4聚類分析

利用花粉粒的極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、極赤比（P/E）、條脊寬、條脊距、穿孔徑和穿孔頻率7個表型性狀數據對不同種的梨屬資源進行聚類分析，結果表明（見圖2），所有資源的相似系數在 0.00～0.14 之間變化，表明聚類結果與種質的親緣關系并不明顯。在coefficientO.11處可將7種種質資源分為5個類群。杜梨與豆梨，白梨與西洋梨在花粉外部表型形態方面相似度較高。

3討論與結論

梨屬植物中不同種和同種不同品種、類型間花粉粒的大小及外部形態均存在著明顯的差異；但是在同一品種、類型間花粉的大小及外部形態是比較穩定一致的。這與姚宜軒和許方[22]的研究結果基本相同。杜梨、豆梨、砂梨、白梨、秋子梨等均是如此，這與徐宏漢[24]等對砂梨品種花粉的鑒定結果也一致。這些形態特征均可作為梨屬植物的分類、演化和鑒別其品種、類型的重要依據。其中，豆梨屬于比較原始的種[25]。1990年，姚宜軒的研究表明豆梨的花粉外壁紋路比較順暢多呈直線狀，條脊較窄，穿孔較少且花粉粒較小[22]。而在本研究當中，豆梨的花粉粒較之前的研究相比偏大，產生這個結果的原因推測可能是：在本研究當中，只針對豆梨的一個品種、類型進行了觀察測量，由于數據量不足推測可能產生不同結果。可能存在地域差異，不同地方種植的同一種或品種、類型間可能存在差異。由于姚宜軒的研究與本研究相隔26年，其間豆梨品種間可能發生了一定程度上的進化、演變。在本研究當中，杜梨、白梨、砂梨、西洋梨均與姚宜軒和許方[22]在1990年對梨屬植物花粉圖譜的描述一致，在本研究中縮小了杜梨、白梨、砂梨、西洋梨花粉粒大小的范圍，使其對花粉粒大小的描述更加準確詳細，分類更加明確準確。聚類分析結果顯示，整體相似系數較低說明梨屬植物在不斷演化的過程中存在較多的遺傳變異。我們認為梨屬植物資源豐富，基因型復雜，花粉粒形態的種內種間異同有待進一步的研究。

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