玫瑰香葡萄種子發(fā)育過程中氨基酸含量分析

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A

杜菁榮，嚴靜，郭偉琛，葛亞琪，張朝紅（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌712100）

Analysis Amino Acid Content during Seed Development Muscat Hamburg Grape

DU Yaqi， ZHANG （College ）

Abstract：【Objective】To reveal the dynamic changes in amino acid content in grape seeds and provide theoretical support fortheir subsequent procesing andutilization.【Methods】Amino acidcontent andnutritional valuechanges inseeds Muscat Hamburg grapes from the grape germplasm repository at Northwest University in Yanglingwere investigatedfrom10 to 45daysafterfullbloom using HPLC-MS technology.Principal Component Analysis（PCA）was employed forcomparativeanalysis.【Results】Atotal15amino acids weredetected，with Gln，Lys，Asn，Glu，andAlabeing the mostabundant，while Ieand Pro were presentinlowerconcentrations.Most aminoacid contents fell within thetypicalrange for winegrapes.Compared totheFAO/WHOaminoacid prile，sixesential amino acids were identified，withLeubeing the firstlimitingaminoacid.Theaminoacidcompositioninmostdevelopmentalstagescloselymatchedtheideal prile，ndicating high nutritional value. 【Conclusion】Muscat Hamburg grape seds have potentialasaraw material for health products and as a resource for winemaking，fering new possibilities for the diversification health and wine products.

Key words：Muscat Hamburg grape；seeds；amino acid content;nutritional value

葡萄（VitisviniferaL.）為雙子葉落葉藤本漿果植物，是重要的世界性水果，不僅美味可口而且具有高保健功能[1]。其保健功能包括抗炎、緩解過敏、防癌抗癌、利膽、預(yù)防心腦血管病、促進腎臟功能、延緩衰老等[2]。除鮮食葡萄以外，葡萄酒也具有豐富的營養(yǎng)保健作用，適量飲用對身體健康有益，如抑制冠心病、動脈粥樣硬化、消除自由基等作用[3]。葡萄由果汁（ 48% ）、果皮（ 26% 、果肉（ 17% ）和葡萄種子（ 10% ）4個部位組成，葡萄的各個部位對其保健作用的影響程度不同，其中葡萄種子的影響最大，其次是果肉、果汁和果皮[4-5]，國內(nèi)外研究表面，葡萄種子中含有多種氨基酸且貢獻了成熟葡萄中的 50% 左右的氨基酸。目前已知組成人體內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸有26種，其中人體自身只能合成一部分，有8種氨基酸人體無法合成，被稱作“必需氨基酸”，而在葡萄以及葡萄酒中均含有這8種“必需氨基酸”，其中Val、Met、Arg等的含量明顯高于中國居民膳食營養(yǎng)素建議的服用量[6。因此研究葡萄種子的氨基酸組分及含量，對促進新組織的形成、維持機體內(nèi)氨的平衡、調(diào)節(jié)機體代謝功能以及預(yù)防和治療人體因缺乏某種氫基酸而引起的疾病具有重要作用。

隨著生活質(zhì)量的持續(xù)提升，消費者的飲食習慣發(fā)生了顯著變化，再加上葡萄無核化技術(shù)的迅猛進步，有核葡萄中的葡萄種子在經(jīng)濟效益及應(yīng)用價值方面常常被大眾所忽視。為了更全面地挖掘和利用葡萄種子中的氨基酸資源，本研究采用了高效液相色譜一質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)，深人探究了玫瑰香葡萄種子在不同發(fā)育階段氨基酸含量的動態(tài)變化，以期為葡萄種子在不同發(fā)育時期的氨基酸水平變化提供科學依據(jù)，從而進一步豐富葡萄種子氨基酸資源的利用方式，提升其在食品、保健品及醫(yī)藥等領(lǐng)域的潛在價值。

1材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗于2019年進行，試驗材料為西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃的玫瑰香葡萄品種。開花前后對玫瑰香葡萄花穗進行掛牌，在盛花期前去掉已開放的花蕾，套袋，第3天去掉未開放的花蕾。在其盛花后 15～45d 時采集花穗，隨后立即放人冰盒，在冰上剝離種子，每5d一次，用液氮速凍后放進一 80^°C 冰箱中備用。

氨基酸混合標樣（美國Sigma-Aldrich公司）；L一天冬氨酸、L一谷氨酰胺標樣（上海源葉）；娃哈哈水；甲醇和甲酸（HPLC級，美國天地公司）；乙醇和鹽酸（國產(chǎn)分析純）。

ABQTRAP5500高效液相色譜一質(zhì)譜系統(tǒng)，配二極管列檢測器和三重四極桿質(zhì)譜檢測器（美國ABSCIEX公司）。

1. 2 試驗方法

1.2.1標準品配置和氨基酸提取

氨基酸的提取參考Feng等7]的方法，在液氮研磨各時期各品種葡萄種子，稱取 200mg ，加人 1mL50% 的乙醇水溶液（含 0.1mol/L 的HCI），震蕩混勻， 12000r/min 離心 10min 0.22μm 濾頭過濾上清，稀釋20倍后上機檢測，進行HPLC-MS分析。將氨基酸標準品用 0.1M 的HCl加熱 50^°C 溶解 15min ，用甲醇稀釋成156.25 pmol/L、312.5 pmol/L、625 pmol/L、1.25nmol/L 和 2.5nmol/L 上機檢測作外標，通過外標法計算各樣品游離氨基酸含量，每個樣品3個生物學重復(fù)。

1. 2.2 HPLC-MS測定條件

色譜條件：島津公司IntertsilOSD—4C18色譜柱（ 150mm×3.0mm ，填料粒徑 3.5μm） ，流速 0.3mL/min ，溫度 25^°C 。流動相A： 0.5% 甲酸水、流動相B：甲醇和娃哈哈水超聲 10min ，流動相洗脫梯度見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子模式，離子化電壓 5.5kV ，離子源TurboIonSpray探針的加熱器氣體溫度為 600^°C ，噴霧氣（GS1）和輔助加熱氣（GS2）為 60psi ，氣簾氣為 采用多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描方法對氨基酸進行碎裂和掃描。每種氨基酸的具體測定參數(shù)如表2所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel11.1軟件進行統(tǒng)計與整理，結(jié)果以平均值 ± 標準差（ Mean±SD） 表示；采用SPSS26.0及Origin2022統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1玫瑰香葡萄發(fā)育種子中氨基酸總量及組分分析

為探究玫瑰香葡萄種子發(fā)育過程中氨基酸代謝水平的變化，本實驗通過HPLC-MS技術(shù)測定玫瑰香葡萄種子中主要氨基酸含量。各個氨基酸標準曲線的相關(guān)系數(shù) 。結(jié)果表明，共檢測到含有15種氨基酸，包括脂肪族氨基酸11種，芳香類氨基酸2種及雜環(huán)氨基酸2種。由表3可知，總氨基酸含量為 1035.45～2493.9μg/g ，總體呈現(xiàn)先升后降趨勢，并在開花后35d時達到最高。在15 種氨基酸中，玫瑰香葡萄種子中Gln、Lys、Asn、Glu、Ala 含量較高，分別是 3154.26μg/g 、2684.35 μg/g 、 660.34μg/g 、659.17 μg/g 、（204號 625.40μg/g 。Ile、Pro含量相對較低，分別為199.35μg/g ， 130.90μg/g 。

2.2玫瑰香葡萄發(fā)育種子中不同側(cè)鏈基團氨基酸含量變化分析

對玫瑰香葡萄發(fā)育種子中不同側(cè)鏈基團氨基酸含量變化進行分析，如圖1所示，玫瑰香種子Ala含量隨著種子發(fā)育呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。Ala含量從25d開始急劇上升，在35d時達到最大值，然后從 35～45 d開始下降；Val含量和Leu含量變化趨勢一致，在 30～35d 呈顯著上升，然后趨于平緩，4Od開始下降。Ile含量則隨種子發(fā)育變化較為平緩，無明顯顯著增加或急劇減少現(xiàn)象。Ser含量和Thr含量變化較為一致，在 15～30（ 1時均呈現(xiàn)略下降趨勢，在 30～35 d時急劇升高并達到最大值，后降低，并在 40～45d 急劇下降。Gln含量較高且變化幅度最大，Asn含量在 25d 時有顯著峰值，Asp含量和Glu含量均較為平緩。芳香族氨基酸包括Phe和Tyr，二者含量趨勢相對一致，在 15～30 d總體呈下降趨勢，后急劇升高，分別在35、40d達到最大值，而后又下降。雜環(huán)族氨基酸包括His和Pro，二者差異較大，His含量在30d前波動不定，在 30～35 d呈急劇上升并達到最大值，而后又逐漸降低。Pro含量保持隨種子發(fā)育過程中變化較平緩。

2.3玫瑰香發(fā)育種子中必需氨基酸含量與FAO/ WHO氨基酸模式比較

由表4可知，在玫瑰香葡萄種子中共檢測到6種必需氨基酸，分別為Leu、Ile、Lys、Thr、Val、Phe、Tyr。在其發(fā)育過程中，開花后 25d 內(nèi)差異不顯著，在花后 30～45d 氨基酸含量發(fā)生顯著變化，花后35d必需氨基酸含量達到最高，隨后呈下降趨勢。玫瑰香葡萄種子在發(fā)育過程中，盛花后35d前，除Lys含量始終高于模式譜標準外，其余必需氨基酸含量均未達到模式譜標準，其中

Ile含量在盛花后35d前呈現(xiàn)下降趨勢，而后又逐漸上升，至盛花后 45d 達到并稍高于模式譜標準。Leu在盛花后35d和45d高于模式譜標準，Ile在盛花后15d和 45d 高于模式譜標準，Thr在35d和40d高于模式譜標準，Val在 35d 和40d高于模式譜標準， Phe⁺Tyr 在 15d 、25d、35d、40d和45d高于模式譜標準，且根據(jù)差值，可確定Leu是玫瑰香種子第一限制氨基酸。

2.4玫瑰香發(fā)育種子中必需氨基酸比例與FAO/WHO必需氨基酸模式比較

由表5可知，玫瑰香葡萄發(fā)育種子中各時期必需氨基酸比例與FAO/WHO必需氨基酸模式比較，其E/T與 E/N 值在大部分發(fā)育階段比值均接近或高于FAO/WHO提出的必需氨基酸理想模式。這表明在大部分發(fā)育階段，玫瑰香葡萄種子的氨基酸組成與FAO/WHO推薦的理想模式較為一致，具有較高的營養(yǎng)價值。

2.5玫瑰香發(fā)育種子中氨基酸成分的主成分分析

使用SPSS.26對玫瑰香發(fā)育種子種的15種氨基酸成分進行了主成分分析，以提供降維的概觀可視化[8]。結(jié)果表明，前4個主成分特征值大于1，且累計貢獻值已達到 90.859% ，基本上反映了玫瑰香發(fā)育種子15種氨基酸的綜合信息。由表6可知，第一主成分的特征值為9.533，能解釋玫瑰香種子不同發(fā)育時期氨基酸含量總變異的63.555% ，第二主成分占總變異的 12.608% ，第三主成分占總變異的 7.542% ，第四主成分占總變異的 7.155% 。

對于玫瑰香葡萄種子在不同生長時期分布較為分散。如圖2所示，花后15d、20d、 25d 、30d的種子分布在第一處成分的負方向，花后30d的種子中天東門酰胺的含量較高；在花后35d、40d，主要分布在第一主成分及第二主成分的正方向，葡萄種子中的Thr、Val、Ser、 Gln 、Lys、Ala含量較高；玫瑰香葡萄花后 45d ，主要分布在第一主成分的正方向和第二主成分的負方向，種子中Leu、His、Tyr、Phe、Pro的含量較高。

3討論

本試驗在玫瑰香葡萄發(fā)育種子中共檢測到15種氨基酸成分，涵蓋了組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中的絕大部分，表明玫瑰香種子中的氨基酸種類較為齊全。其中Lys作為一種人體必需氨基酸，無法由人體自身合成，必須通過食物攝取以滿足需求，且Lys在機體內(nèi)具有多種重要功能，包括參與蛋白質(zhì)合成、能量代謝過程以及促進礦物質(zhì)吸收等，這些功能使其在營養(yǎng)學上具有重要意義[9]。研究結(jié)果表明，玫瑰香葡萄發(fā)育種子中Lys等人體限制性氨基酸的含量較高，顯示出其氨基酸組成具有較高的營養(yǎng)價值[10]。此外，玫瑰香葡萄種子中必需氨基酸與氨基酸總量（EAA/TAA）的比例平均值為 38.40% ，必需氨基酸與非必需氨基酸（EAA/NEAA）的比例平均值為 63.05% ，相較于菠蘿蜜[11]、柑橘[12]、甜柿[13]等其他常見水果，其氨基酸組成比例更為優(yōu)越。總體來看，玫瑰香葡萄種子的氨基酸組成較為均衡合理，接近FAO/WHO提出的理想蛋白標準，表明其營養(yǎng)價值較高，適合用于食品、保健品等領(lǐng)域的加工開發(fā)[14]

根據(jù)國內(nèi)外研究，釀酒葡萄品種的葡萄種子中氨基酸的主要組分包括Pro、Gln、Glu、Ala、Asp、Leu、Ile等。其中，Pro的含量通常在500～2000μg/g ，Gln的含量在 300～1000μg/g Glu的含量在 200～800μg/g ，Ala的含量在 100～ 500μg/g ，Asp 的含量在 100～500μg/g ，而Leu和Ile的含量則通常在 50～200μg/g^[15] 。本研究結(jié)果顯示，在 35d 時，Ala、Leu和Gln的含量均在上述通常范圍內(nèi)，而其他氨基酸（除 Pro 外）的含量則略低，大約比通常范圍低 20% 左右。基于這些研究結(jié)果和市場需求，玫瑰香葡萄品種不僅適合鮮食，還可用于釀酒，以滿足多樣化的市場應(yīng)用需求。

本實驗對玫瑰香葡萄發(fā)育種子中氨基酸含量的動態(tài)變化進行了系統(tǒng)監(jiān)測，揭示了其在不同發(fā)育階段的營養(yǎng)成分變化規(guī)律。研究結(jié)果顯示，大部分氨基酸在發(fā)育過程中呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，且大部分氨基酸在35d達到高峰。此外，本研究還確定了Leu為玫瑰香葡萄種子的第一限制氨基酸。Leu作為人體必需氨基酸之一，在蛋白質(zhì)合成、能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用[16]。因此，在未來的葡萄育種和栽培實踐中，可以考慮通過基因工程[17]、營養(yǎng)調(diào)控[18]等手段來提高Leu的含量，從而進一步提升葡萄種子的整體營養(yǎng)價值。

本實驗僅選取了陜西楊陵西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃的玫瑰香品種作為研究對象，無法全面代表全國各地的玫瑰香品種。因此，未來的研究應(yīng)進一步擴大采樣范圍，深人探討不同氣候條件和栽培模式對玫瑰香葡萄氨基酸含量的影響，以期為玫瑰香葡萄的合理評價提供更為全面和科學的依據(jù)。

4結(jié)論

試驗結(jié)果表明玫瑰香葡萄種子不僅可作為藥品和保健品的潛在原料，其富含的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)還使其成為一種新型植物蛋白源，有助于豐富現(xiàn)有的植物蛋白資源，提供更高的營養(yǎng)成分，并在與動物蛋白的結(jié)合中發(fā)揮互補作用。此外，玫瑰香葡萄種子的氨基酸組分與釀酒葡萄的標準氨基酸組分相匹配，具備作為釀酒原料的潛力，從而為釀酒產(chǎn)品的多樣化發(fā)展提供了新的可能性。

參考文獻

[1]IANNONEM，MARER，PAOLINOD，etal.Characteriza-tion and in vitro anticancer properties chitosan-microencapsu-latedflavan ?-3- ols-rich grape seed extracts[J]. InternationalJournal Biological Macromolecules，2017，104（A）：1039-1045.

[2]陳樹俊．葡萄的營養(yǎng)與保健[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2008（10）：18-19.

[3]GIOVINAZZO G，GRIECO F. Functional Properties GrapeandWinePolyphenols[J].PlantFoods.2015，7O：454-462.

[4]YOKOTSUKAK，F(xiàn)UKUI M. Changes in nitrogen compoundsin berries six grape cultivars during ripening over two years[J].American Journal Enologyand Viticulture，2oo2，53（1）：69-77.

[5]LAMIKANRA O，KASSA A K. Changesin the free aminoacid compositionwith maturity theNoblecultivar Vitisro-tundifolia Michx.grape[J]. Journal Agricultural and FoodChemistry，1999，47（12）：4837-4841.

[6]高堯來，溫其標，張福艷.葡萄酒中的多酚類物質(zhì)及其保健功能[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（8）：68-72.

[7]FENGF，LIM，MAF，etal.Effectslocationwithin thetreecanopyon carbohydrates，organicacids，amino acidsandphenolic compoundsin the fruit peel and flesh from three apple（Malus x domestica）cultivars.[J].Horticulture research，2014，1（1）：14019.

[8]M. AVANZA，B. ACEVEDO，M.CHAVES，etal. Nutri-tional and anti-nutritional components four cowpea varietiesunder thermal treatments：Principal component analysis[J].LWT-Food Science and Technology，2013，51（1）：148-157.

[9］李俊霖，郭傳莊，王松江，等.Lys的生物學功能及其在飼料中的應(yīng)用[J].中國飼料，2020（21）：63-66.

[10］高海生，肖月娟，劉秀鳳，等．毛櫻桃果實營養(yǎng)成分分析研究[J].食品科學，2002（6）：110-112.

[11］王穎倩，朱科學，張彥軍，等．不同品系菠蘿蜜化學成分比較與營養(yǎng)綜合評價[J]．熱帶農(nóng)業(yè)科學，2017，37（8）：46-53.

[12］何莎莎.不同類型柑橘果實氨基酸組成分析及“三度\"法營養(yǎng)價值評價[D].重慶：西南大學，2018.

[13］夏宏義，楊勇，張永芳，等．陽豐甜柿果實營養(yǎng)成分和氨基酸組分分析[J]：黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2015（1）：116-121.

[14］顏孫安，史夢竹，林香信，等．基于主成分與聚類分析不同品種鮮食葡萄的氨基酸品質(zhì)評價[J].食品工業(yè)科技，2022，43（6）：372-379.

[15]TANGOLARS，TURANM，TANGOLARS，etal.Evalua-tion amino acid contentsand enzyme activities seeds fromSemillon and Carignane wine grape cultivars grown under dif-ferentirrigation conditions[J].Scientia Horticulturae，2019，251181-251188.

[16］呂子全，郭非凡.內(nèi)源性代謝分子——亮氨酸調(diào)節(jié)機體生理功能[J].生理科學進展，2012，43（5）：337-340.

[17]］劉升，羅云波，黃昆侖．營養(yǎng)改良型轉(zhuǎn)基因植物研究進展[J].核農(nóng)學報，2015，29（2）：337-343.

[18］胡文詩.鉀營養(yǎng)調(diào)控冬油菜葉片光合面積和光合速率的機制[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2021.

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