獨腳金內酯對葡萄夏芽萌發和相關基因表達的影響

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A

Effects of Strigolactones on The Germination of Grape Summer Buds and The Expression of Related Genes

GE Yaqi，LIU Meng，DU Jingrong，WANG Yang，ZHANG Chaohong （l. College of Horticulture，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi 7121Oo，China; 2.Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 65O224，China）

Abstract：【Objective】Theefects of strigolactone on the germinationof grape summer budsand the expressionof strigolactone synthesis pathwayandsignal ransduction genes inbuds werestudied，which providedatheoreticalbasisfortherational useof strigolactone anditsinhibitionofsummer bud germinationin grape production.【Methods】Taking‘Liaofeng’grape as test material，the germination number，lengthand stem diameterof summer buds were investigated byapplying diferentconcentrations of strigolactone analogue GR24，andtheexpressionof synthetic genes inbuds was determined.【Results】Exoge nous GR24 hadasignificant inhibitory effecton the germinationof grapesummerbuds.With the increaseof hormoneconcentration，theinhibition time wasprolonged.However，the efect on the growthof secondary shoots after germination was not obvious.After GR24 treatment，the expresion levels of VvD27，VvMAX1，VvCDD7andVvCDD8decreased withthe increaseof concentrationThe expresion levels of monostearin signal transduction genes VvMAX2andVvDl4 increased with theincreaseof treatmentconcentration.【Conclusion】Theresultsshowed that strigolactonecouldefectivelyinhibitthegerination of summerbuds.Itmayafectthegermination andgrowthof summerbudsbyaecting the synthesisand signal transduction of strigolactone in grape summer buds.

Key words： grape;strigolactone;summer bud; germination rate； gene expression

葡萄的栽培歷史悠久，是世界范圍的重要果樹[]。葡萄葉腋間有冬芽和夏芽，冬芽形成后就進入休眠，正常情況下當年不萌發。夏芽無休眠習性，形成后就很快萌發形成副梢[2]。大量副梢的形成，容易使枝葉郁閉，通風透光不良，引起病害發生。同時，大量副梢使營養生長過旺，消耗較多樹體營養，抑制開花坐果和果實膨大，影響葡萄當年的果實產量及質量，也嚴重影響冬芽的花芽分化[3]。因此，在葡萄的栽培過程中副梢處理是一項重要的管理技術。鮮食葡萄副梢處理一般方法采用結果部位以下節位全部人工剪除、結果部位以上留1～3 葉后反復摘心，此操作需要多次進行操作，耗時、費工和成本高，這是目前葡萄栽培中亟需解決的一個重要生產問題。

葡萄夏芽只有萌發后才能形成分枝、副梢，若有外源物質可抑制夏芽的萌發，既可減少副梢大量生長帶來的營養消耗，也可改善葉幕的通風透光性，使得大量營養流向生殖生長，從而提高果實品質[4]。植物激素是植物體內合成的一類微量信號分子，可調控植物生長發育等各個方面的生命活動，也可調控植物腋芽的生長發育。獨腳金內酯具有抑制植物分枝生長等功能，其抑制作用由獨腳金內酯、細胞分裂素和生長素相互作用產生，但因在植物體內含量低、結構復雜且穩定性差而難以大量獲取[5]。目前人工合成的類似物有GR24、GR5、GR7等，其中GR24結構簡單、穩定性好且生物活性強，主要通過降低植物體內生長素含量來抑制分枝生長[]。GR24產生于植物根部和少部分莖部，向上運輸至腋芽區域發揮作用，已在擬南芥等植物上應用[7-9]。有研究發現草莓體內獨腳金內酯含量少會促進分枝生長，隨著分枝生長莖中合成積累較多獨腳金內酯又會抑制分枝進一步增加[10]。獨腳金內酯還能減緩葉片變黃萎蔫，使幼苗葉肉細胞內細胞器更完整，對促進幼苗生長發育有作用；外源GR24還可促進植物利用光能，提高光合效率等[11-12]。

目前尚無研究報道獨腳金內酯在葡萄夏芽生長中的調控作用，且不同噴施方法和施用濃度對夏芽的抑制效果不同。因此，本研究通過涂抹不同濃度的GR24，觀測葡萄夏芽萌發情況，測定GR24處理后獨角金內酯合成基因的表達量，探究外源GR24對獨腳金內酯合成途徑和信號傳導的影響，為獨腳金內酯抑制葡萄夏芽萌發的方式提供理論依據。

1材料與方法

1.1 供試品種及試驗地概況

試驗于2019年—2020年在陜西省咸陽市楊凌示范區沐陽葡萄專業合作社葡萄園開展，該地坐標為 E108^°10^′ ， N34^°27^′ ，氣候屬于大陸性季風型半濕潤氣候，四季分明，平均無霜期 210d ，年平均氣溫 13.5^°C ，極端最高氣溫 45.0^°C ，極端最低氣溫- -15.1^°C ，年降水量 500mm 左右。以‘遼峰’葡萄為試材，該葡萄于2016年種植，采用簡易避雨棚雙十字“V”型架栽培，南北行向，株行距為1.0m×2.5m ，常規土肥水管理。試驗藥劑為95% GR24（購自楊凌鑫方有限公司）。

1.2 試驗方法

在葡萄開花前1周對葡萄結果枝進行摘心處理，每個結果母枝留一穗果實，花穗以下節位如副稍已萌則全部抹除，在花穗以上的 6～10 節位的葉腋間涂抹不同濃度的GR24。2019年進行預實驗，葡萄未生長側枝的主枝分枝部位涂抹不同濃度的GR24（0， 0.75μmol/L ， 1.5μmol/L ，3 μmol/L，4.5μmol/L） ，發現其對夏芽萌發的抑制效果不明顯。2020年將濃度擴大10倍，分別為0（CK），7.5μmol/L （P1）， 15μmol/L （P2）， 30μmol/L （P3）， 45μmol/L （P4），用少量的丙酮溶解后再用蒸餾水定容，每個處理濃度加入 5μL 表面活性劑，對照加入與處理等量的丙酮。

取樣：分別在GR24處理后O、 ⁶h 、 24h 、^48h ： 72h 取腋芽及周圍 2mm 的植物組織，用于RNA提取（約 _0.1g） ， 保存備用；同時在處理后每隔 10d 調查腋芽的萌發個數及長度，并在4Od時測量各節位靠近主梢附近的莖粗，每個處理重復5次。

基因表達量測定：總RNA提取及熒光定量PCR：使用Omega公司RNA提取試劑盒提取總RNA，以RNA為模板，使用天根公司反轉錄試劑盒合成cDNA， 保存，根據半定量PCR引物設計原則，使用Primer5.O軟件設計引物（見表1），在陜西擎科生物科技公司合成。

1.3 數據處理方法

采用SPSS26.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1外源GR24處理對葡萄夏芽萌發的影響

涂抹GR24對葡萄夏芽的萌發有明顯的抑制作用（見表2）。試驗發現處理后腋芽在第7d到第8d開始萌發，處理后 10d ，高節位的萌發率相比低一些，對照第 6～10 節位腋芽萌發率平均在76% 左右，處理后萌芽率明顯降低，最低僅 14% 隨GR24濃度增加，抑制效果明顯增加。處理 20d 時對照夏芽全部萌發，P1處理萌發 59.96%～ 69.74% ，P4處理的萌發數均低于 60% ；處理30d 時P1處理的6、7節位腋芽已經全部萌發，P2、P3、P4處理下腋芽的萌發數都在 90% 左右；處理 40d 時各處理下不同節位的的腋芽全部萌發。

2.2外源GR24處理對各節位副梢基部莖粗的影響

由于試驗中各處理和不同節位副梢萌發時間差異，加之葡萄新梢無頂芽在生長季連續生長的特性，試驗采用對萌發后副稍的第3片葉進行摘心，在處理50d后一次性測定副梢基部粗度，以此來代表GR24處理對副梢生長的影響（見表3）。葡萄第8、9、10節位副梢的莖粗之間無顯著差異，第6、7節位副梢莖粗有較小的差異。試驗說明GR24處理對萌發后葡萄副梢生長影響較小。

2.3外源GR24處理對夏芽相關基因表達的影響

不同濃度GR24處理后，基因 $V _ { ? ＼boldsymbol ? v ? ? } | _ { 1 4 }$ 的表達量有很大的差異（見圖1）。基因 V_vD14 的表達量在 45μmol/L ， 30μmol/L 和 15μmol/L 的濃度處理后均在 內達到最高，下降后在 24h 又上升后回落， 15μmol/L 處理后在 ⁶h 升至最高，7.5μmol/L 處理的表達趨勢為先上升后下降，在 達到最高，對照處理的表達量在 0～12h 內呈現下降趨勢，在 24h 回升后又開始下降。

不同濃度GR24處理后，基因 的表達量有很大的差異（見圖2），基因 V//27 的表達量在 45μmol/L 的濃度處理 ⁶h 之后表達穩定，30μmol/L 處理在 0～24h 內的表達量穩定，在^48h 迅速上升， 15μmol/L 處理在0、 ^48h 表達量最高， 6～24h 之內變化不大。

不同濃度GR24處理后，基因MAX1的表達量有很大的差異（見圖3），基因 MAX1 的表達量在45μmol/L 和 30μmol/L 處理在 0～48h 內表達量都不高，處于平穩水平， 15μmol/L 處理在 內為下降趨勢，之后在 12h 上升，之后回落，對照處理在6～48h 內表達量降低，處于較低的水平。

不同濃度GR24處理后，基因 VvMAX2 的表達量有較大的差異（見圖4），基因 VvMAX2 的表達量在 45μmol/L 處理表達趨勢為先上升后下降再上升，在 ^48h 時表達量達到最高， 7.5μmol/L ，15μmol/L 處理在 內表達量達到最高，之后迅速下降，對照處理表達量有升高，但趨勢不明顯。

不同濃度GR24處理后，基因 VvD14 的表達量有明顯差異（見圖5、6），基因 VvCDD7 的表達量在 45μmol/L 處理的表達趨勢先上升后下降，在 ^12h 表達量達到最高， 7.5μmol/L 的處理在6～24h 表達量下降，之后在 ^48h 達到最高；各處理 VvCDD8 基因在 12h 內表達量上升， 24h 表達量迅速下降至最低， ^48h 又有上升趨勢。

3討論

多次副梢的萌發消耗了葡萄光合作用積累的營養，從而影響葡萄的營養生長，甚至生殖生長，對果實品質也有一定的影響作用[13-14]。獨角金內酯自從被發現可以抑制腋芽、分枝生長后，在研究上越來越受到關注和重視。本試驗發現，外源GR24對葡萄副稍的萌發有抑制作用，且不同的濃度抑制的時間長短不同，低濃度的抑制時間短，高濃度抑制時間長，其中 濃度抑制時間最長，但到4Od時也已經全部萌發，因此，GR24的抑制萌發只能延后萌發，對最終萌發率影響不大。但如果進一步加大處理濃度，是否能將夏芽推遲到秋季以后萌發，需要進一步研究，此操作在生產中無須再次進行副梢修剪處理，減少葡萄生產用工量。由于試驗各處理和不同節位副梢萌發時間差異，加之葡萄新梢無頂芽在生長季連續生長特性，GR24處理對副梢長度影響不容易確定，本研究以副梢粗度來代表GR24處理對副梢生長的影響，試驗發現對副稍粗度影響較小。因此本研究初步說明GR24處理影響副梢萌發時間，而對萌發后副梢生長影響不明顯。

研究表明，獨腳金內酯對腋芽萌發的影響受到與其合成和傳導途徑相關基因的調控，從而影響腋芽的生長[15]，葡萄中獨角金內酯合成相關基因有V_vD14 和 VvMAX2 ， V_vD14 可以通過與D3蛋白形成復合體來與獨角金內酯結合發揮作用，以達到抑制分枝的作用[16-17]，而獨角金內酯在發揮作用時需要被識別和釋放，D14和MAX2蛋白互作，獨角金內酯的信號主要依賴這一過程進行傳遞[18-20]。本試驗 $V _ { ? ＼boldsymbol ? v ? ? } | _ { 1 4 }$ 在外源GR24處理后 ⁶h 基因表達量達到最高，相比對照有明顯的上升，除45μmol/L 基因表達量隨著濃度的提升而增高，而VvMAX2 在處理后 ^48h 才明顯發揮作用，隨著濃度增高效果更加顯著，本試驗的基因調控途徑與之相似。

研究發現， D27 、MAX1、CDD7、CDD8均是獨角金內酯合成相關基因， D27 基因在MAX1基因的上游途徑發揮作用[21-24]， CCD7 和 CCD8主要在植物細胞質體內完成獨角金內酯的合成[25-26]，在黃瓜中研究發現CCD7基因在根中的表達量明顯高于多分枝黃瓜中的表達[27]，本試驗中，GR24處理后 和 VvMAX2 在 ⁶h 腋芽內基因表達量才開始顯著高于對照，但隨著濃度增高到最大，基因的表達量并未增強， VvCDD8 在處理后 6h 處理組基因表達含量上升，在 ^12h 達到最高， 24h 表達水平降低，甚至低于對照處理，且高濃度處理對表達量的影響并不明顯，這可能是由于外源GR24的進入，導致植物組織獨角金內酯含量突然升高，從而負反饋于獨角金內酯的合成基因，表達量表現為下降。

4結論

外源GR24對葡萄腋芽的萌發有明顯的抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯，但作用時間有限；GR24處理后獨角金內酯合成基因 V_ζD27"、VuMAX1、VuCDD7、VuCDD8的表達量隨著濃度的增高出現降低的現象，這可能是植物體內獨腳金內酯含量突然上升，對相關合成基因的負調節，而獨角金內酯信號轉導基因 VvMAX2 ，VuD14隨著處理濃度的增加表達量呈上升為趨勢，說明這兩個基因對腋芽的萌發有抑制作用。

參考文獻

[1]段長青，劉崇懷，劉鳳之，等．新中國果樹科學研究70年葡萄[J]．果樹學報，2019，36（10）：1292-1301.

［2］鄭婷，張克坤，張培安，等．葡萄營養生長與生殖生長間的轉變研究進展[J].植物生理學報，2020，56（7）：1361-1372.

[3]王寶增，安康.植物頂端優勢調控研究概述[J].生物學教學，2020，45（3）：2-4.

[4]林云弟，高靜，韓霞，等．現代桃園省力化栽培品種與關鍵性技術探討[J]．落葉果樹，2022，54（4）：5-8.

[5］陳虞超，鞏鐳，張麗，等．新型植物激素獨腳金內酯的研究進展[J].中國農學通報，2015，31（24）：157-162.

[6］吳轉娣，胡鑫，昝逢剛，等．獨腳金內酯的生物合成及其調控[J].中國農業大學學報，2020，25（12）：97-110.

[7]GOMEZ-ROLDAN V， FERMAS S， PHILIP BB. Strigolactoneinhibition of shootbranching[J].Nature，2008，455（7210）：189-194.

[8] HU ZY，YAN HF，YANG JH，et al. Strigolactones Nega-tivelyRegulate Mesocotyl Elongation in Rice duringGermina-tion and Growth in Darkness[1].Plant and Cell Physiology，2010，51（7）：1136-1142.

[9］崔紅米，曹學偉，王建軍，等．外源GR24 對不結球白菜腋芽生長的影響[J].南京農業大學學報，2016，39（3）：366-372.

[10］胡盼盼，張香粉，趙霞，等．草莓新莖分枝與獨腳金內酯的關系[J].果樹學報，2019，36（5）：578-589.

[11］王晶.獨腳金內酯對番茄側枝生長發育的影響[D].保定：河北農業大學．2015.

[12]UMEHARAM，HANADAA，YOSHIDAS，etal. Inhibi-tion of shoot branching by new terpenoid plant hormones[J].Nature，2008，455（7210）：195-200.

[13］趙小瓊，姜燕婷，楊昆，等．獨腳金內酯及其抑制劑對紅花石蒜小鱗莖發育的影響[J]．貴州農業科學，2024，52（5）：24-29.

[14］張志霞，包小琴，牛敏，等．獨角金內酯的研究進展及其在果樹中的應用展望[J].農村經濟與科技，2024，35（5）：18-21.

[15］曹藝穎，陳虞超，郭生虎，等．獨腳金內酯研究進展及其在藥用植物的應用展望[J].中國中藥雜志，2023，48（12）：3132-3139.

[16］王原秀，范吳蔚，田慧源，等.獨腳金內酯對煙草腋芽和對應節位葉片糖代謝及其相關酶基因表達的影響[J].植物生理學報，2024，60（3）：495-506.

[17]ZHUOM，ZLA，LICA.Transcriptome analysisrevealedhormone signaling response of grapevine buds to strigolactones[J].Scientia Horticulturae，2021，283.

[18]MARZEC M，GRUSZKA D，TYLEC P，et al. Identificationand functional analysis of the HvDl4 gene involved in strigo-lactone signaling in Hordeum vulgare[J]. Physiologia Planta-rum，2016，158（3）：341-355.

[19］蔣成娣．萱草獨腳金內酯相關基因 HfD14、HfD27 的克隆與表達分析[D].上海：上海應用技術大學，2022.

[20］李國防.蘋果MAX2基因介導獨腳金內酯信號調控腋芽萌發的功能研究[D].榆林：西北農林科技大學.2018.

[21］田慧源，唐博希，王原秀，等．外源獨腳金內酯對煙草腋芽伸長及獨腳金內酯代謝途徑相關基因表達的影響[J].亞熱帶植物科學，2023，52（5）：369-380.