1株廣西紅樹(shù)林放線菌Streptomycessp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物及抗菌活性研究

Study on the secondary metabolites and antimicrobial activity of a Streptomyces sp. isolated from Guangxi mangrove

YangShuyul，Xiao Yang2， Zhang Tangjie2，Liu Mi² ，Liu Hongcun2，Yang Lifang2，andJiang Mingguo1

（1GuangxiKeyLboatoryoolyaccaideaterialsddifcatio，holofrineiencsadtecologyGagiinzu

University8;lofstlgagiuUetKeboatyt

andEnginergofFrestrodctsStateEtncfisCommsioangxiKeyLboratoryofemistrndEngieegoot

Products，GuangxiCollborativovatioCenterforhemstryandEgieeringofForestProuctsducationepartmentofGuagxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530006）

Abstract Objective To obtain more compounds with significant biological activity，this study investigated the secondary metabolitesand antimicrobial propertiesofa strain of Streptomyces sp. GY-10129，derived from the rhizosphere soil of mangrove Acanthus ilicifolius L.in Guangxi.MethodsTechniques such as silica gel column chromatography， high-performance liquid chromatography，and semi-preparative liquid chromatography were employed to isolate the secondary metabolites of this strain; spectroscopic methods were utilized for the structural identificationof theisolatedcompounds，and thefilterpaper method wasused toasesstheantimicrobialactivityof the individualcompounds.ResultsA total of 10 individualcompounds were successfull isolated from the fermentation products of Streptomyces sp. GY-10129，including 5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid（1）， phevalin（2）， 4-hydroxybenzaldehyde（3），germicidinA（4），indole-3-acetamide（5），6-methoxy--（-phenylethyl）chromone（6），tras3，4，5-trimethoxy- .4^′ -isopentenyloxyl-stilbene（7），1，3-benzodioxole derivative（8）， cycloheximide（9），and 2-methyl4[3H] quinazolinone（10）.compounds1，6and7were discovered in this actinomycete for the first time.The results of biologicalactivitytests showedthatcompound1hadastrong inibitory efectonStaphylococcus aureus.Compounds1and 9 showed weak antibacterial activity against Fusarium pseudograminearum. Conclusion The mangrove actinomycete Streptomyces sp. GY-10129 had the potential research value of producing antimicrobial lead compounds.

Key WordsMangroves; Actinomyces; Separationand purification; Secondarymetabolites;Antibacterialactivity

放線菌（Actinomycetes）是一類胞嘧啶和鳥嘌呤含量高的革蘭陽(yáng)性需氧型細(xì)菌[1]，同時(shí)也是產(chǎn)生生物活性物質(zhì)最多的微生物群。目前在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域中使用的約三分之二的抗生素都來(lái)自放線菌，并且這些分子大多來(lái)自于鏈霉菌屬[2]，已經(jīng)從鏈霉屬放線菌中分離得到泰樂(lè)霉素、鏈霉素、紅霉素和各類維生素等一批活性優(yōu)異的藥物[]。放線菌是一座天然產(chǎn)物的寶庫(kù)，展現(xiàn)出了發(fā)掘天然活性產(chǎn)物的卓越潛力[3]。

但是隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌和真菌等對(duì)抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性[4]，抗生素耐藥成為了一個(gè)備受全球關(guān)注的問(wèn)題，面臨重大挑戰(zhàn)，人們對(duì)于新型藥物的需求不斷上升[5-6，因此許多研究員把目光逐漸轉(zhuǎn)向了極端環(huán)境來(lái)源的放線菌，如處于高鹽、高壓和寡營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境的紅樹(shù)林放線菌。紅樹(shù)林是熱帶和溫帶潮間帶地區(qū)生產(chǎn)力高、充滿活力的動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，具有去除海水中的有害雜質(zhì)、存儲(chǔ)碳源、維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和遺傳可變性的功能。與普通的海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)作比較，紅樹(shù)林在強(qiáng)光、強(qiáng)輻射、土壤鹽堿化以及低氧氣含量的作用下，形成了豐富的生態(tài)物種和極其特殊的生理代謝途徑，因而產(chǎn)生獨(dú)特的具有較好活性的次生代謝產(chǎn)物[7-8]。有研究顯示，紅樹(shù)林放線菌可以產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類、生物堿類、倍半萜類、苯并吡喃和環(huán)戊烯酮等具有顯著生物活性和新穎結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[9-10]。Hong等[11]發(fā)現(xiàn)紅樹(shù)林放線菌是大量具有新型結(jié)構(gòu)的抗菌藥物和抗腫瘤藥物的潛在來(lái)源；Yuan等[1]從紅樹(shù)林鏈霉菌Streptomycessp.211726中分離得到7個(gè)新的阿扎霉素類化合物，其生物活性包括廣譜抗菌性和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性；向晨晨[13]從3株紅樹(shù)林鏈霉菌ZFSM1-146、ZFSM1-29和ZFSM1-129中共分離得到15個(gè)單體化合物，每個(gè)單體化合物都具有良好的抗菌作用。由此可見(jiàn)紅樹(shù)林放線菌具有生產(chǎn)抗菌先導(dǎo)化合物的潛在研究?jī)r(jià)值。

本文以廣西茅尾海紅樹(shù)林老鼠根際土壤的鏈霉菌屬放線菌Streptomycessp.GY-10129為研究對(duì)象，利用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)及結(jié)構(gòu)鑒定方法對(duì)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，以期獲得更多具有良好抗菌活性的化合物，為人們從海洋微生物中開(kāi)發(fā)海洋藥物資源奠定基礎(chǔ)。本研究共分離得到10個(gè)化合物，分別為5-hydroxymethylfuran-3-carboxylicacid（1）、phevalin（2）、4-羥基苯甲醛（3）、germicidinA（4）、吲哚-3-乙酰胺（5）、6-methoxy-2-（2-phenylethyl）chromone（6）、Trans-3，4，5-trimethoxy-4'-isopentenyloxyl-stilbene（7）、1，3-benzodioxolederivative（8）、cycloheximide（9）、2-methyl-4[3H]-quinazolinone（10）;并采用濾紙片法對(duì)上述化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。化合物1＼～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來(lái)源和鑒定

菌株Streptomyces sp.GY-10129于2019年采自廣西茅尾海紅樹(shù)林老鼠根際土壤，保藏于廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院菌種庫(kù)。采用Chelex-100[14]的方法對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取，以27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）為通用引物擴(kuò)增菌株16SrRNA基因序列，送至上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序。將所測(cè)得的序列提交至NCBI中BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)（序列號(hào)：PQ553549）進(jìn)行同源對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與Streptomycesdjakartensis（PP456331）的相似度為 99.11% ，結(jié)合該放線菌的菌落形態(tài)，將實(shí)驗(yàn)菌株GY-10129初步鑒定為Streptomycessp.，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。

1.1.2 活性測(cè)試菌株

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis），大腸埃希菌（Escherichiacoli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），白念珠菌（Candidaalbicans），假禾谷鐮刀菌（Fusariumpseudograminearum），小麥冠腐病菌（Fusariumoxysporum），小麥平臍蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）和板栗疫病菌（Cryphonectriaparasitica），均由廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院菌種庫(kù)所提供。

1.1.3培養(yǎng)基

改良高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基：硫酸鎂 0.5g ，磷酸氫二鉀 0.5g ，硝酸鉀 1g ，可溶性淀粉 20g ，硫酸亞鐵0.01g ，氯化鈉 0.5g ，瓊脂 15g ， pH7.3～7.4 。

YIM38#液體培養(yǎng)基：葡萄糖 i_g ，酵母粉 4g ，麥芽糖 2.5g ，復(fù)合維生素 0.005g ，蒸餾水1L， pH7.2 。

312#發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10g ，蛋白肺 5g ，甘油 10g ，酵母粉 2g ，可溶性淀粉 2.5g ，碳酸鈣 3g 蒸餾水 1L ， pH7.3 。

馬鈴薯葡萄糖水：馬鈴薯浸出粉 6g ，葡萄糖 20g pH5.5～5.8 。

LB（Luria-Bertani）肉湯：胰蛋白膝 10g ，酵母浸粉 ?5g ，氯化鈉 10g ， pH7.0～7.2 。

PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉6g， 葡萄糖 20g ，瓊脂 20g ， pH5.5～5.8 。

1.1.4 主要試劑

柱層析硅膠 （10～40μm ，200＼～300目，青島海洋化工廠）、YMCGelODS-A反相色譜硅膠 50μm ，日本YMC公司）、SephadexLH-20葡聚糖凝膠（上海源葉公司）；分析純級(jí)有機(jī)試劑：甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和丙酮等（成都市科隆化學(xué)品公司）；色譜級(jí)有機(jī)試劑：甲醇、乙腈、異丙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；氘代氯仿（批號(hào)：PR-33450，CambridgeIsotopeLaboratories，Inc），氣代二甲基亞砜（批號(hào)：PR-32156，青島騰龍微波科技有限公司）。

1.1.5 主要儀器

ZHJH-C1112B超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造公司），DGL ?1_00B 立式蒸汽滅菌鍋（江蘇登冠醫(yī)療器械公司），ZXSD-B1160生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造公司），F(xiàn)YL-YS-50L恒溫培養(yǎng)箱（北京福意電器公司），TDZS-WS高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司），AgilentInfinityLabLC/MSD質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）、MQZ-632大容量落地式搖床（上海旻泉公司）、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、ME204T電子天平（上海MettlerToledo公司）、SCL-10AVP半制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）、LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津公司）、BruckerAVANCE 400MHz 核磁共振儀（德國(guó)Brucker公司）、Nacalai tesque 5C_18-MS-II 分析型色譜柱 （4.6mm×250mm ， 5μm ，日本YMC公司）、Nacalaitesque 5C₁₈ -MS-II制備型色譜柱 （10mm×250mm ，5μm ，日本YMC公司）。

1.2方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與發(fā)酵

在超凈臺(tái)用無(wú)菌竹簽將甘油管中保藏的菌株Streptomycessp.GY-10129接種到改良高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，于 培養(yǎng)3d得到成熟菌株。將成熟菌株的單一菌落用無(wú)菌竹簽接種到裝有YIM 38^# 液體培養(yǎng)基（ 150mL 的 500mL 錐形瓶中， 28°C ， 180r/min 搖床培養(yǎng)3d（溫度： 28^°C ；轉(zhuǎn)速： 180r/min） 得到種子液。取 50mL 種子液加入到裝有 312^# 發(fā)酵培養(yǎng)基（ 450mL 的2000mL 錐形瓶中， 28°C ， 180r/min 搖床培養(yǎng)11d，一共發(fā)酵得到205L發(fā)酵液。

1.2.2化合物的分離提純

將發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并上層萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到乙酸乙酯粗浸膏共 53.30g， ，用 90% 甲醇水溶液/石油醚（V/V，1：1）對(duì)粗提物進(jìn)行反復(fù)萃取，減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，得到甲醇層萃取物47.81g和石油醚層萃取物 |5.49g_s 。對(duì)甲醇層粗提物進(jìn)行分析，經(jīng)以石油醚-乙酸乙酯（VV，1：0，10：1，8：1，6：1，4：1，2：1，1：1，1：2，0：1）和甲醇為洗脫劑的正相硅膠色譜柱分析，得到26個(gè)組分。收集完組分后，經(jīng)過(guò)薄層層析（TLC）和高效液相色譜（HPLC）綜合分析，合并相似組分。最終，菌株Streptomyces sp.GY-10129粗提物得到了編號(hào)為Fr.1＼～Fr.7的7個(gè)餾分，餾分Fr.1（4.58g）經(jīng)正相柱層析分離 （Φ8.6cm×80cm） ！利用石油醚-乙酸乙酯（V/V，10：1）進(jìn)行洗脫，洗脫體積為 6L ，分3次收集，得到Fr.1.1＼～Fr.1.3共3個(gè)正相柱餾分。餾分 Fr.3（1.75g） 經(jīng)ODS反相色譜柱0 Φ2.5cm×50cm ，以甲醇-水（ V/V ，30：70，40：60，50：50，60：40，70：30，80：20，100：0）為洗脫劑，洗脫體系用量是每個(gè)體系 500mL ，每 173mL 收集1次，共收集3次，得到Fr.3.1＼～Fr.3.16共16個(gè)子餾分。其中 Fr.3.2（17.6mg） 經(jīng)半制備型高效液相色譜（甲醇：水 3.5mL/min） 分離純化得到化合物2（ 10.9mg tR=16.5min）。Fr.3.7（85.4mg）經(jīng)半制備型高效液相色譜（甲醇：水 ：=30：70 ， 3.5mL/min 分離純化得到化合物3 4.5mg ， t_R=13.5min ）。 Fr.3.10（16.8mg 經(jīng)過(guò)半制備型高效液相色譜（甲醇：水 ：=55：45 ， 3.5mL/min） 分離純化得到化合物4 6.7mg ， t_R=14.7min ）。餾分Fr.4（2.52 g）經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1 280mg ，剩下的餾分（2.24g）經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析（正己烷：乙酸乙酯=1：1 進(jìn)一步純化得到化合物 和化合物6（24.7mg） 。餾分Fr.5（6.51g）經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析（甲醇：二氯甲烷 ：=1：2 分離得到Fr.5.1＼～Fr.5.15共15個(gè)組分，其中從Fr.5.1得到化合物7（ 11.4mg） ，從Fr.5.7得到化合物8 9.8mg^? ），從Fr.5.10得到化合物p（23.5mg） 。餾分Fr.6（5.16g）通過(guò)半制備型高效液相色譜（甲醇：水 ：=30：70 ， 3.5mL/min 分離純化得到化合物10（ 15.0mg ， t_R=14.0min） 。

1.2.3 抗菌活性測(cè)試

（1）樣品處理

用二甲基亞砜溶解化合物和陽(yáng)性藥，制成0.2mmolL的樣品，分兩次吸取 5μL 樣品（共 10μL 于已滅菌的6mm 濾紙片上，等待有機(jī)試劑揮干。致病細(xì)菌和致病真菌的陽(yáng)性藥分別為環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）和酮康唑（ketoconazole），空白對(duì)照均為二甲基亞砜。

（2）濾紙片抑菌法實(shí)驗(yàn)[15]

將結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種到LB液體培養(yǎng)基后于搖床 下培養(yǎng) 18h ，將白念珠菌接種到馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基后于搖床 28°C 下培養(yǎng) 24h ，觀察是否渾濁。將已滅菌的LB和PDA固體培養(yǎng)基在超凈臺(tái)內(nèi)倒平板，凝固后使用。吸取 100μL 種子液分別于對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌棉簽將其涂布均勻后把已經(jīng)干燥的濾紙片分別置于已涂布的平板中，使其緊貼培養(yǎng)基表面。1個(gè)培養(yǎng)基有3個(gè)濾紙片，分別為待檢測(cè)化合物，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，平板置于適宜溫度 下培養(yǎng) 12～18h（ 致病細(xì)菌）和2＼～3d（致病真菌），觀察抑菌情況。

在超凈臺(tái)用無(wú)菌竹簽將甘油管中保藏的假禾谷鐮刀菌、小麥冠腐病菌、小麥平臍蠕孢菌和板栗疫病菌分別接種到PDA培養(yǎng)基上，于 培養(yǎng)5d得到成熟菌株。用無(wú)菌1mL藍(lán)槍頭挑取 6mm 帶有以上指示菌的瓊脂塊圓餅，置于PDA固體培養(yǎng)基的中央，用無(wú)菌鑷子將濾紙片放置于距指示菌 20mm 位置，依次做好標(biāo)記及封口， 28°C 正置培養(yǎng)5d，觀察抑菌情況[。

對(duì)出現(xiàn)抑菌圈的化合物再做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用刻度尺測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌情況的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)抑菌圈直徑為 gt;20 、15＼～20、10＼～14、 lt;10 和 0mm 時(shí)，抑菌強(qiáng)度分別對(duì)應(yīng)極敏、高敏、中敏、低敏和耐藥[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰 m/z 為 165.0[M+Na]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₆H₆O₄ ，顯示有4個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下：1HNMR（400 MHz，CDOD） δH：7.95（1H， s，H-2）， 6.50（1H， s，H-4）， 4.41（2H， s，H-7）;¹³C NMR（100 MHz， CDOD） δ_C ： 176.8（C-6）， 170.4（C-5），147.3（C-3），141.0（C-2），110.7（C-4），61.2（C-7）。化合物1的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]基本一致，故鑒定為5-hydroxymethylfuran-3-carboxylicacid。該化合物為首次從該菌中分離得到。

化合物2：白色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰m/z為 229.1[M+H]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₁₄H₁₆N₂O ，顯示有8個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（ 400MHz. CDC13） δ_H ：7.30（6H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6'，H-2），3.83（2H， s，H-10），3.43（1H， m，H-7），1.24（6H， d，J=6.85Hz ，H-8，H-9）； ¹³C NMR（100 MHz， CDCI） δ_C 162.1（C-5）， 157.7（C-6），137.0（C-1），136.2（C-3），129.3（C-3'， C-5）， 129.0（C-2'， C-6）， 127.5（C-4）， 122.6（C-2），36.8（C-10），30.2（C-7），20.2（C-8，C-9）。化合物2的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[19]基本一致，故鑒定為phevalin。

化合物3：白色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰m/z為 123.2[M+H]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C，H₆O₂ ，顯示有5個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（400 MHz， CDOD）δ_H ： 9.76（1H， s， CHO）， 7.78（2H， d， J=8.70Hz ，H-2，H-6），6.91（2H， d， J=8.67Hz ，H-3，H-5）； ¹³C NMR（100 MHz，CD3OD） δ_C ： 192.8（C-7）， 165.6（C-4）， 133.5（C-2， C-6），130.1（C-1），117.0（C-3，C-5）。化合物3的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[20基本一致，故鑒定為4-羥基苯甲醛。

化合物4：無(wú)色油狀物，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的負(fù)離子峰m/z為195.1[M-H]，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₁₁H₁₆O₃ ，顯示有4個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（ 400MHz CD3OD） δ_H ：6.00（1H， s，H-4），2.48（1H， q， J=7.02Hz ，H-8）， 2.39（2H， m，H-6）， 1.67（1H， m，H-10a）， 1.55（1H， m，H-10b），1.20（3H， d， J=6.94Hz ，H-9），1.03（3H，t， J=7.4Hz 0H-7）， 0.89（3H， t， J=7.39Hz ，H-11）; ¹³CNM，R（100MHz， （20CD₃OD ） δ_C ： 168.8（C-1， C-3）， 167.7（C-5）， 105.2（C-2），100.4（C-4）， 40.9（C-8）， 28.5（C-10）， 18.3（C-9）， 17.2（C-6），12.8（C-7），11.9（C-11）。化合物4的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]基本一致，故鑒定為germicidinA。

化合物5：黃色油狀物，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰 m/z 為 197.1[M+Na]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₁₀H₁₀N₂O ，顯示有7個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（ 400MHz. DMSO- ?d₆） δ_H ：10.59（1H， s，NH）， 7.52（1H，d， J=8.40Hz H-4）， 7.26（1H， d， J=8.09Hz ，H-7）， 7.09（1H， d， J=1.68Hz H-2）， 6.99（1H， t， J=7.23Hz H-6）， 6.98（1H， t J=7.32Hz， （2號(hào)H-5）， 3.26（2H， s， H-1）; ¹³C NMR（100 MHz， DMSO- ?d_ω6） （2號(hào)δ_C ： 173.5（C-2'）， 136.0（C-7b）， 128.1（C-7a）， 125.6（C-2），122.8（C-6）， 120.2（C-5）， 119.3（C-4）， 117.5（C-7）， 110.8（C-3），35.6（C-1）。化合物5的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[22基本一致，故鑒定為吲哚-3-乙酰胺。

化合物6：深黃色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰m/z為 303.1[M+Na]⁺ ，結(jié)合 Ω^?1H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₁₈H₁₆O₃ ，顯示有11個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（ 400MHz ， CDC13）δ_H ： 7.53（1H， d， J=3.12Hz ，H-5）， 7.37（1H， d， J=9.23 （2號(hào)Hz，H-8），7.19＼～7.31（6H，overlap，H-7，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6'），6.14（1H， s，H-3）， 3.89（3H， s，OCH3），3.07（2H，m， H-12）， 2.91（2H， m， H-11）； ¹³C NMR（100 MHz， CDCl3）

δ：178.3（C-4），168.3（C-2），156.9（C-6），151.4（C-9），139.9（C-1'），128.8（C-2'， C-6'）， 128.4（C-3'， C-5'），126.7（C-4'）， 124.4（C-10）， 123.7（C-7）， 119.4（C-8），109.6（C-3）， 105.0（C-5）， 56.1（C-1）， 36.2（C-11）， 33.17（C-12）。化合物6的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[23]基本一致，故鑒定為6-methoxy-2-（2-phenylethyl）chromone。該化合物為首次從該菌中分離得到。

化合物7：黃色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰 m/z 為 377.2[M+Na]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₂₂H₂₆O₄ ，顯示有10個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹HNMR（400MHz， CDCl₃ ） δ_H ：7.43（2H，d， J=8.45Hz ，H-2'，H-6'），6.87＼～6.95（4H，overlap，H-a，H-a'，H-3'，H-5），6.71（2H，s，H-2，H-6），5.51（1H，m，H-2\"），4.53（2H，d， J=6.81 Hz，H-1\"），3.92（6H，s， 3-OCH₃ ， 5-OCH₃ ），3.86（3H，s， 4-OCH₃. ），1.81（3H，s，5\"-CH），1.76（3H，s，4\"-CH3）； ¹³C NMR（100 MHz， CDC1，） δ_C ： 158.7（C-4'），153.5（C-3，C-5）， 138.5（C-3\"）， 137.7（C-4）， 133.6（C-1），130.0（C-1'）， 128.0（C-a'）， 127.7（C-2'， C-6）， 126.6（C-a），119.7（C-2\"）， 115.0（C-3'， C-5'），103.4（C-2，C-6），65.0（C-1\"）， 61.1（ ，56.3（ OCH₃ -3， 5），26.0（C-5\"），18.4（C-4\"）。化合物7的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[24]基本一致，故鑒定為trans-3，4，5-trimethoxy- .4^′ 1isopentenyloxyl-stilbene。該化合物為首次從該菌中分離得到。

化合物8：白色油狀物，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰m/z為 202.1[M+Na]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₈H₅NO₄ ，顯示有7個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹H NMR（ 400MHz 0CD3OD） δ_H ：7.44（1H， dd， J=1.96 7.14Hz. H-5）， 7.20（2H，m， H-6， H-7）; ¹³C NMR（100 MHz， CD₃OD ） δ_C ： 163.4（C-8），149.2（C-2）， 146.4（C-7a）， 144.1（C-3a），126.4（C-6），123.6（C-7），118.0（C-5），116.6（C-4）。化合物8的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[25]基本一致，故鑒定為1，3-benzodioxole derivative。

化合物9：無(wú)色油狀物，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出 的正離子峰m/z為304.2[M+Na]+，結(jié)合 ?¹H NMR和 ¹³C NMR 譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₁₅H₂₃NO₄ ，顯示有5個(gè)不飽和 度。其NMR數(shù)據(jù)如下：1H NMR（400 MHz， CDCl）δH： 4.20（1H， d， J=10.59Hz ，H-8），2.77（1H，d， J=4.06Hz H-5a）， 2.75（1H， d， J=4.10Hz ，H-3a），2.63（1H， m， H-11），2.42＼～2.52（2H，overlap，H-9，H-4）， 2.28＼～2.38（2H， overlap，H-3b，H-5b），2.20（1H，m，H-13），1.87＼～1.94（2H， overlap，H-12b，H-14a），1.18＼～1.24（4H，overlap，H-16， H-7b），1.81（1H，m，H-14b），1.60＼～1.65（2H，overlap，H-12a， H-7a）， 0.98（3H， d， J=6.38 Hz， H-15）； ¹³C NMR（100 MHz， CDCl₃. ） δ_c ： 216.7（C-10），172.6（C-2），172.4（C-6）， 66.6（C-8）， 50.2（C-9）， 42.7（C-12）， 40.7（C-11）， 38.6（C3）， 38.0（C-7）， 37.3（C-5）， 33.1（C-14）， 27.7（C-4）， 26.8（C13），18.5（C-16），14.3（C-15）。化合物9的上述波譜數(shù)據(jù) 與文獻(xiàn)報(bào)道[26基本一致，故鑒定為cycloheximide。

化合物10：白色粉末，根據(jù)質(zhì)譜ESI-MS給出的正離子峰 m/z 為 183.0[M+Na]⁺ ，結(jié)合 ¹H NMR和 ¹³C NMR譜圖數(shù)據(jù)推測(cè)其分子式為 C₉H₈N₂ ，顯示有7個(gè)不飽和度。其NMR數(shù)據(jù)如下： ¹HNMR（400MHz，CDCl₃） δ_H ：8.26（1H， dd， J=1.36 ， 7.98Hz ，H-5），7.77（1H， dt，J=1.53 ，7.11 Hz，H-7），7.67（1H， d， J=8.31 Hz， H-8），7.47（1H， d， J=7.47Hz ，H-6），2.55（3H，s， 3^′-CH₃， \"¹³C NMR（100 MHz， CDCl₃ ） δ_c ： 163.2（C-1）， 152.9（C-3），149.3（C-10）， 135.1（C-6）， 127.1（C-8）， 126.7（C-7），126.5（C-5），120.6（C-9），22.4（C-3'）。化合物10的上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[27]基本一致，故鑒定為2-methyl-4[3H]-quinazolinone。

2.2抑菌活性結(jié)果

采用濾紙片法測(cè)定化合物1＼～10對(duì)以上4種致病細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，1種致病真菌白念珠菌和4種植物病原菌假禾谷鐮刀菌、小麥冠腐病菌、小麥平臍蠕孢菌和板栗疫病菌的抑菌活性。抑菌結(jié)果表明，當(dāng)陽(yáng)性藥和化合物的濃度都為0.2mmol/L時(shí)，化合物1對(duì)致病細(xì)菌金黃色葡萄球菌的抑制效果為高敏[抑菌直徑為 （15.50±0.5）mm] ，化合物1和9對(duì)假禾谷鐮刀菌的抑制效果為低敏[抑菌直徑分別為 （5.50±0.5）mm 和（20 （7.50±0.5）mm] 。其余化合物均未顯示出抑菌活性。

3討論與結(jié)論

紅樹(shù)林海洋放線菌資源被認(rèn)為是尋找新型藥物先導(dǎo)化合物的重要資源庫(kù)，是具有潛力的生物多樣性熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[28]。本研究從廣西紅樹(shù)林放線菌Streptomycessp.GY-10129的發(fā)酵提取物中分離鑒定了10個(gè)化合物，通過(guò)波譜學(xué)方法和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比確定了化合物的結(jié)構(gòu)，化合物1為羥基羧酸類化合物，化合物2、8、9和10為生物堿，化合物3為芳香族醛類化合物，化合物4為萜內(nèi)酯，化合物5為吲哚乙酰胺，化合物6為2-苯乙烯色原酮類衍生物，化合物7為二苯乙烯衍生物，說(shuō)明鏈霉屬放線菌能夠產(chǎn)生類型豐富的化合物。據(jù)報(bào)道，化合物1對(duì)人體癌癥細(xì)胞Hela、A549和HepG2表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性[18]，有研究表明，化合物2可以作為一種新的鈣蛋白酶抑制劑，可能用于治療神經(jīng)退行性疾病和肌肉營(yíng)養(yǎng)不良[9]，化合物7則對(duì)Hela細(xì)胞表現(xiàn)出有效的抗增殖活性[24]，化合物8據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)其對(duì)糞腸球菌和葡萄球菌存在一定的抗菌活性[25]，化合物9為內(nèi)酰胺內(nèi)生物堿，具有廣譜的抗植物病原真菌的活性[26]，化合物10是一種強(qiáng)效且具有特異性的酶抑制劑[27]，這些化合物的其他活性還有待進(jìn)一步研究。本研究首次從該放線菌中分離獲得化合物1、6和7，并首次報(bào)道了化合物1對(duì)于假禾谷鐮刀菌的抗菌活性。從該放線菌分離得到的化合物1對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑制效果，金黃色葡萄球菌是自然界中常見(jiàn)的食源性革蘭陽(yáng)性致病細(xì)菌，可引起敗血癥，皮膚感染、肺部炎癥等疾病[29]，故化合物1對(duì)治療金黃色葡萄球菌感染具有一定的潛力。化合物1和9對(duì)假禾谷鐮刀菌具有微弱的抑制效果，假禾谷鐮刀菌是造成真菌性土傳病害的常見(jiàn)菌株之一，被感染的農(nóng)作物包括玉米，小麥等，對(duì)我國(guó)糧食安全造成了一定的影響[30-31]，本文的研究對(duì)防治假禾谷鐮刀菌能提供一定的參考依據(jù)。本研究不僅豐富了紅樹(shù)林放線菌天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性，同時(shí)表明紅樹(shù)林放線菌具有產(chǎn)生抗菌先導(dǎo)化合物的潛在研究?jī)r(jià)值。

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