產纖維素酶芽孢桿菌的篩選、鑒定及其發酵產酶條件優化

Screening，identification，and optimization of fermentation conditions for cellulase-producing Bacillus sp.

ZHANG Ting1，LUO Jing-wen1，LAI Xue-ping1，FENG Dong-ping1 ， HUANG Chun-lan1 ，WEI Zhi-fu2，CHENG Zhong1 *

（1.College of Food and Quality Engineering，Nanning University，Nanning 5302oo， China; 2. Guangxi Bingke Food Co.，Ltd.，Nanning 53010o，China）

Abstract：Lignocellulose is the most abundant renewable resource in nature，and its biorefinery requires the use of cellulase for hydrolysis，but the low yield and high production costs significantly limit the large-scale industrial application of cellulase.To obtain high cellulaseproducing bacterial strains，a cellulase-producing strain LT-4 was isolated and purified from the soil of sugarcane land in Liuzhou，Guangxi，by using Congo red-carboxymethyl cellulose sodium medium. The strain was then identified through molecular biology techniques，and the fermentation conditions for cellulase production were optimized using single-factor and orthogonal experiments. The results showed that the strain LT-4 belongs to the genus Bacillus sp.Using Avicelase as the evaluation index，the optimal liquid fermentation conditions for cellulase production were as follows：Using a carbon source of wheat bran and sugarcane bagasse in a mass ratio of of peptone as the nitrogen source，a fermentation broth pH of 8.O，and incubation at 39^°C for 36h . After optimization，the optimized Avicelase activity reached （0.237±0.014 ） U/mL ，which is 2.3 times higher than that before optimization. This study is of great significance for improving cellulase yield and reducing production costs，providing a feasible solution for the efficient utilization and resource conversion of lignocellulose，while also laying a foundation for industrial applications in related fields.

Key words：lignocellulose; cellulase; Bacillus; liquid fermentation;optimization

0 引言

木質纖維素是自然界中含量最豐富的可再生資源，以其為原料進行生物煉制可獲得多種化學增值產品[1-3].農業廢棄物如甘蔗渣、作物秸稈中富含木質纖維素.據估計，2024年全球甘蔗產量將超過22.1億噸，同時產生約2.8億噸的甘蔗渣.然而由于木質纖維素的生物煉制效能低[4-6]，產生的甘蔗渣大部分未被充分高值化利用.甘蔗渣的生物煉制首先需要纖維素酶的水解作用，纖維素酶是由內切-β-1，4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切β-1，4-葡聚糖酶（EC3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）組成78.其廣泛應用于飼料、食品、能源、化工等領域[9-11].但纖維素酶活力低、生產成本高仍是工業酶大規模應用的瓶頸.

纖維素酶主要來源于植物、動物和微生物，特別是真菌、細菌、放線菌[8.12-15].目前，國內外對纖維素降解菌的研究主要集中在真菌方面，且大多數商業化的纖維素酶均來源于真菌[13].但是真菌的篩選時間成本高，后期真菌發酵生產纖維素酶的生長條件較為苛刻，不利于實現高效、經濟的生產流程.相比之下，細菌分布較廣，生長周期短，結構簡單，產酶速度較快，更適用于大規模工業化生產纖維素酶[16-18].因此，挖掘高產纖維素酶細菌具有很強的應用潛力和經濟價值，能夠為纖維素的高效降解和資源化利用提供更為可行的解決方案.采用液體發酵模式可大規模、高質量地生產纖維素酶.發酵培養基組分和培養條件的優化是酶蛋白經濟合成和商業化的關鍵步驟，對提高酶產率和降低生產成本具有實質性的意義[19.20].

為了解決當前纖維素酶生產效率低、成本高的問題，本研究從廣西柳州甘蔗地土樣中分離純化產纖維素酶的細菌菌株，測定其纖維素酶活力，選出酶活力最高的菌株進行分子生物學鑒定；然后通過單因素試驗與正交試驗對其液體發酵產酶條件優化，確立最佳液體發酵產酶條件.研究結果可為土壤細菌的纖維素酶生產研究及其開發利用提供理論和實踐參考.

1材料與方法

1. 1 主要材料

土樣：采集自廣西壯族自治區柳州市的甘蔗地，置于無菌袋中，于 4^°C 保存；麥麩、甘蔗渣、稻稈：市售；DNA提取試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司.

1.2主要試劑、培養基

2× TaqPCRMasterMix購自諾唯贊生物科技有限公司；蛋白陳、酵母粉、羧甲基纖維素鈉（Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na）、微晶纖維素（Avicel）購自北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純.微量元素混合液、Na₂HPO₄ -檸檬酸緩沖溶液、DNS試劑、LB培養基、LA培養基的配制參考Zhang T 等[21]發表的文獻.

剛果紅-CMC-Na 初篩培養基 （g/L）：5. 0g CMC-Na.0.4g 剛果紅 ?^5.0g 蛋白脈、 .5.0g 酵母粉、 20.0g 瓊脂粉 CaCl₂…l.0gK₂HPO₄…1 1mL 微量元素混合液；用HCl、NaOH 溶液調節 pH 至8.0，121 ^°C 滅菌20min

液體發酵產酶培養基 （g/L）^[21] ： ， 4.0g（NH₄）₂SO₄，0.6gCaCl₂，0.6gMgSO₄ ·7H₂O…4.0gKH₂PO₄ 、分別量取 1mL 吐溫-80、 100μL 微量元素混合液；用HCl、 ΔNaOH 溶液調節 pH 至8.0.

1.3主要儀器設備

UNIVERSAL320高速離心機：Hettich科技儀器公司；SUBAquaPro型恒溫水浴鍋：格蘭特Gant儀器有限公司；VarioskanLUX多功能酶標儀、超微量生物檢測儀（Nanodrop20oO）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ZQZY-78C振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；LDZF-5OL高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；WD-9413B凝膠成像儀、DYY-6c電泳儀：北京六一生物科技有限公司.

1.4 實驗方法

1.4.1產纖維素酶細菌的初篩和保藏

稱取土樣 ，溶于 9mL 無菌去離子水中制成樣品，實施梯度稀釋 （10^-4～10^-8 ），每個梯度下取 200μL 菌懸液，在剛果紅-CMC-Na初篩培養皿上進行涂布， 37°C 培養 24h. 對呈現透明圈的細菌進行劃線純化和保藏.

1.4.2產纖維素酶細菌的復篩

將初篩得到菌株接種至LB培養基，于 37° 、200r/min 培養至 OD₆₀₀=0.6 獲得種子液；然后將其以體積分數 2.0% 的接種量轉接到液體發酵產酶培養基中， 37^°C，200r/min 培養 ^48h ;培養結束后， .4 500r/min 離心 10min ，上清液即為粗酶液，對其進行微晶纖維素酶活力測定.

1.4.3產纖維素酶細菌的微晶纖維素酶活力測定（1）葡萄糖標準曲線的繪制

參考Zhang T 等[21]發表文獻的方法制作葡萄糖標準曲線，以葡萄糖含量（ Ω_mg/mL 為橫坐標，在540nm 波長處的吸光值 OD₅₄₀ 為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，如圖1所示.由圖可知，該標準曲線的線性回歸方程為 ，方差為R²=0.9994

（2）微晶纖維素酶活力的測定

本試驗將一個酶活力單位（U）定義為酶液每分鐘催化底物產生 1μmol 還原糖所需要的酶量.測定方法參考馮東萍等[22]發表的文獻，將 10g/L 底物溶液換成本研究的 10g/L Avicel溶液，其中，微晶纖維素酶活力計算公式如下：

式（1）中： U 為微晶纖維素酶的酶活力， U/ mL;ρ 為葡萄糖的質量濃度， mg/mL;M 為葡萄糖的摩爾質量， g/mol;V 為反應體系的總體積， mL ：V₁ 為反應體系中添加的粗酶液體積， mL;t 為體系的反應時間， min;N 為稀釋倍數.

1.4.4產纖維素酶細菌的分子生物學鑒定

根據細菌試劑盒的操作說明提取細菌DNA，以DNA為模板， 24F（5^′ AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG）和1492R（ 5^′ GGTTACCTTGT-TACGACTT）為引物進行 16SrDNA 擴增.通過超微量生物檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物濃度和純度，并進行Sanger測序分析，將所得序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/進行比對分析并采用MEGAversionX軟件構建系統發育樹，采用鄰接法結合泊松修正模型構建進化圖，在1000個重復的情況下計算分支上列出的 Bootstrap 值[23].

1.4.5產纖維素酶細菌的發酵產酶條件優化

選擇目標菌株LT-4進行發酵產酶條件的優化.采用單因素分析法，通過改變發酵液碳源、氮源、pH、溫度、發酵時間各水平，以微晶纖維素酶活力為評價指標，評估各因素對菌株產酶的影響.各因素與水平設計方案見表1所示.根據單因素優化的結果選取對菌株纖維素酶產量影響最大的三因素三水平，進行正交優化，正交試驗因素與水平見表2所示，

1.5 數據處理

本研究涉及的所有試驗均重復3次，數據以均數士標準差（SD）表示，使用SPSS27.0版本進行單因素方差分析（ANOVA）和正交方差分析；采用軟件MicrosoftExcel，PowerPoint（Office2O21）進行圖表繪制.

2 結果與討論

2.1產纖維素酶細菌的篩選

本研究成功分離得到22株在剛果紅-CMCNa初篩培養基上具有明顯水解圈的細菌，其部分菌株的表型如圖2（a）所示，表明這些細菌具備潛在的纖維素降解能力.繼續在液體發酵產酶培養基中培養2天后，各菌株的微晶纖維素酶活力測定結果如圖2（b）所示，菌株LT-4的酶活力最高，達到（20 （0.101±0.004）U/mL（10 株細菌未檢測到酶活力，圖中未展示）.后續選擇菌株LT-4進行液體發酵產酶條件的優化.

與傳統的物理化學法相比，微生物法降解木質纖維素已成為更為經濟高效的選擇，尤其是細菌在惡劣條件下的耐受性使其更適合于工業化生產.已有研究表明，部分細菌具備高效降解纖維素的能力，例如，楊波等24]篩選出的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和索諾拉沙漠芽孢桿菌（B.sonorensis）的羧甲基纖維素酶活力分別為 和0.151U/mL ，二者 1：1 復配能夠促進纖維素水解，提高堆肥質量.白旭明25篩選出一株芽孢桿菌B.aquimaris13Cl2，其微晶纖維素酶活力達到19.02U/mL （按本研究的酶活力定義換算達到0.106U/mL .這些研究結果也進一步支持了細菌在纖維素降解領域的應用前景，為本研究菌株LT-4的后續優化提供了理論依據.

2.2 菌株LT-4的分子鑒定

提取菌株LT-4的總DNA，擴增16SrDNA獲得一條約1400bp的條帶，符合預期大小（圖3（a））.對擴增產物進行Sanger測序并將序列提交至NCBI進行Blast比對分析，結果發現菌株LT-4的16SrD-NA序列與芽孢桿菌屬菌株的同源性均高于 99% ，其中與芽孢桿菌屬（Baciussp.）菌株nst-3（OR392971.1）、B1-1（OP081004.1）的同源性達到99.93% （圖3（b））.因此，本研究初步確定該菌株為芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillussp.LT-4.

2.3Bacillussp.LT-4產纖維素酶的液體發酵條件優化

2.3.1 發酵碳源對Bacillussp.LT-4產纖維素酶的影響

在總碳源質量濃度為 0. 01g/mL ，麥麩：甘蔗渣質量比為 4：1 時微晶纖維素酶活力最高，達到0.173U/mL （圖4）.其中，含麥麩的復合碳源使酶活力較蔗糖和CMC-Na的平均提升約三倍，這可能是由于麥麩中富含淀粉、蛋白質及可溶性寡糖，能夠有效促進纖維素酶的合成，而蔗糖等單一碳源結構相對簡單，僅能提供基礎的生長因子.本研究后期正交試驗在碳源為麥麩：甘蔗渣質量比為 4：1 （0.01g/mL） 的基礎上進行.

2.3.2 發酵氮源對Bacillussp.LT-4產纖維素的影響

氮源為 4g/L 酵母粉、蛋白脈和尿素時對Ba-cilussp.LT-4的酶活力影響較大（當氮源為硝酸鈉時未檢測到微晶纖維素酶活力），其中在氮源為蛋白脈時產生的微晶纖維素酶活力最高，為 0.165U/mL （圖5）.此外，含有蛋白脈或酵母粉的培養基中酶活力是含尿素的兩倍，這可能是因為前者為菌株的發酵產酶提供了更為豐富的營養和適宜的生長條件，從而顯著提高了酶的活力.本研究后期選擇 4g/L 酵母粉、蛋白陳和尿素作為正交試驗的三水平.

2.3.3 發酵液 pH 對Bacillussp.LT-4產纖維素酶的影響

在 pH 為 6.5～8.0 時，酶活力持續上升，并在pH=8.0 時達到最大值 0.124U/mL ，表明 pH 值對酶的活性具有顯著影響，適宜的 pH 環境能夠促進酶的最佳活性；而在 pH 為 8.0～8. 5 時，酶活力逐漸下降，這可能與該 pH 值下酶的構象穩定性及其與底物的結合能力有關（圖6）.本研究后期選擇發酵初始 pH 為7.5、8.0、8.5作為正交試驗的三水平.

2.3.4 發酵溫度對Bacillussp.LT-4產纖維素酶的影響

本研究發現溫度對酶的活性具有顯著影響.在31^°C～37^°C 時，酶活力持續上升，并在 37^°C 達到最大值 0.137U/mL ，這一結果表明，適宜的溫度下，酶的分子運動加快，底物與酶的結合效率提高，從而增強了酶的活性，促進酶的催化反應；而在37°～39° 時，酶活力開始下降（圖7），這一現象可能與酶的熱穩定性有關，過高的溫度可能導致酶的變性或活性位點的失活，從而降低其催化效率.本研究后期選擇發酵溫度 作為正交試驗的三水平.

2.3.5 發酵時間對Bacillussp.LT-4產纖維素酶的影響

在 12～36h 時，酶活力持續上升，表明隨著發酵時間的延長，細菌的生長和代謝活動增強，導致酶的產生和積累不斷增加.在 36h 時，酶活力達到最大值 0.135U/mL ，這一結果表明在此時間點，細菌的代謝狀態和環境條件達到了最佳平衡，促進了酶的高效合成；然而，隨著發酵時間進一步延長，細胞開始衰老或死亡，從而影響酶的持續產生，酶的降解速率超過其合成速率，酶產量開始下降（圖8）.

2.3.6 液體培養條件正交優化

以麥麩：甘蔗渣質量比為 4：1（0.01g/mL） 為固定碳源（發酵時間為 36h ），檢測微晶纖維素酶活力，由表3可知：各因素對酶活力影響的主次順序依次為 _Agt;Bgt;C ，即發酵氮源 gt; 發酵液 pHgt; 發酵溫度，最佳組合為 A₂B₂C₃ ，經驗證，其酶活力為0.244±0.026U/mL ，與正交表中的最佳組合一致.方差分析表明，發酵氮源對Bacillussp.LT-4液體發酵微晶纖維素酶活力影響顯著；而發酵液 pH， 發酵溫度對其液體發酵產酶影響無顯著性差異（表4）.最終確定Bacillussp.LT-4液體發酵產酶最佳條件為：麥麩：甘蔗渣質量比為 4：1（0.01g/mL） 為碳源， 4g/L 的蛋白陳為氮源，發酵液 pH 為8.0， 培養 36h .在此最佳條件下得到微晶纖維素酶活力為 （0.237±0.014）U/mL ，是未優化前的2.3倍.

3結論

本研究從廣西柳州的甘蔗地土壤中分離到了一株高產纖維素酶的菌株LT-4，經形態學和分子生物學鑒定初步確定為Bacillussp.LT-4，進而通過單因素篩選結合正交實驗方法確定Bacilus sp.LT-4的最佳液體發酵產酶條件為：以質量比 4：1 的麥麩：甘蔗渣為碳源， 4g/L 的蛋白脈為氮源，發酵液 pH 值為8.0，在 條件下培養 36h .在該條件下，Bacilussp.LT-4的微晶纖維素酶活力達到了 （0.237±0.014）U/mL ，是優化前的2.3倍.該研究結果不僅為微生物酶的工業化生產提供了有效的發酵條件，也為進一步探索和利用高效纖維素降解菌株奠定了基礎，具有重要的應用價值和研究意義.

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【責任編輯：蔣亞儒】