ε-聚賴氨酸基鹵牛肉保鮮劑的配比優(yōu)化研究

Optimization of the formulation of ε-polylysine-based preservative for brined beef

LIU Miao-miao1 ， BAI Ya-nan1 ， ZHANG Xin1 ，GAO Shuai2，WANG Yao-yao ³ ，YUAN Fang4 ，YANG Fa-lian2，CAO Yun-gangl *

（1.College of Food Science and Engineering，Shaanxi University of Science amp; Technology，Xi'an 710021， China;2.Yulin Hengshan Vanilla Muton Products Co.，Ltd.，Yulin 719199，China; 3. Xi'an Baqiao Market Supervision Administration， Xi'an 710o38，China;4.Jiangsu Yiming Biological Technology Co.，Ltd.，Taixing ，China）

Abstract：The antibacterial effects of ε-polylysine （ ）alone and with other bacteriostatic agents against spoilage bacteria in brined beef were analyzed，and the formula of ε -PL-based brined beef preservative was screened and optimized. Results showed that Π_E^-PL alone or combined with Nisin，and chitosan showed high inhibitory activity against Pseudomonas，Bacillus subtilis and Macrococcus casei isolated from brined beef.Orthogonal ex periment design was used，to optimize the optimal formulation of the -based brined beef preservative，with natamycin as an antifungal agent，which was found to be 0.162g/100mL of ε-PL，0.050g/100 mL of Nisin， 0.030g/100mL of chitosan，and 0.004g/100mL of natamycin. The cold storage shelf life of palletized brined beef was extended to ^7d with the composite preservative.

Key words：e-polylysine; braised beef spoilage bacteria; compound preservative; Nisin; chi

tosan

0 引言

醬鹵肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富，口感濃郁，食用方便，深受消費(fèi)者喜愛[1].據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年中國(guó)醬鹵肉制品行業(yè)規(guī)模達(dá)到了3296億元2，醬鹵肉制品產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)肉制品中第三大發(fā)展迅速的產(chǎn)業(yè)3.鹵牛肉是醬鹵肉制品的典型代表，高蛋白質(zhì)、低脂肪且味道鮮美，是當(dāng)前醬鹵肉類消費(fèi)的主流.然而，鹵牛肉極易受到特定微生物的污染，致使蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解，產(chǎn)生胺、吲哚、有機(jī)酸和酮等代謝產(chǎn)物4，出現(xiàn)粘液、軟化、異味、變色等劣變現(xiàn)象，導(dǎo)致食用品質(zhì)大幅降低[5]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失．一些腐敗菌甚至還會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的毒素，嚴(yán)重威脅人體健康[.因此，亟需開發(fā)安全、高效的鹵牛肉防腐保鮮技術(shù)，確保醬鹵肉制品的品質(zhì)和安全.

-聚賴氨酸（ ε -polylysine， Π_E^-PL ）是一種天然陽(yáng)離子抗菌肽，具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌等都有顯著的抑制作用[7-9]，且水溶性高、可生物降解、安全性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在中國(guó)、日本、美國(guó)、韓國(guó)等國(guó)均已獲批使用[10.11].然而，在實(shí)際應(yīng)用中， e^-PL 易與食品基質(zhì)中的復(fù)雜組分，如蛋白質(zhì)等成分發(fā)生相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致其對(duì)于高蛋白含量的肉制品、乳制品等抑菌效果較差[12]，因而其單獨(dú)保鮮效果不能滿足醬鹵肉制品的實(shí)際需求.研究表明，將 與多種保鮮劑按照一定比例復(fù)配，不僅能有效提高抑菌效力、改善保鮮效果，還可降低每種保鮮劑的用量，進(jìn)而降低使用成本[13].Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)， Π_E^-PL 與乳酸鏈球菌素（Nisin）、八角茴香精油聯(lián)用，可以有效抑制肴肉中微生物的生長(zhǎng)，降低揮發(fā)性鹽基氮的含量，將貨架期從8d延長(zhǎng)至16d.Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)， Π_E^-PL 與殼聚糖、抗壞血酸聯(lián)用，顯著抑制了生豬肉中細(xì)菌的生長(zhǎng)，將貨架期延長(zhǎng)了6d.另外，納他霉素等抗真菌劑的添加，可以有效擴(kuò)展 的抑菌譜，增強(qiáng)抗菌保鮮效力，從而延長(zhǎng)肉制品的貨架期16.然而，致腐微生物種類的差異導(dǎo)致現(xiàn)有的保鮮策略并不完全適用于鹵牛肉的防腐保鮮.

因此，本研究首先對(duì)鹵牛肉中的腐敗菌進(jìn)行初步分離鑒定，進(jìn)而靶向鹵牛肉源腐敗菌，分析 Π_E^-PL 單獨(dú)及與Nisin、殼聚糖等抑菌劑聯(lián)合的抑菌效果，并探究其協(xié)同抑菌機(jī)制；進(jìn)而選擇抑菌效果好、且與 具有良好協(xié)同作用的抑菌劑，并輔以納他霉素作為抗真菌劑，利用正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)配保鮮劑進(jìn)行配方優(yōu)化，獲得 Π_E^-PL 基鹵牛肉保鮮劑的最優(yōu)配方，為醬鹵肉制品行業(yè)的防腐保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛后腿肉：陜西西安大買家超市；Luria-Ber-tani培養(yǎng)基（LB）、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）：杭州微生物試劑有限公司； ：江蘇一鳴生物股份有限公司；Nisin：浙江銀象生物工程有限公司；殼聚糖、溶菌酶、乳酸鈉、肉桂酸鉀、茶多酚：上海鑫泰實(shí)業(yè)有限公司；氯化鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司； DiBAC4_（3） 熒光探針：美國(guó)AATBioquest公司.

1.2儀器與設(shè)備

BP211D電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；KA-6189A真空腌制機(jī)：深圳市瑞豐電器有限公司；UV2900紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；多功能酶標(biāo)儀：德國(guó)Ther-mo Scientific公司.

1.3鹵牛肉的制備

將新鮮牛后腿肉剔除筋膜、脂肪等，用清水浸泡去血水后瀝干，放入預(yù)先加入腌制液（生抽 10g 、料酒 15g 鹽 3g 的真空滾揉機(jī)中，滾揉 40min ，再轉(zhuǎn)至清水鍋中預(yù)煮 （100C，15min） ，隨后轉(zhuǎn)至另一清水鍋中，加入調(diào)料（每 500g 肉：鹵料1包；生抽 10g ;老抽 2g ；豆瓣醬 15g ；耗油 8g ;料酒 10g 大蔥 10g ；生姜 10g ;冰糖 5g ;鹽 3g ），進(jìn)行鹵制中 （100C，4h） .最后取出鹵牛肉冷卻至室溫，備用.

1.4腐敗菌分離鑒定

鹵牛肉經(jīng)托盤包裝后，于 4^°C 冰箱中貯藏 7d 取適量鹵牛肉置于超凈工作臺(tái)中，用預(yù)先滅過(guò)菌的刀片切碎，裝在有滅菌生理鹽水 （0.85%） 的均質(zhì)袋中，均質(zhì)100s，制得菌液.菌液經(jīng)10倍梯度稀釋后，取 50μL 菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)^48h .觀察并挑選平板上的細(xì)菌，用平板劃線法純化至形態(tài)特征穩(wěn)定的菌種并編號(hào).將分離得到的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 12h ，離心收集菌體.將菌體送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16srDNA菌種鑒定.所得基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的微生物基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用iTOL軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5抑菌劑的抑菌作用分析

1.5.1 抑菌圈的測(cè)定

利用瓊脂擴(kuò)散法，分析 ε -PL、Nisin、殼聚糖、溶菌酶、乳酸鈉、肉桂酸鉀及茶多酚7種抑菌劑對(duì)鹵牛肉腐敗菌的抑制效果.鹵牛肉腐敗菌經(jīng)活化培養(yǎng)后，接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整600nm 處的吸光值為0.5（約 1×10⁸CFU/mL） 取菌懸液 30μL 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，將預(yù)先滅菌的 6mm 圓形濾紙片置于平板表面，取20μL 抑菌劑溶液（濃度分別為 5mg/mL，10mg/mL， 20mg/mL，30mg/mL） 滴加在濾紙片上，同時(shí)以20μL 無(wú)菌水作為空白對(duì)照，培養(yǎng) 24h 后測(cè)量抑菌圈.

1.5.2最小抑菌濃度（Minimum InhibitoryConcentration，MIC）的測(cè)定

利用二倍稀釋法測(cè)定 、Nisin、殼聚糖及乳酸鈉對(duì)鹵牛肉腐敗菌的MIC.鹵牛肉腐敗菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整 600nm 處的吸光值為0.1.在96孔板中，每孔加入 100μL 菌懸液，再加入 100μL 抑菌劑，抑菌劑的終濃度分別為 將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔培養(yǎng)前后在 600nm 處的吸光度并計(jì)算吸光度差值，以差值小于0.05，且結(jié)合肉眼觀察澄清的孔所對(duì)應(yīng)的抑菌劑濃度為該抑菌劑對(duì)該菌的MIC.

1.5.3 協(xié)同最小抑菌濃度（SynergisticMinimumInhibitory Concentration，SMIC）的測(cè)定

利用“棋盤法\"測(cè)定 分別與Nisin、殼聚糖、乳酸鈉聯(lián)合對(duì)鹵牛肉腐敗菌的SMIC.在96孔板中，橫向孔中加入不同濃度的 ，縱向孔中加入不同濃度的 Nisin、殼聚糖或乳酸鈉 50μL 每孔加入 100μL 菌懸液 ΔCOD_600nm=0.1Ω ，抑菌劑的終濃度均為 0～1MIC. 將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔培養(yǎng)前后在 600nm 處的吸光度，結(jié)合吸光度差值及肉眼觀察，確定SMIC.

采用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（FractionalInhibitoryConcentrationIndex，F(xiàn)ICI對(duì)不同抑菌劑間的聯(lián)合抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià).FICI按公式（1）計(jì)算，當(dāng)FICI?0.5 為協(xié)同作用， 0.52 為拮抗作用[17]. 抑菌劑聯(lián)用MIC 抑菌劑單獨(dú) B抑菌劑聯(lián)用MIC 抑菌劑單獨(dú)MIC

1.5.4 生長(zhǎng)曲線分析

根據(jù)SMIC的結(jié)果，選擇代表性的協(xié)同組合（ 和Nisin），分析其對(duì)鹵牛肉源假單胞菌生長(zhǎng)曲線的協(xié)同影響.將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的假單胞菌菌懸液用LB培養(yǎng)基稀釋至 OD_600nm=0.1 ，加人終濃度為 0、1/4MICε-PL、1/8MIC Nisin 和 1SMIC PL/Nisin（即 Nisin），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h ，每小時(shí)取樣測(cè)定 600nm 處的吸光度.

1.5.5 膜電勢(shì)的測(cè)定

使用膜電位敏感的熒光探針 DiBAC4_（3） 測(cè)定 ε^- PL和Nisin協(xié)同組合處理下鹵牛肉源假單胞菌細(xì)胞膜電勢(shì)的變化.將假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體沉淀，用生理鹽水洗滌并調(diào)整 OD_600nm=0.5 ，加入終濃度為 0.1/4MICε?PL，1/8MIC Nisin和1SMICε-PL/Nisin的抑菌劑，再加人終濃度為0.05μmol/L 的熒光染料，避光培養(yǎng) 3h ，使用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng) 492nm ，發(fā)射波長(zhǎng)515nm

1.5.6 胞外核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的測(cè)定

分析 和Nisin協(xié)同組合對(duì)鹵牛肉源假單胞菌胞外核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響.將假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體沉淀，用生理鹽水洗滌并調(diào)整 OD_600nm=0.5 ，加入終濃度為 0.1/ 4MIC ε-PL、1/8MIC Nisin 和 1SMIC ε-PL/Nisin，在處理第 ^1h.3h 和 ⁶h 取樣，離心取上清液，在260nm 和 280nm 波長(zhǎng)下測(cè)定胞外核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量.

1.6復(fù)配保鮮劑的配方優(yōu)化

1.6.1 正交試驗(yàn)

根據(jù)抑菌作用分析結(jié)果，選擇 、Nisin、殼聚糖三種抑菌劑作為實(shí)驗(yàn)因子，同時(shí)以納他霉素作為抗真菌劑，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，各因素水平見表1所示.

將鹵牛肉用滅過(guò)菌的刀片在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)切分成約 10g/ 塊，將其在不同的保鮮液中浸泡3min ，同時(shí)以無(wú)菌水浸泡作為對(duì)照組，撈出瀝干，經(jīng)托盤包裝后，置于 4^°C 冰箱貯藏，在第7d時(shí)測(cè)定菌落總數(shù).每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.

1.6.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

取鹵牛肉樣品，裝在有滅菌生理鹽水 （0.85% ）的均質(zhì)袋中，均質(zhì) 100s ，將樣液進(jìn)行10倍系列稀釋，選取合適稀釋度，取 100μL 菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)后，對(duì)各組樣品的菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)（log（CFU/g））.

1.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以1.6.1正交試驗(yàn)篩選出來(lái)的復(fù)配保鮮劑配方處理鹵牛肉（復(fù)配組）后，在 4C 條件下貯藏，并在貯藏第7d測(cè)定菌落總數(shù)，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果.同時(shí)以無(wú)菌水處理的鹵牛肉作為對(duì)照組，以 0.75% 山梨酸鉀防腐液處理的鹵牛肉作為陽(yáng)性組，通過(guò)比較分析不同處理組鹵牛肉的菌落總數(shù)和感官品質(zhì)，明確復(fù)配保鮮劑的保鮮效果，

感官評(píng)定：評(píng)定小組由5名食品專業(yè)人員組成，人員固定.檢驗(yàn)方法：取適量試樣置于潔凈的白色盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)，聞其氣味.鹵牛肉感官評(píng)定從色澤、氣味、組織狀態(tài)、整體可接受度4個(gè)方面進(jìn)行，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2所示，每個(gè)項(xiàng)目的滿分為10分，最后以評(píng)分的平均值為感官綜合評(píng)定結(jié)果.

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)值以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin2018軟件繪圖，使用IBM

SPSSStatistics25進(jìn)行顯著性差異分析，當(dāng) 0.05時(shí)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1鹵牛肉腐敗菌的鑒定結(jié)果

如圖1所示，利用 16SrDNA 技術(shù)共鑒定得到的3株（ A～C） 鹵牛肉源腐敗菌，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）枯草芽孢桿菌（Bacillussubti-lis）和溶酪大球菌（Macrococcuscaseolyticus）.研究表明，德州扒雞的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腸桿菌科和假單胞菌科細(xì)菌[18]，醬鹵鴨脖的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為厚壁菌門和芽孢桿菌屬[19]，可見，引起肉類腐敗的微生物主要為假單胞菌屬和芽孢桿菌屬.

2.2抑菌劑的抑菌作用

2.2.1 抑菌圈

ε-PL、Nisin、殼聚糖、溶菌酶、乳酸鈉、肉桂酸鉀、茶多酚7種抑菌劑對(duì)鹵牛肉腐敗菌的抑菌效果如表3所示. 對(duì)鹵牛肉源假單胞菌、枯草芽孢桿菌和溶酪大球菌均具有顯著的抑制作用，在高濃度時(shí)（ 30mg/mL） ，抑菌圈分別為 13.6mm，15. 2mm. 14.8mm .Nisin也具有較強(qiáng)的抑菌作用，其對(duì)假單胞菌的抑菌圈高于 ，但對(duì)枯草芽孢桿菌和溶酪大球菌的抑菌圈低于 .殼聚糖、乳酸鈉對(duì)3株腐敗菌表現(xiàn)出一定抑制效果，但抑菌圈直徑小于 PL和Nisin.茶多酚在濃度為 30mg/mL 時(shí)僅對(duì)假單胞菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制效果，對(duì)溶酪大球菌無(wú)抑制效果.而溶菌酶和肉桂酸鉀在濃度高達(dá)30mg/mL 時(shí)仍未表現(xiàn)出抑菌活性（未列出）.故選擇抑菌效果較好的 、Nisin、殼聚糖和乳酸鈉4種抑菌劑用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.2 抑菌劑的MIC、SMIC及FICI

εe-PL，Nisin 、殼聚糖和乳酸鈉4種抑菌劑對(duì)鹵牛肉腐敗菌的MIC見表4所示. e^-PL 對(duì)鹵牛肉源假單胞菌、枯草芽孢桿菌和溶酪大球菌的MIC分別為64μg/mL，128μg/mL，128μg/mL. 許超群等[20]發(fā)現(xiàn)， 對(duì)蠟樣芽孢桿菌的MIC為 100μg/mL ，與本研究結(jié)果相近.Nisin對(duì)3株菌的MIC分別為2048μg/mL.1024μg/mL.8192μg/mL. 殼聚糖對(duì)3株菌的MIC分別為 2048μg/mL，1024μg/mL， 號(hào)1024μg/mL ，抑菌效果優(yōu)于Nisin，這與抑菌圈的結(jié)果存在一定差異，可能是檢測(cè)方法的不同造成的.乳酸鈉對(duì)溶酪大球菌的MIC為 ，在實(shí)驗(yàn)最高濃度 8192μg/mL 時(shí)仍不能完全抑制假單胞菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖.

進(jìn)一步利用“棋盤法\"分析了 Π_E^-PL 與其他抑菌劑間的協(xié)同抑菌活性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Π_E^-PL 與Nisin聯(lián)用對(duì)假單胞菌和溶酪大球菌具有較好的協(xié)同抑菌作用，F(xiàn)ICI分別為0.375和0.312；對(duì)枯草芽孢桿菌具有相加作用，F(xiàn)ICI為 與殼聚糖聯(lián)用對(duì)枯草芽孢桿菌具有協(xié)同抑菌作用，F(xiàn)ICI為0.5；對(duì)假單胞菌具有相加作用，F(xiàn)ICI為 與乳酸鈉對(duì)溶酪大球菌具有較好的協(xié)同抑菌作用，F(xiàn)ICI為0.375，但對(duì)假單胞菌具有拮抗作用.

2.2.3 ε_e^-PL 與Nisin聯(lián)用對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)曲線的 影響

基于協(xié)同作用的研究結(jié)果，以ε-PL/Nisin作協(xié)同組合為代表，分析其對(duì)鹵牛肉源假單胞菌生長(zhǎng)曲線的協(xié)同影響.如圖2所示，對(duì)照組菌體生長(zhǎng)迅速，在培養(yǎng) ^12h 后，最終菌體密度為0.569.經(jīng) 或1/8MICNisin單獨(dú)處理，菌體的生長(zhǎng)受到輕微抑制，但總體生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組相似，菌體終密度分別為0.496和0.551.當(dāng) 1/4MIC 與1/8MICNisin聯(lián)用處理時(shí)，在測(cè)定的 12h 內(nèi)菌體吸光度基本保持不變，即 與Nisin聯(lián)合使用在 1SMIC（1/4MICε-PL+1/8MICNi sin）時(shí)可完全抑制假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖，表明二者具有良好的協(xié)同作用，與SMIC測(cè)定結(jié)果一致.

膜電勢(shì)的變化可以判斷細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化，是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)之一. 、Nisin單獨(dú)及聯(lián)用均對(duì)假單胞菌膜電勢(shì)產(chǎn)生顯著影響.如圖3所示，經(jīng) Nisin單獨(dú)處理后，相比對(duì)照組，假單胞菌細(xì)胞膜的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別降低了 15.18% 和 8.67% ，而經(jīng)二者聯(lián)合處理（1SMIC）后，相對(duì)熒光強(qiáng)度降低了44.88% ，高于二者單獨(dú)作用之和.熒光強(qiáng)度的顯著降低，表明假單胞菌細(xì)胞膜發(fā)生了超極化[21].超極化是典型的膜損傷類型之一，可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性升高，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外泄和菌體代謝功能紊亂.可見， Π_E^-PL 與Nisin可以共同作用于假單胞菌細(xì)胞膜，改變其通透性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)協(xié)同抑菌作用.

細(xì)菌核酸與蛋白質(zhì)的胞外泄漏量是指示細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo). Π_E^-PL 與Nisin單獨(dú)及聯(lián)合處理后假單胞菌核酸及蛋白質(zhì)的泄漏量分別如圖4、圖5所示.對(duì)照組吸光度在 ⁶h 內(nèi)基本保持不變，表明對(duì)照組菌體細(xì)胞膜完整，未發(fā)生胞內(nèi)大分子泄漏.經(jīng) 或1/8MICNisin單獨(dú)處理后，吸光度略有增大，但不顯著；而經(jīng) Π_E^-PL 與Nisin聯(lián)合處理后吸光值明顯升高，處理 ⁶h 后，相比對(duì)照組， OD_260nm 增加了 增加了0.128，增加量遠(yuǎn)超二者單獨(dú)作用之和.可見， 與Ni-sin聯(lián)合作用可顯著破壞假單胞菌細(xì)胞質(zhì)膜的完整性，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)大量泄漏，導(dǎo)致代謝阻滯和菌體死亡.

2.3復(fù)配保鮮劑的配方優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)

根據(jù)抑菌作用的分析結(jié)果，選擇 、Nisin和殼聚糖作為復(fù)配保鮮劑的3個(gè)組分.同時(shí)，鑒于鹵牛肉也會(huì)受到霉菌、酵母等真菌的污染，故增加具有顯著抗菌活性的納他霉素[22]作為復(fù)配保鮮劑第四組分，用于正交優(yōu)化試驗(yàn).

正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果見表5所示，從極差分析的結(jié)果可知，各因素影響的主次順序?yàn)?Nisin（B）gt; εe-PL（A）gt; 納他霉素 （D）gt; 殼聚糖（C），即Nisin對(duì)鹵牛肉菌落總數(shù)的影響最大， 次之，納他霉素和殼聚糖的影響較小. 在復(fù)配保鮮劑中的添加量高于Nisin，但其對(duì)菌落總數(shù)的影響卻低于Nisin.這可能是由于 是聚陽(yáng)離子多肽，易通過(guò)靜電作用、疏水作用與鹵牛肉中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合[12]，進(jìn)而導(dǎo)致有效濃度的降低和抑菌保鮮作用的減弱.

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，選取抑菌保鮮效果最優(yōu)的水平組為 A₃B₁C₃D₁ ，即復(fù)配保鮮劑的最優(yōu)配方為：ε-PL，0.162g/100mL;Nisin，0.050g/100mL ；殼聚糖， 0.030g/100mL ；納他霉素， 0.004g/100mL

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)獲得的最佳保鮮劑配方下對(duì)鹵牛肉進(jìn)行保鮮處理，即首先配置保鮮液，其中 為0.162g/100mL 、Nisin為 0.050g/100mL 殼聚糖為 0.030g/100mL 、納他霉素為 0.004g/100mL 進(jìn)而將鹵牛肉在保鮮液中浸泡 3min ，撈出瀝干后，于 4^°C 冰箱貯藏7d，分析菌落總數(shù).結(jié)果顯示，鹵牛肉的菌落總數(shù)分別為 4.990log_?4.952log_? 次測(cè)定的結(jié)果與正交試驗(yàn)第7組菌落總數(shù) 相近，該組為正交試驗(yàn)中菌落總數(shù)最小的一組，證明了所得最佳保鮮劑配方的合理性.3次測(cè)定的平均值為4.974logCFU/g.

菌落總數(shù)是評(píng)價(jià)鹵牛肉是否腐敗變質(zhì)重要指標(biāo)之一.鹵牛肉經(jīng)最優(yōu)復(fù)配保鮮劑處理后，在 4C 冰箱貯藏7d后的菌落總數(shù)為 4.974logCFU/g 0而經(jīng)無(wú)菌水（對(duì)照組）和 0.75% 山梨酸鉀（陽(yáng)性組）處理后的菌落總數(shù)分別為 8.830log.6.220log 根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)熟肉制品》規(guī)定，菌落總數(shù)最高安全限量值為 5.0logCFU/g 無(wú)菌水和山梨酸鉀處理組在第7d時(shí)已大幅超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而復(fù)配保鮮劑組的鹵牛肉菌落總數(shù)仍然符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，即經(jīng)復(fù)配抑菌劑處理的鹵牛肉在 4^°C 貯藏的貨架期 ?7d ：

2.3.3 鹵牛肉感官評(píng)價(jià)

感官品質(zhì)是評(píng)價(jià)鹵牛肉食品品質(zhì)的重要指標(biāo).如圖6所示，在貯藏7d后，無(wú)菌水組（對(duì)照組）鹵牛肉的感官品質(zhì)較差，各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)分值均低于3分，色澤明顯變暗、有哈喇味或酸敗等刺激性氣味，組織結(jié)構(gòu)松散，整體可接受性差.山梨酸鉀組（陽(yáng)性組）的鹵牛肉色澤稍暗，鹵牛肉特有的香味變淡或者消失，但無(wú)異味產(chǎn)生，組織結(jié)構(gòu)略微松散，具有一定可接受度，各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)分值在6分左右，但由于其菌落總數(shù)已超出國(guó)標(biāo)限量，已不可食用.而復(fù)配保鮮劑組鹵牛肉色澤、氣味、組織狀態(tài)評(píng)分均較高，整體可接受度高達(dá)8.6分.可見，該復(fù)配保鮮劑可以較好地保留鹵牛肉色澤、氣味，維持鹵牛肉的組織結(jié)構(gòu)，保持牛肉良好的感官品質(zhì).

3結(jié)論

鹵牛肉中的特征腐敗菌有假單胞菌、枯草芽孢桿菌和溶酪大球菌. 、Nisin、殼聚糖和乳酸鈉對(duì)鹵牛肉源腐敗菌均有不同程度的抑制作用，其中Π_E^-PL 與Nisin、殼聚糖具有較好的協(xié)同抑菌作用. PL與Nisin聯(lián)用，可以有效破壞腐敗菌細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜超極化，胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)大量外泄.以 、Nisin、殼聚糖為抑菌劑，再輔以納他霉素為抗真菌劑，通過(guò)正交試驗(yàn)得出復(fù)配保鮮劑的最佳配方為： 、Nisin：0.050 g/100 mL、殼聚糖： 0.030g/100mL 、納他霉素： ：0.004g/100mL ：該復(fù)配保鮮劑可使托盤包裝的鹵牛肉在 4C 條件下的貨架期延長(zhǎng)至7d以上，且保持良好的感官品質(zhì).

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