絲素蛋白摻雜對多糖基可注射自愈合水凝膠性能的影響

CHEN Yong-mei1，YUANWen-jin1，YANG Zhi-xuan1，YANG Kuan1，PEI Wen-kai1 ， ZHANG Qi-qing2

（1.College of Bioresources Chemical and Materials Engineering，National Demonstration Center for Experimental Light Chemistry Engineering Education，Shaanxi University of Science amp; Technology，Xi'an 710021， China；2.Institute of Biomedical Engineering，Chinese Academy of Medical Sciences amp;. Peking Union Medical College，Tianjin 300192，China）

Abstract：Dynamic hydrogel with the integrating properties of injectability，self-healing and adhesion was prepared by doping silk fibroin into polysaccharides based dynamic hydrogel， through the synergistic effect of multiple reversible bonds （imine bond，hydrogen bond，electrostatic interaction）.The effects of silk fibroin content on the properties of dynamic hydrogel，such as rheology，self-healing，adhesion，biodegradation and biocompatibility，were investigated. Doping suitable amount of silk fibroin can enhance the mechanical properties and delay degradation rate of the dynamic hydrogel，while maintain excellent self-healing and injectable properties.The dynamic hydrogel loading 2.5 wt% silk fibroin exhibited the maximun mechanical properties （ 1650Pa storage modulus） and degradation performance （ 50% in two weeks），as well as good adhesion and biocompatibility.

Key words： polysaccharide hydrogel; silk fibroin;injectability；self-healing；adhesion

0 引言

隨著生物醫學領域的發展，對高分子水凝膠材料的綜合性能提出了更高的要求，促進了新型智能醫用水凝膠的發展[1-3.作為一類典型的新一代生物醫用智能水凝膠材料，動態水凝膠因同時具有可注射、自愈合、自適應等多種功能而受到了廣泛關注[4，5].傳統可注射水凝膠力學性能低、易于受損，影響其結構完整性和功能穩定性[67].將自愈合性能賦予可注射水凝膠，設計制備同時具有可注射和自愈合性能的水凝膠材料是解決傳統可注射水凝膠受損后難以回復其結構和功能等瓶頸問題的有效途徑[8，9].水凝膠自愈合的機理是其三維網絡結構由動態鍵交聯而成，包括動態共價鍵（如亞胺鍵、酰腺鍵、硼酸酯鍵、二硫鍵等）和非共價鍵（如氫鍵、結晶、主客體化學、疏水和多重分子間作用等）[10-12].高分子三維網絡結構中的動態鍵具有可逆性，鍵的斷裂和形成可以達到熱力學平衡，在損傷處多次反應交聯，為水凝膠自愈合提供了條件[13.14].基于多糖的可注射自愈合水凝膠具有優異的生物相容性、生物降解性以及獨特的細胞外基質相似性等優勢，是近年來備受關注的一類智能醫用柔性材料[15，16].但是，多糖基可注射自愈合水凝膠力學性能較差，在應用過程中易于受損，限制了在生物醫學領域中的應用.水凝膠的動態性能與高力學性能此消彼長，難以同時兼得[17].因此，提高自愈合可注射水凝膠的力學性能具有挑戰性.

絲素蛋白（SilkFibroin，SF）又名蠶絲蛋白，是從天然高分子材料蠶絲中提取出來的一種結構型蛋白質，含有18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸約占 80% 以上[18，19].絲素蛋白具有優異的生物相容性和力學性能、可降解、降解時間可控、且降解產物安全性高等特性，可制成多種形態的醫療產品，廣泛應用于生物醫用材料領域[20-22].

本工作以殼聚糖和魔芋葡甘聚糖為多糖原料，通過沒食子酸和高碘酸鈉分別改性殼聚糖和魔芋葡甘聚糖，制備得到沒食子酸-殼聚糖（Gallicacid-Chitosan，Ga-CS）和氧化魔芋葡甘聚糖（Oxidizedkonjacglucomannan，OKGM），并將絲素蛋白摻雜于動態交聯網絡結構中，制備得到具有粘附性能的沒食子酸-殼聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖/絲素蛋白（Ga-CS/OKGM/SF）動態水凝膠.研究了絲素蛋白摻雜對多糖基可注射自愈合水凝膠力學性能、自愈合性能、降解性能、粘附性能和生物相容性的影響.該研究有望解決多糖基自愈合水凝膠存在的力學性能不足且降解速率較快等問題，為具有生物粘附性能的絲素蛋白動態復合水凝膠的研究提供了思路.

1實驗部分

1. 1 實驗原料及儀器

1. 1.1 實驗原料

魔芋葡甘聚糖（AR， 99% ），國藥集團化學試劑公司；脫乙酰殼聚糖（粘度 ，上海阿拉丁試劑有限公司；高碘酸鈉（AR， 99% ），沒食子酸（AR， 99% ），絲素蛋白（AR， 99% ），N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS，AR，99% ），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodi-imide，EDC ? HCl，AR， 99% ），上海麥克林試劑有限公司;Dulbecco'smodified Eagle's Medium培養基（DMEM），康寧公司.

1. 1.2 實驗儀器

真空冷凍干燥機（Xinyi-10N），寧波新藝超聲設備有限公司；電熱鼓風干燥箱（WGL-45B），南京伊若達儀器設備公司；電子萬能材料試驗機（CMT4304），深圳市三思試驗儀器有限公司；立式自動蒸汽滅菌器（LDZH-100KBS），上海申安醫療器械廠；細胞培養箱（BC-J250），上海博訊醫療生物儀器公司；傅里葉紅外光譜儀（Vertex7O），德國Bruker公司；掃描電子顯微鏡（VEGA3SBH），美國捷克TESCAN.

1.2 實驗方法

1.2.1 Ga-CS的制備

稱取 加人 80mL0.5% 醋酸溶液，充分攪拌至完全溶解.另稱取 1.03g Ga充分溶解于20mL 無水乙醇中，再稱取 1.15gEDC?HCl 和0.69g NHS加人至上述溶液中，磁力攪拌 0.5h 充分反應.將混合溶液加入至上述殼聚糖溶液中，遮光磁力攪拌反應 ⁶h .將反應后的溶液轉移至透析袋 （8000Da） ，在去離子水中透析7天后，冷凍干燥，制得Ga-CS粉末.

1.2.2 OKGM的制備

將 1.0gKGM 均勻溶解于 90mL 去離子水中，另稱取 1.2g 高碘酸鈉完全溶解于 10mL 去離子水中，將上述溶液混合，在室溫條件下遮光攪拌⁶h 后，加入乙二醇 （1.5mL 繼續攪拌 ¹h 終止反應.將反應后的溶液轉移至透析袋 （8000～14000 Da），在去離子水中透析7天后，冷凍干燥，制備得到OKGM.

1.2.3 Ga-CS/OKGM/SF復合水凝膠的制備

稱取 0.18gGa^-CS 溶解于 6mL 磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS， pH=7.4 中，再稱取 0.03g OKGM溶解于 1mL PBS緩沖液中， Ga-CS 以及OKGM溶液質量濃度均為 .將上述溶液按一定比例混合，加人一定量SF，渦旋 1min 得到Ga-CS/OKGM/SF 復合水凝膠.

1.3表征與測試

1.3.1 形貌表征

通過掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMi-croscope，SEM分析Ga-CS/OKGM/SF水凝膠的微觀結構.將摻雜不同重量絲素蛋白的 Ga-CS/ OKGM/SF水凝膠冷凍干燥，切片后用導電膠粘附于樣品臺上并進行噴金處理，在 7kV 加速電壓下進行觀察分析.

1.3.2 結構表征

通過X-射線衍射光譜（X-rayDiffraction，XRD）對CS、Ga-CS、KGM、OKGM、SF、Ga-CS/OKGM和Ga-CS/OKGM/SF水凝膠進行表征.將冷凍干燥后的樣品置于 40kV/40mA 的單色輻射源下進行XRD 測試，以 10^°/min 的速度完成掃描并收集數據.

對CS、Ga-CS、KGM、OKGM、Ga-CS/OKGM和Ga-CS/OKGM/SF水凝膠進行紅外光譜表征.將烘干或者冷凍干燥后的樣品分別與KBr粉末研磨均勻后進行壓片，采用傅里葉紅外光譜儀測試并收集 4000～400cm^-1 的紅外光譜.

1.3.3 水凝膠的凝膠化時間

采用小瓶倒置法，測定水凝膠的凝膠化時間.稱量 0.18gGa-CS 置于小瓶中并加入 6mL PBS緩沖液溶解，再稱取 0.03gOKGM 置于另一個小瓶中并加入 1mL PBS緩沖液溶解.充分溶解后，將OKGM溶液以及不同配比的絲素蛋白溶液一同加入裝有 Ga-CS 溶液的小瓶中并且開始計時.當小瓶內溶液不再呈現流動態時，即已經發生凝膠化行為.

1.3.4 水凝膠的流變學表征

首先，對水凝膠樣品（直徑 20mm 進行頻率掃描測試，將應變固定為 γ=1.0% ，設置角頻率從 0.1rad?s^-1 逐漸增加至 100rad?s^-1 .其次，測試水凝膠網絡結構發生破壞的臨界點，固定角頻率為 ω=1 rad ?s^-1 ，設置應變幅度從 γ=1% 變為γ=1000% .最后固定角頻率為 1rad?s^-1 ，進行水凝膠的交替振幅實驗，在小形變 γ=1.0% 維持180s ，隨后升至大應變 γ=300% 維持 180s ，如此循環三次以測試水凝膠的自愈合特性.

1.3.5 水凝膠的降解性能

稱取約 100mg 水凝膠 （M₀ ）放置于離心管中，加人PBS緩沖溶液使水凝膠完全浸人溶液中，在37° 水浴中孵育，每天更換一次新鮮PBS溶液.在預設的時間間隔內，完全去除PBS，稱取剩余水凝膠的質量 （M_t ），根據公式（1）計算每個時間點的相對剩余凝膠質量分數 M

M=M_t/M₀×100%

1.3.6 水凝膠的粘附性能

采用膠原膜作為組織模型，通過搭接剪切試驗測試水凝膠的體外粘附性能.首先，將 Ga-CS溶液（ （6mL） 和一定量SF溶液混合后涂抹于膠原膜 （2cm 寬）表面，將 3‰ OKGM 溶液（ 1mL 涂抹于另一塊膠原膜（規格同上）表面，然后，將兩塊膠原膜按壓在一起，使沒食子酸-殼聚糖和氧化魔芋葡甘聚糖交聯形成水凝膠，樣品置于200g 重量下室溫保存 5min ，最后進行搭接剪切強度測試.

1.3.7 水凝膠的血液相容性

取抗凝大鼠血液 2mL ，分別加入 2mL 不同質量水凝膠提取物（濃度梯度分別為 50g/mL 、100g/mL，500g/mL，1000g/mL） .同時取抗凝血液 2mL 與生理鹽水 2mL 混合液作為陰性對照，2mL 抗凝血液與 2mL 去離子水混合液為陽性對照.各實驗組用玻璃棒稍加混合，置于 37° 恒溫水浴中 1～3h ，取出靜置.分別吸取上清液 2mL ，采用紫外分光光度計檢測各上清液的吸光度，并根據公式（2）計算提取液濃度對溶血率（HR）的影響： （2）

式（2）中： OD_??? 為水凝膠提取物與血液孵育后的吸光度， OD_H* 為陰性對照的吸光度， OD_H× 為陽性對照吸光度.

1.3.8 水凝膠的細胞相容性

將裝有NIH3T3細胞的冷凍瓶從液氮中取出，放入 37° 水浴中輕輕搖動，迅速解凍.將解凍后的細胞懸液吸人含有 10mL 培養基的離心管中，以1O0Orpm離心2min.去除上清后，用DMEM培養基重新懸浮細胞，接種于 100mL 培養瓶中.將培養瓶置于 37C，5% （ CO₂ 的培養箱中，每2天更換一次培養基.當細胞融合率達到90% 時，傳代培養細胞.以 5～7 代的細胞為實驗對象，評價水凝膠的細胞相容性.

將NIH3T3細胞接種于96孔板中，培養 24h 待細胞全貼壁生長后，吸出培養基，替換為含水凝膠提取物的培養基.在特定的培養時間 24h 和 ^48h 取出，在每個小孔中加入 10% CCK-8溶液，用錫紙包裹避光孵育 2～3h .反應顯色后，用酶標儀測量 450nm 波長處的吸光度OD.根據公式（3）計算NIH3T3細胞存活率CV：

式（3）中： 為水凝膠提取液培養細胞的 吸光度， OD_X^∣H1q 為培養基培養細胞的吸光度， 為空白孔板的吸光度.對于每組樣本，平行檢測三 組的平均值.

2 結果與討論

2.1 制備Ga-CS/OKGM/SF自愈合可注射水 凝膠

絲素蛋白具有良好的機械性能（柔韌性、抗拉伸強度）和理化性質（生物相容性、生物降解性），是一種優異的生物材料.為了進一步提高 Ga-CS/ OKGM水凝膠的力學性能，降低降解速率，在GaCS/OKGM水凝膠體系中摻雜絲素蛋白，制備沒食子酸-殼聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖/絲素蛋白（Ga-CS/OKGM/SF）復合水凝膠.將溶解了沒食子酸-殼聚糖和氧化魔芋葡甘聚糖的PBS緩沖液與一定量的絲素蛋白混合，充分交聯后獲得復合水凝膠，如圖1所示.通過改變Ga-CS與OKGM溶液的比例和絲素蛋白的含量，分別制備不同組分含量的Ga-CS/OKGM/SF水凝膠.

通過紅外光譜儀分析了CS、Ga-CS、KGM、OKGM大分子以及冷凍干燥Ga-CS/OKGM和Ga-CS/OKGM/SF水凝膠的化學結構.如圖2（a）所示，Ga-CS和CS在 3300～3500cm^-1 處均有較寬且較弱的吸收峰，此為 O-H 的伸縮振動所致，歸因于分子鏈上的羥基.Ga-CS與CS相比，在1632cm^-1 和 1532cm^-1 處分別出現了兩個新的吸收峰.這是由于酰胺鍵中羰基（ C=0）， 的伸縮振動產生的酰胺I帶 （1632cm^-1 ）和N-H彎曲振動引起的酰胺I帶 （1532cm^-1 ）吸收峰造成的[23].此外，在 900～650cm^-1 處觀察到新的吸收峰，歸因于沒食子酸苯環中C-H的彎曲振動，說明Ga被成功接枝于CS大分子鏈上.

圖2（b）顯示KGM和OKGM在 處均出現了 C=O 的雙鍵振動峰，歸因于KGM中存在的少量乙酰基團，而在OKGM中是由于氧化物中出現了新的醛基引起的.在 3 000～ 3500cm^-1 的伸縮振動峰中，OKGM的峰遠低于KGM的峰，可能是由于KGM氧化過程中消耗了羥基，導致峰變低.上述結果表明成功制備得到OKGM.

此外，在Ga-CS/OKGM/SF 與 Ga-CS/OKGM 水凝膠的紅外光譜圖中均未觀察到OKGM在 1726cm^-1 （20處醛基（ C=O 的雙鍵振動峰，如圖2（c）所示.該表征結果證明，OKGM大分子中的醛基與 Ga-CS 上的氨基發生希夫堿反應，形成了亞胺鍵交聯多糖大分子形成動態水凝膠.摻雜絲素蛋白后，水凝膠在 3500～3000cm^-1 處的吸收峰強度降低，主要歸因于絲素蛋白與Ga-CS和OKGM之間形成氫鍵，消耗大分子鏈中的羥基，導致峰強度降低.上述結果證明了絲素蛋白摻雜于水凝膠網絡內部.

2.2絲素蛋白摻雜對水凝膠微觀結構的影響

首先，采用X-射線衍射光譜表征了CS、 Ga-CS 和OKGM大分子的晶體結構.圖3（a）顯示CS在20為 11.28^° 和20.78°兩處具有衍射峰，這是由于殼聚糖的氨基、羥基分子間氫鍵形成的結晶引起的[24].但是在Ga-CS中沒有觀察到 2θ=11.28^° 處的衍射峰，該現象可能是沒食子酸上的羧基與殼聚糖大分子鏈上的氨基發生反應，破壞了殼聚糖大分子鏈上分子間氫鍵的相互作用，導致對應的結晶峰消失造成的[25].KGM和OKGM的XRD圖譜相似，但衍射峰略有不同，并顯示出無定形特征，

從圖3（b）中可以明顯觀察到，KGM樣品在 2θ =20.36^° 處有較寬的衍射峰，在 37.8^° 左右有一個肩峰，近似于無定型的 α 光譜形式[26].與KGM相比，OKGM的X射線衍射峰面積減小， 37.8^° 左右的肩峰近乎消失.該結果表明，氧化處理影響了KGM的聚集結構和形貌，可能由于OKGM中羧基引起的靜電排斥阻礙了分子內氫鍵，導致微觀結構發生變化.

圖3（c）顯示絲素蛋白僅在 2θ=20.3^° 處出現衍射峰，說明其主要是以無定形結構存在，可能存在部分SilkI結晶[27].如圖3（d）所示，通過對比Ga-CS/OKGM和Ga-CS/OKGM/SF水凝膠的XRD譜圖發現，兩種水凝膠的XRD譜圖沒有明顯區別，這可能是因為絲素蛋白結晶結構在 2θ=20.3^° 處典型的β-折疊構象衍射峰，與 Ga-CS/OKGM 水凝膠在 處的衍射峰發生重疊造成的.同時，該表征結果表明摻雜絲素蛋白未對Ga-CS/OKGM水凝膠的微觀結構造成明顯的影響.

進一步通過掃描電子顯微鏡表征分析了冷凍干燥Ga-CS/OKGM/SF （ 1wt%～10wt%） 水凝膠的微觀結構，研究摻雜絲素蛋白含量對水凝膠微觀結構和形貌特征的影響.從SEM中可以清晰地觀察到與Ga-CS/OKGM水凝膠類似， Ga-CS/ OKGM/SF水凝膠內部具有微米級的孔道結構，并且孔道之間相互貫穿連通，這種微結構有利于物質的傳輸，從而便于為細胞提供營養物質運輸的通道.

此外，摻雜 和 2.5wt% 重量的復合水凝膠Ga-CS/OKGM/SF（ 1wt%? ）和Ga-CS/OKGM/SF 2.5wt% ）水凝膠孔徑與原始Ga-CS/OKGM水凝膠相比變化不明顯.但隨著絲素蛋白含量繼續增加至 和 ，Ga-CS/OKGM/SF （ ）和Ga-CS/OKGM/SF （ 水凝膠的孔徑開始減小，如圖4所示.造成這種現象的原因可能是大量絲素蛋白分子填充于水凝膠的大分子網絡結構中，并與 Ga^-CS 和OKGM大分子間產生氫鍵相互作用，導致微觀結構更加緊密.

2.3絲素蛋白摻雜對凝膠化時間的影響

通過小瓶倒置法測試摻雜不同含量絲素蛋白對水凝膠凝膠化行為的影響.如圖5所示，隨著絲素蛋白含量的增加，凝膠化時間逐漸增加.當絲素蛋白含量為 時，凝膠化時間最短（約為 49s） ，但是，當絲素蛋白含量增加至 時，完全凝膠化所需時間延長至約為277s.表明加人絲素蛋白后，水凝膠的成膠時間明顯增加，可能是由于過量摻雜絲素蛋白阻礙了Ga-CS與OKGM大分子鏈之間的相互作用造成的.雖然凝膠化時間隨絲素蛋白含量有所增加，但均可在 5min 內形成凝膠，仍滿足快速成膠的需求.

通過流變儀測定了Ga-CS/OKGM/SF水凝膠的力學性能、網絡結構破裂臨界點以及自愈合特性，以探討絲素蛋白摻雜對水凝膠力學性能以及自愈合性能的影響，結果如圖6所示.通過振蕩掃描頻率實驗測試，在 0.1～100 rad s^-1 頻率掃描范圍內，摻雜適量絲素蛋白的 wt%.5wt% 水凝膠的儲能模量 （G^′） 均高于損耗模量 （G^′′） （如圖6（a）所示），結果表明水凝膠中建立了穩定的網絡交聯結構，同時也證明了加入絲素蛋白后，仍然能夠發生凝膠化行為.同時，當摻雜 絲素蛋白時，Ga-CS/OKGM/SF（ 1wt%） 水凝膠的G^′ 達到 1 100Pa ，當摻雜絲素蛋白含量達到2.5wt% 時，Ga-CS/OKGM/SF 2.5wt% 水凝膠的 G^′ 提高至 1650Pa ，顯著高于未添加絲素蛋白的GaCS/OKGM水凝膠（ （650Pa） .但是，隨著絲素蛋白含量繼續增加至5 wt% 時，Ga-CS/OKGM/SF1 水凝膠的力學性能反而下降至 450Pa 上述流變測試結果表明，加入適量的絲素蛋白可以顯著提升水凝膠的力學性能，但是摻雜量過高可導致水凝膠力學性能下降.由于絲素蛋白具備一定力學性能，并且其大分子鏈上的氨基（一 ?NH₂ ）和羥基（一OH）與Ga-CS大分子鏈上的多酚羥基、OKGM大分子鏈上的羥基（一OH）之間形成氫鍵，以及Ga-CS和絲素蛋白中帶正電荷的氨基（一 ?NH³⁺ ）與OKGM大分子鏈上帶負電荷的乙酰基（一 CH₃ CO^- ）之間的靜電相互作用形成的離子鍵等非共價鍵相互作用，導致摻雜適量絲素蛋白可以有效提升水凝膠力學性能.但是，高含量的絲素蛋白阻礙Ga-CS和OKGM大分子鏈之間的相互作用，在水凝膠內部形成缺陷，影響大分子鏈網絡的交聯效率，從而導致力學性能下降.因此，當摻雜 2.5wt% 絲素蛋白時，最有利于提高水凝膠的力學性能.

采用力學性能最優的Ga-CS/OKGM/SF（2.5wt%） ）樣品進一步分析水凝膠的自愈合性能.通過改變施加應力分析破壞水凝膠的臨界應變.發現當加載應變增加至 220% 時，水凝膠的 G^′ 與 G^′′ 相交，表明大分子鏈之間的交聯網絡結構被破壞.隨著應力的繼續增大，水凝膠的儲能模量迅速降低至約 30Pa ，說明水凝膠結構被破壞（如圖6（b）所示）.為了進一步定量地證明該水凝膠具有遭到破壞后重新恢復力學性能的自愈合特性，對從中間切成兩半再愈合后的Ga-CS/OKGM/SF 水凝膠樣品進行了流變學循環交替應變測試.圖6（c）表明從中間切斷并自愈合后水凝膠樣品的儲能模量依然可以達到 1650Pa ，與原始水凝膠樣品沒有顯著的差別.循環交替應變測試顯示，在低應變 γ=1% 時，水凝膠表現出典型的粘彈性 （G^′gt;G^′′） ，然而，當施加大應變 （γ=300%） 時，儲能模量迅速從 1650Pa 降低至 230Pa ，表明在大應變條件下水凝膠的網絡結構遭受破壞（如圖6（d）所示）.當施加的應變從 γ= 300% 至 γ=1% 交替變化時，水凝膠的 G^′ 和 G^′′ 在大小應變交替下均能夠快速回復至原始數值.上述實驗結果表明，當絲素蛋白摻雜量為 時，水凝膠仍然具有優異的自愈合性能，其網絡結構在遭受循環加載應變破壞之后仍然可以重新恢復.

2.5 不同比例大分子對降解性能的影響

水凝膠的降解性能對于其在體內應用前景十分重要，因為合適的生物降解性能有利于材料在體內發揮作用后降解，避免通過手術取出而造成的二次損傷.在含有不同比例大分子的Ga-CS/OKGM水凝膠中摻雜 2.5wt% 含量的絲素蛋白，測定Ga-CS（2、4、6、8、10）/OKGM/SF （2.5wt% 水凝膠在PBS緩沖液 （pH=7.4） 中不同時間點的重量變化并評價降解性能。

如圖7所示，隨著降解時間的延長，所有水凝膠因不斷被降解呈現質量減少的趨勢.最初降解速率較快，隨后降解速率開始減緩，第一周時Ga-CS6/OKGM/SF （2.5wt%） 水凝膠的質量損失為 40% ， Ga? -CS8/OKGM/SF （ 2.5wt% 水凝膠降解了 44% ，而 Ga-CS10/OKGM/SF （ 2.5wt% ）和 Ga-CS4/OKGM/SF （2.5wt%） 的降解率均在55% 左右，降解最快的是Ga-CS2/OKGM/SF（2.5% ），已降解了 64% .摻雜絲素蛋白后， Ga^- CS/OKGM/SF水凝膠的降解速率顯著低于Ga-CS/OKGM水凝膠.由于絲素蛋白大分子鏈上的氨基 ）和羥基（一OH）與 Ga-CS 大分子鏈上的多酚羥基、OKGM大分子鏈上的羥基（一OH）之間形成氫鍵，以及Ga-CS和絲素蛋白中帶正電荷的氨基（- -NH³⁺ ）與OKGM大分子鏈上帶負電荷的乙酰基（ -CH₃CO^- ）之間的靜電相互作用形成的離子鍵等非共價鍵相互作用增強網絡交聯結構，達到了延緩降解的效果.其中Ga-CS6/OKGM/SF（ 2.5% 水凝膠因交聯程度最高，降解的重量最少，有望在體內較長時間發揮作用.

2.6摻雜絲素蛋白對粘附性能的影響

沒食子酸-殼聚糖大分子鏈上類多酚羥基易于與多種材料之間產生氫鍵相互作用，賦予水凝膠一定的粘附性能.為了探究加入絲素蛋白后對水凝膠粘附性能的影響，定性檢測了Ga-CS/OKGM/SF水凝膠與不同物體的粘附性能.如圖8所示，GaCS/OKGM/SF水凝膠可以穩定地粘附于手套、食指、膠原蛋白膜、橡膠等物品，表明該水凝膠對不同材質物品均具有一定的粘附性能.

此外，以力學性能最優，降解性能最慢的GaCS6/OKGM/SF（2.5wt%）水凝膠為例，進一步通過搭接剪切強度定量測定了摻雜不同絲素蛋白含量水凝膠的粘附性能，分析摻雜絲素蛋白對水凝膠粘附性能的影響.當絲素蛋白含量為 1wt% 和2.5wt% 時，Ga-CS2/OKGM/SF水凝膠的搭接剪切強度均能夠達到 以上，與Ga-CS/OKGM水凝膠的粘附性能無顯著差別.但是隨著絲素蛋白含量繼續增加， Ga-CS/OKGM/SF 水凝膠的粘附性能開始逐漸降低.當絲素蛋白含量增加至10wt % 時，Ga-CS/OKGM/SF（ 水凝膠的搭接剪切強度降低至 40kPa ，顯著低于Ga-CS/OKGM/SF （2.5wt%） 水凝膠（ 82kPa） （20號（如圖9（a）所示）.造成上述結果的原因可能是當摻雜過量的絲素蛋白后，其大分子鏈上的氨基（一 ?NH₂ ）和羥基（一OH）與Ga-CS上的酚羥基之間形成氫鍵相互作用，消耗了更多的酚羥基，導致粘附性能下降.

此外，選 用 同 一 塊 Ga-CS/OKGM/SF（2.5wt%） 水凝膠重復進行多次搭接剪切強度測試，分析了多次重復粘附性能（如圖9（c）所示）.第一次測定的搭接剪切強度為 85kPa ，雖然第二次（ 62kPa） 和第三次 （40kPa） ）的粘附性能均有所下降，但是仍然具有一定的粘附性（如圖9（d）所示）.該實驗結果表明 Ga-CS/OKGM/SF（2.5wt%） 水凝膠具有一定的重復粘附性能，且遭到破壞后仍然能夠保持對膠原蛋白膜的粘附效果.

2.7 生物相容性

殼聚糖、魔芋葡甘聚糖和絲素蛋白作為天然高分子材料，均具有優異的生物相容性.為了證明摻雜絲素蛋白的Ga-CS6/OKGM/SF水凝膠具有作為生物材料的潛力，通過大鼠紅細胞溶血實驗測試了其血液相容性.隨著Ga-CS6/OKGM/SF（2.5wt% ）水凝膠浸提液濃度從 0.01mg/mL 上升至1.0mg/mL 時，溶血率均低于 5% （如圖10（a）所示），表明摻雜絲素蛋白后的水凝膠具有優異的血液相容性.

此外，通過 NIH3T3 細胞培養測試分析了水凝膠的細胞相容性.將NIH3T3細胞接種至96孔板中培養，用水凝膠浸提液培養細胞，通過CCK-8方法分別檢測了培養 24h 和 ^48h 的細胞存活率.

培養 24h 的細胞存活率達到 102% ，培養 ^48h 的細胞存活率雖然有所下降，但仍然保持在 90% 以上（如圖10（c）所示），表明水凝膠對細胞沒有明顯的毒性，同時也保持了成纖維細胞的典型梭狀形態（如圖10（b）所示）.造成培養 48h 的細胞存活率有所下降的原因可能是由于孔板體積較小，培養兩天后細胞繁殖過快，導致空間、營養成分提供不足造成的.上述實驗結果表明，該水凝膠具有良好的細胞相容性，有望作為細胞治療遞送材料應用于組織工程.

3結論

本研究通過在Ga-CS/OKGM水凝膠體系中摻雜絲素蛋白，制備了具有粘附性能的 Ga-CS/ OKGM/SF動態水凝膠.Ga-CS大分子鏈上的氨基 ）與OKGM大分子鏈上的醛基（—CHO）之間通過希夫堿反應可形成動態亞胺鍵.另外，沒食子酸的多酚羥基作為優良的 H⁺ 供體與OKGM大分子鏈上的羥基（一OH）以及絲素蛋白的氨基 ）和羥基（一OH）之間形成氫鍵.此外，Ga-CS和絲素蛋白中帶正電荷的氨基（ -NH³⁺ ）與OKGM大分子鏈上帶負電荷的乙酰基（- -CH₃CO^- ）之間存在靜電相互作用.上述多重動態鍵協同作用增強了多糖基自愈合水凝膠的力學性能，延緩了降解速率，有利于拓寬水凝膠的應用范圍.

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